Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ là một trong những thách thức môi trường nghiêm trọng trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Dầu mỏ là nguồn nhiên liệu và nguyên liệu thô trọng yếu cho các ngành công nghiệp hóa dầu, sản xuất điện và giao thông vận tải. Tuy nhiên, các hoạt động thăm dò, khai thác, vận chuyển và lọc hóa dầu thường đi kèm nguy cơ xảy ra các sự cố tràn dầu. Hydrocarbon dầu mỏ chứa nhiều hợp chất độc hại, khó phân hủy sinh học, không tan trong nước, bao gồm các hợp chất có khả năng gây ung thư và độc hại thần kinh như benzen, toluen, xylen và n-hexan. Khi xâm nhập vào môi trường biển và đất liền, dầu bao phủ bề mặt, ngăn cản quá trình trao đổi oxy và năng lượng mặt trời, gây suy thoái, tổn thương và làm mất cân bằng hệ sinh thái rừng ngập mặn, rạn san hô, cỏ biển, đồng thời hủy hoại hệ sinh vật thủy sinh và đe dọa trực tiếp đến sức khỏe con người.

Trên thế giới, nhiều thảm họa tràn dầu lớn đã được ghi nhận như vụ tàu Amoco Cadiz (Pháp, 1978) làm tràn 68,7 triệu gallons dầu; sự cố rò rỉ giếng khoan Ixtoc (Mexico, 1979) với 140 triệu gallons dầu; sự cố nổ giàn khoan Deepwater Horizon (Vịnh Mexico, 2010) giải phóng khoảng 210 triệu gallons dầu; hay sự cố vỡ đường ống tại nhà máy lọc dầu La Pampilla ở Ventanilla (Peru, 2022) làm tràn khoảng 954 tấn dầu. Tại Việt Nam, thống kê của Hiệp hội các chủ hàng chở dầu quốc tế giai đoạn 2005–2014 xếp Việt Nam vào nhóm 3 quốc gia có tần suất sự cố tràn dầu cao với nhiều vụ việc điển hình: sự cố tàu Đức Cường 06 chìm tại Thanh Hóa mang theo 18 tấn dầu DO, vụ tràn 4.000 lít dầu tại phường Quảng Hưng (thành phố Thanh Hóa, 2018), và vụ chìm tàu chở dầu ĐNa 0607 tại Đà Nẵng (2021) với khoảng 4 m³ dầu DO tràn ra ngoài.

Các phương pháp xử lý dầu truyền thống như phương pháp vật lý (sử dụng phao quây, máy hút, vật liệu thấm) chỉ thu gom được phần dầu nổi và tốn kém chi phí; phương pháp hóa học (sử dụng chất phân tán, chất keo tụ) tiềm ẩn nguy cơ gây độc tính thứ cấp cho môi trường nước. Do đó, phương pháp sinh học (xử lý sinh học - bioremediation) thông qua kích thích sinh học (biostimulation) và thúc đẩy sinh học (bioaugmentation) được xem là giải pháp an toàn, triệt để và thân thiện với môi trường. Trong quá trình này, chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH - biosurfactant) đóng vai trò then chốt trong việc giảm sức căng bề mặt, gia tăng độ phân tán và tăng diện tích tiếp xúc giữa vi sinh vật phân hủy với cơ chất hydrocarbon dầu mỏ.

Khóa luận tốt nghiệp "Nghiên cứu điều kiện lên men tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy dầu" do sinh viên Lê Thị Linh thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa (Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học) và PGS. Nguyễn Văn Giang (Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam) nhằm giải quyết bài toán tối ưu hóa điều kiện công nghệ sản xuất CHĐBMSH với chi phí thấp.

Mục đích và nội dung nghiên cứu:

  • Mục đích: Nghiên cứu điều kiện lên men tổng hợp CHĐBMSH của chủng vi khuẩn Bacillus phân hủy dầu sử dụng nguồn cơ chất đơn giản với chi phí thấp nhằm ứng dụng tạo chế phẩm xử lý ô nhiễm dầu.
  • Nhiệm vụ nghiên cứu:
    1. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (nguồn carbon, nitơ, pH, nhiệt độ, nồng độ muối NaCl, tỷ lệ tiếp giống) tới quá trình sinh tổng hợp CHĐBMSH ở quy mô bình tam giác.
    2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu thông qua xác định số lượng tế bào trong quá trình lên men (trong hệ thống lên men 100 lít, dung tích làm việc 70 lít) theo thời gian.
    3. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến khả năng tổng hợp CHĐBMSH của chủng vi khuẩn nghiên cứu thông qua xác định chỉ số nhũ hóa $E_{24}$ trong quá trình lên men (trong hệ thống lên men 100 lít, dung tích làm việc 70 lít) theo thời gian.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Chủng vi khuẩn Bacillus sp. DNVK2 thuộc bộ sưu tập chủng giống vi sinh vật phân hủy dầu của Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học (chủng phân lập từ mẫu nước nhiễm dầu tại giếng khai thác dầu, mỏ Bạch Hổ, Vũng Tàu, có độ tương đồng 99% với Bacillus aquimaris).
  • Phạm vi không gian: Phòng Vi sinh vật dầu mỏ và Phòng thí nghiệm trọng điểm, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 12 năm 2021 đến tháng 6 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình nghiên cứu

CHĐBMSH là các hợp chất có cấu trúc phân tử lưỡng cực gồm phần ưa nước (hydrophilic) và phần kỵ nước (hydrophobic), có khả năng làm giảm sức căng bề mặt giữa các pha lỏng - lỏng, khí - lỏng hoặc lỏng - rắn (như giảm sức căng bề mặt của nước từ 72 mN/m xuống 35 mN/m). Về mặt hóa sinh, CHĐBMSH được phân loại thành 5 nhóm chính: glycolipid (rhamnolipid, sophorolipid), lipopeptide (surfactin do Bacillus subtilis tổng hợp), lipopolysaccharide (emulsan do Acinetobacter calcoaceticus sinh ra), phospholipid và các acid béo/lipid trung tính. Ưu điểm nổi bật của CHĐBMSH so với chất hoạt động bề mặt hóa học là độc tính thấp, khả năng phân hủy sinh học tự nhiên, và duy trì độ ổn định hoạt tính trong các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, pH và nồng độ muối.

Về công nghệ lên men, nghiên cứu ứng dụng phương pháp lên men chìm (submerged fermentation) trong môi trường dịch thể. Quá trình lên men chịu sự chi phối trực tiếp từ các thông số hóa lý bao gồm: nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hòa tan, sự hình thành bọt, nồng độ và tỷ lệ các nguồn dinh dưỡng carbon/nitơ, cùng với vận tốc quay của cánh khuấy nhằm đảm bảo sự tiếp xúc đồng đều giữa tế bào vi khuẩn và cơ chất dinh dưỡng.

Môi trường nuôi cấy và thiết bị thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng hai hệ môi trường nuôi cấy cơ bản:

Tên môi trường Thành phần hóa chất Hàm lượng (g/L)
Môi trường hiếu khí tổng số (HKTS) Cao thịt 3,0
Pepton 5,0
Môi trường khoáng $\text{NH}_4\text{NO}_3$ 2,0
$\text{KH}_2\text{PO}_4$ 1,0
$(\text{NH}_4)_2\text{HPO}_4$ 1,2
$\text{MgSO}_4$ 0,02
Glucose 1,0
$\text{NaCl}$ 20,0

Hệ thống thiết bị phục vụ nghiên cứu bao gồm: Nồi lên men tự động 100 lít (dung tích làm việc 70 lít), máy đo quang phổ Sacoman (Pháp), kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Nhật), kính hiển vi điện tử quét SEM (Viện Vật liệu), máy ly tâm Microcentrifuge (Mỹ), máy lắc ổn nhiệt Backman (Đức), bể ổn nhiệt Memmert (Đức), máy đo pH Mettler Toledo (Rumania), nồi khử trùng áp suất cao ALP (Nhật) và máy vortex Biorad (Mỹ).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  1. Đánh giá hoạt tính tạo CHĐBMSH qua chỉ số nhũ hóa ($E_{24}$): Thực hiện theo phương pháp của Abouseoud và cs. (2008). Trộn đều 1 ml dịch nuôi cấy chứa CHĐBMSH với 1 ml xylen trong ống nghiệm, lắc vortex ở tốc độ 2.000 vòng/phút trong 2 phút. Ống nghiệm được giữ cố định trong 24 giờ ở 4°C. Chỉ số $E_{24}$ (%) được xác định bằng tỷ lệ phần trăm giữa chiều cao lớp nhũ hóa và tổng chiều cao cột chất lỏng.
  2. Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn: Quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch HKTS sau 24–48 giờ nuôi ở 30°C. Đặc điểm siêu cấu trúc tế bào được chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) tại Viện Vật liệu sau khi cố định mẫu bằng glutaraldehyde 2,5%, polylysine 1%, $\text{OsO}_4$ 1% và khử nước qua thang nồng độ cồn từ 50% đến 100%.
  3. Phương pháp tối ưu hóa các yếu tố môi trường (quy mô bình tam giác): Khảo sát từng yếu tố đơn lẻ (one-factor-at-a-time) trong môi trường khoáng (lắc 180 vòng/phút, thời gian nuôi cấy 2–5 ngày):
    • Nguồn carbon (glycerol, rỉ đường, glucose, saccharose ở 2% w/v) và nồng độ glucose (1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% w/v).
    • Nguồn nitơ ($\text{KNO}_3$, $\text{NaNO}_3$, $(\text{NH}_4)_2\text{HPO}_4$, $\text{NH}_4\text{NO}_3$, $\text{NH}_4\text{Cl}$, $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$ ở 0,2% w/v) và nồng độ $\text{NH}_4\text{NO}_3$ (0,1% đến 0,6% w/v).
    • Giá trị pH ban đầu (từ 4 đến 10).
    • Nhiệt độ nuôi cấy (15, 20, 25, 30, 37, 45, 50, 55°C).
    • Nồng độ muối $\text{NaCl}$ (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6% w/v).
    • Tỷ lệ tiếp giống ban đầu (1, 2, 3, 4, 5, 6% v/v).
  4. Phương pháp lên men trong thiết bị 100 lít: Vận hành hệ thống lên men tự động 100 lít với 70 lít môi trường khoáng tối ưu. Khảo sát 3 mức tốc độ khuấy: 150, 200 và 250 vòng/phút trong thời gian 72 giờ. Lấy mẫu định kỳ 4 giờ/lần để đếm mật độ tế bào sống (CFU/ml) và đo chỉ số $E_{24}$.
  5. Tách chiết CHĐBMSH thô: Sử dụng dung môi hữu cơ ethyl acetate theo quy trình của Antonio và cs. (2015) sau khi ly tâm dịch lên men ở 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C để loại bỏ tế bào vi khuẩn.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu

Chương này làm rõ tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thực trạng ô nhiễm dầu mỏ nghiêm trọng trên thế giới và tại Việt Nam, sự hạn chế của các phương pháp xử lý hóa - lý, và ưu thế vượt trội của phương pháp sinh học sử dụng vi khuẩn sinh tổng hợp CHĐBMSH. Tác giả xác định rõ mục đích nghiên cứu là tìm ra các điều kiện lên men tối ưu cho chủng vi khuẩn Bacillus sp. DNVK2 trên môi trường cơ chất chi phí thấp, đồng thời phân chia đề tài thành 3 nội dung nghiên cứu thực nghiệm cụ thể từ quy mô phòng thí nghiệm đến hệ thống pilot 100 lít.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan cung cấp cơ sở dữ liệu học thuật sâu rộng gồm 4 nội dung chính:

  • Tình hình ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ: Tổng hợp số liệu và phân tích các vụ tràn dầu điển hình trên thế giới (Amoco Cadiz, Ixtoc, Deepwater Horizon, La Pampilla) và các vụ tai nạn hàng hải, rò rỉ kho dầu tại Việt Nam (tàu Đức Cường 06, tràn dầu tại Thanh Hóa, tàu ĐNa 0607 tại Đà Nẵng). Đánh giá cơ chế gây độc của hydrocarbon thơm, alkan đối với hệ sinh vật biển, động vật hoang dã, môi trường đất và sức khỏe con người.
  • Biện pháp xử lý ô nhiễm: So sánh chi tiết ưu nhược điểm của ba nhóm giải pháp vật lý, hóa học và sinh học; phân tích cơ chế kích thích sinh học (biostimulation) và thúc đẩy sinh học (bioaugmentation).
  • Bản chất của chất hoạt động bề mặt sinh học: Trình bày định nghĩa, phân loại 5 nhóm cấu trúc hóa học, các đặc tính vật lý - hóa học quan trọng (khả năng hạ sức căng bề mặt, độ bền nhiệt, khả năng chịu dải pH rộng và độ mặn cao, tính không độc hại).
  • Ứng dụng vi sinh vật tổng hợp CHĐBMSH và kỹ thuật lên men: Tổng thuật các công trình nghiên cứu trong nước (Rhodococcus ruber TD2, Candida tropicalis 121-BK14, Gordonia) và quốc tế (Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Acinetobacter); phân tích các nguyên lý công nghệ lên men chìm, ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, oxy hòa tan, bọt, nguồn dinh dưỡng và tốc độ khuấy đảo.

Phần III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc chủng vi khuẩn Bacillus sp. DNVK2 phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ (Vũng Tàu), công thức thành phần của môi trường HKTS và môi trường khoáng lên men, cùng danh mục các trang thiết bị phân tích hiện đại. Trình bày quy chuẩn các bước thực nghiệm: quy trình đo chỉ số nhũ hóa $E_{24}$ với dung môi xylen, phương pháp xử lý và quan sát mẫu hiển vi điện tử quét SEM, thiết kế thí nghiệm khảo sát đơn yếu tố (OFAT) về dinh dưỡng và điều kiện lý - hóa ở bình tam giác, quy trình vận hành nồi lên men 100 lít (dung tích 70 lít) theo dõi động học sinh trưởng trong 72 giờ, và kỹ thuật tách chiết thô sản phẩm bằng ethyl acetate.

Phần IV: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu và đồ thị thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu:

  • Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc chủng DNVK2 trên môi trường HKTS (sau 24–48 giờ ở 30°C) có màu hồng nhạt, dẹt, bề mặt bóng, mép răng cưa, đường kính 3–4 mm. Dưới kính hiển vi điện tử quét SEM, tế bào vi khuẩn có dạng hình que ngắn với kích thước dao động trong khoảng 1,5–2 µm.
  • Ảnh hưởng của nguồn và hàm lượng carbon: Trong số các cơ chất khảo sát (glycerol, rỉ đường, glucose, saccharose ở 2% w/v), glucose cho chỉ số nhũ hóa cao nhất đạt $E_{24} = 61,5%$, vượt trội so với glycerol và saccharose ($E_{24} \approx 12%$) hay rỉ đường ($E_{24} = 8%$). Khi khảo sát nồng độ glucose từ 1% đến 6% (w/v), chỉ số $E_{24}$ tăng dần từ 54% (ở 1% glucose) và đạt cực đại $65,5%$ tại nồng độ 3% glucose; nồng độ cao hơn (4–6%) làm giảm nhẹ hoạt tính tổng hợp.
  • Ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nitơ: Trong 6 nguồn nitơ vô cơ khảo sát ở 0,2% (w/v), $\text{NH}_4\text{NO}3$ mang lại hoạt tính nhũ hóa cao nhất ($E{24} = 68%$), các nguồn khác ($\text{NH}_4\text{Cl}$, $\text{KNO}_3$, $\text{NaNO}_3$, $(\text{NH}_4)_2\text{SO}4$) cho $E{24}$ từ 35% đến 57%, và thấp nhất là $(\text{NH}_4)_2\text{HPO}4$ ($E{24} = 27%$). Khảo sát nồng độ $\text{NH}_4\text{NO}3$ từ 0,1% đến 0,6% (w/v) xác định nồng độ tối ưu là 0,4% với chỉ số nhũ hóa đạt $E{24} = 75%$ (tại 0,1% đạt 58,5%).
  • Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, độ mặn và tỷ lệ tiếp giống:
    • pH: Chủng DNVK2 hoạt động tốt trong dải pH rộng (5–10) cho $E_{24}$ từ 62% đến 75%, đạt tối ưu tại pH 7 ($E_{24} = 75%$).
    • Nhiệt độ: Hoạt tính sinh tổng hợp ổn định từ 20°C đến 37°C ($E_{24} = 55,5% - 75%$), đạt đỉnh tối ưu tại 30°C ($E_{24} = 75%$).
    • Độ mặn ($\text{NaCl}$): Hoạt tính duy trì tốt ở dải muối 0–6% $\text{NaCl}$ ($E_{24} = 59% - 75%$), đạt tối ưu tại 2% $\text{NaCl}$ ($E_{24} = 75%$).
    • Tỷ lệ tiếp giống: Xác lập dải tỷ lệ tiếp giống phù hợp từ 1% đến 6% (v/v) nhằm đảm bảo pha lag ngắn và tối ưu hóa chuyển hóa cơ chất.
  • Lên men quy mô 100 lít (dung tích làm việc 70 lít): Vận hành hệ thống ở 30°C, pH 7 với môi trường tối ưu. So sánh 3 mức tốc độ khuấy (150, 200, 250 vòng/phút) trong 72 giờ cho thấy tốc độ 200 vòng/phút là tối ưu, giúp vi khuẩn sinh trưởng mạnh mẽ, đạt mật độ sinh khối cao và chỉ số nhũ hóa $E_{24}$ đạt 65% ổn định.

Phần V: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các giá trị thông số công nghệ tối ưu đã đạt được trong nghiên cứu; khẳng định tiềm năng ứng dụng thực tiễn của chủng Bacillus sp. DNVK2 trong việc sản xuất chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ. Đồng thời, đưa ra các kiến nghị khoa học về việc mở rộng nghiên cứu tinh sạch cấu trúc và thử nghiệm ứng dụng hiện trường.

Kết quả và đóng góp

Kết quả thực nghiệm chính

Quá trình nghiên cứu thực nghiệm đã xác định được bộ thông số công nghệ tối ưu cho quá trình lên men sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng Bacillus sp. DNVK2:

Thông số công nghệ Điều kiện tối ưu Kết quả chỉ số nhũ hóa ($E_{24}$)
Nguồn carbon Glucose 3% (w/v) $E_{24} = 65,5%$
Nguồn nitơ $\text{NH}_4\text{NO}_3$ 0,4% (w/v) $E_{24} = 75,0%$
Độ pH môi trường pH = 7,0 $E_{24} = 75,0%$
Nhiệt độ nuôi cấy 30°C $E_{24} = 75,0%$
Nồng độ muối $\text{NaCl}$ 2,0% (w/v) $E_{24} = 75,0%$
Tốc độ cánh khuấy (hệ pilot 100 L) 200 vòng/phút $E_{24} = 65,0%$, sinh khối đạt đỉnh cao

Đóng góp khoa học và thực tiễn

  1. Giá trị học thuật: Bổ sung dữ liệu khoa học về đặc điểm sinh lý học, siêu cấu trúc tế bào và động thái sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học của chủng vi khuẩn bản địa Bacillus sp. DNVK2 phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ (Việt Nam). Chứng minh khả năng thích nghi và duy trì hoạt tính bề mặt của chủng trong dải pH rộng (5–10), dải nhiệt độ từ 20°C đến 37°C và nồng độ muối lên đến 6% $\text{NaCl}$.
  2. Giá trị thực tiễn và công nghệ: Thiết lập thành công công thức môi trường khoáng tối ưu dựa trên nguồn cơ chất đơn giản, phổ biến, giá thành thấp (glucose và ammonium nitrate). Đã nâng cấp thành công quy trình lên men từ quy mô bình tam giác trong phòng thí nghiệm lên hệ thống nồi lên men pilot 100 lít (dung tích làm việc 70 lít), tạo cơ sở kỹ thuật vững chắc để phát triển quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý ô nhiễm dầu tràn tại các vùng biển và đất ven bờ ở Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu mới dừng lại ở việc tối ưu hóa theo phương pháp khảo sát từng yếu tố đơn lẻ (one-factor-at-a-time), chưa áp dụng mô hình toán học tối ưu hóa đa yếu tố (như phương pháp bề mặt đáp ứng - RSM).
  • Hoạt tính sinh học của CHĐBMSH chủ yếu được đánh giá gián tiếp qua chỉ số nhũ hóa sau 24 giờ ($E_{24}$) và tách chiết thô bằng dung môi hữu cơ ethyl acetate; chưa thực hiện tinh sạch sâu để xác định chính xác cấu trúc hóa học phân tử (như phân tích LC-MS, NMR, FT-IR).
  • Thử nghiệm dừng lại ở quy mô nồi lên men 100 lít (70 lít dịch lên men); chưa triển khai khảo sát hiệu quả làm sạch thực tế trên các mẫu đất, cát hoặc nước biển nhiễm dầu ngoài hiện trường tự nhiên.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Nghiên cứu tinh sạch và xác định bản chất hóa học, khối lượng phân tử và cấu trúc chính xác của hợp chất CHĐBMSH do chủng Bacillus sp. DNVK2 sinh tổng hợp.
  • Nghiên cứu phối trộn chất mang để tạo chế phẩm sinh học dạng bột hoặc dạng lỏng có thời gian bảo quản lâu dài.
  • Đánh giá hiệu quả xử lý ô nhiễm dầu thực tế của chế phẩm sinh học chứa dịch lên men chủng DNVK2 trên các hệ sinh thái đất ngập mặn, bãi triều ven biển và nước mặt nhiễm dầu.

Giá trị tham khảo

Công trình khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, Kỹ thuật Vi sinh, Công nghệ Môi trường, Hóa sinh ứng dụng và Kỹ thuật Hóa - Dầu khí.
  • Các nhà nghiên cứu và kỹ thuật viên: Tham khảo trực tiếp quy trình thực nghiệm chuẩn về đo lường chỉ số nhũ hóa $E_{24}$ theo phương pháp của Abouseoud (2008), quy trình cố định mẫu vi khuẩn nhiều bước phục vụ quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM), và phương pháp điều khiển các thông số công nghệ trong hệ thống nồi lên men tự động 100 lít.
  • Các đơn vị nghiên cứu và phát triển (R&D) chế phẩm sinh học: Ứng dụng công thức môi trường khoáng tối ưu chi phí thấp để mở rộng quy mô sản xuất biosurfactant phục vụ xử lý ô nhiễm môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn nghiên cứu Bacillus sp. DNVK2 có nguồn gốc từ đâu và mang đặc điểm hình thái như thế nào?

Chủng Bacillus sp. DNVK2 được phân lập từ mẫu nước nhiễm dầu lấy tại giếng khai thác dầu thuộc mỏ Bạch Hổ, Vũng Tàu, Việt Nam, có trình tự gen tương đồng 99% với Bacillus aquimaris. Trên môi trường HKTS sau 24–48 giờ nuôi cấy ở 30°C, chủng tạo khuẩn lạc màu hồng nhạt, dạng dẹt, bề mặt bóng, mép răng cưa, đường kính 3–4 mm. Dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM), tế bào vi khuẩn có dạng hình que ngắn với kích thước 1,5–2 µm.

2. Khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học của vi khuẩn được đánh giá bằng phương pháp nào?

Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH được đánh giá thông qua chỉ số nhũ hóa sau 24 giờ ($E_{24}$) theo phương pháp của Abouseoud và cs. (2008). Thí nghiệm tiến hành trộn 1 ml dịch nuôi cấy chứa CHĐBMSH với 1 ml dung môi xylen trong ống nghiệm, lắc vortex 2.000 vòng/phút trong 2 phút, sau đó giữ tĩnh ở 4°C trong 24 giờ rồi đo tỷ lệ phần trăm chiều cao lớp nhũ tương hóa so với tổng chiều cao chất lỏng.

3. Nguồn carbon và nguồn nitơ nào mang lại hiệu quả tạo CHĐBMSH cao nhất cho chủng DNVK2?

Nguồn carbon tối ưu là glucose với nồng độ thích hợp là 3% (w/v), đạt chỉ số nhũ hóa $E_{24} = 65,5%$ (vượt trội hơn hẳn so với rỉ đường $8%$, glycerol $12%$ và saccharose $12%$). Nguồn nitơ vô cơ tối ưu là $\text{NH}_4\text{NO}3$ với nồng độ 0,4% (w/v), đạt chỉ số nhũ hóa $E{24} = 75%$ (vượt trội so với các muối nitơ khác như $\text{NH}_4\text{Cl}$, $\text{KNO}_3$, $\text{NaNO}_3$, $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$ và $(\text{NH}_4)_2\text{HPO}_4$).

4. Các điều kiện vật lý - hóa học (nhiệt độ, pH, nồng độ muối) tối ưu cho chủng DNVK2 là bao nhiêu?

Quá trình sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng DNVK2 đạt kết quả cao nhất tại nhiệt độ 30°C ($E_{24} = 75%$), giá trị pH môi trường bằng 7,0 ($E_{24} = 75%$) và nồng độ muối $\text{NaCl}$ là 2,0% w/v ($E_{24} = 75%$). Chủng cũng thể hiện khả năng thích nghi và duy trì hoạt tính tốt trong dải nhiệt độ 20–37°C, dải pH 5–10 và nồng độ muối lên đến 6% $\text{NaCl}$.

5. Thử nghiệm lên men quy mô pilot 100 lít được thiết lập với các thông số công nghệ nào?

Thử nghiệm pilot được tiến hành trong thiết bị lên men tự động 100 lít với dung tích làm việc 70 lít môi trường khoáng tối ưu (3% glucose, 0,4% $\text{NH}_4\text{NO}3$, 2% $\text{NaCl}$, pH 7, 30°C). Quá trình khảo sát trong 72 giờ (lấy mẫu 4 giờ/lần) xác định tốc độ khuấy 200 vòng/phút là tối ưu nhất, giúp vi khuẩn sinh trưởng đạt mật độ sinh khối cao và chỉ số nhũ hóa $E{24}$ đạt mức 65%.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lê Thị Linh đã nghiên cứu và tối ưu hóa thành công các điều kiện công nghệ lên men chìm để sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học từ chủng vi khuẩn bản địa Bacillus sp. DNVK2. Các thông số tối ưu được xác lập bao gồm môi trường khoáng bổ sung 3% glucose, 0,4% $\text{NH}_4\text{NO}_3$, 2% $\text{NaCl}$, nuôi cấy ở pH 7, nhiệt độ 30°C và tốc độ khuấy 200 vòng/phút trong hệ thống pilot 100 lít (dung tích làm việc 70 lít). Kết quả này khẳng định tiềm năng ứng dụng to lớn của chủng Bacillus sp. DNVK2 trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ hiệu quả, an toàn và thân thiện với môi trường tại Việt Nam.