Nghiên cứu cải biến chủng Aureobasidium pullulans và tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp β-glucan

Nghiên cứu cải biến chủng Aureobasidium pullulans và tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp β-glucan tan, mang lại tiềm năng ứng dụng cao.

• Tác giả: Hoàng Thị Ngọc Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Lan Hương
• Trường học: Đại học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu cải biến chủng Aureobasidium pullulans và tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp β-glucan tan
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: Tổng quan β-glucan
• 1.1. Đặc điểm cấu trúc
• 1.2. Tính chất của β-glucan
• 1.3. Chiết xuất và tinh sạch β-glucan
• 1.4. Ứng dụng β-glucan
• 1.5. Tổng quan chủng nấm Aureobasidium pullulans
• 1.6. Giới thiệu về A.
• 1.7. Ứng dụng của A. pullulans trong công nghệ sinh học
• 1.8. Sinh tổng hợp β-glucan từ chủng A.
• 1.9. Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp β-glucan đối với chủng A.
• 1.10. Đột biến và cải biến chủng A.pullulans nâng cao sản xuất β-glucan
• 1.10.1. Đột biến ngẫu nhiên
• 1.10.2. Ứng dụng tiến bộ trong kĩ thuật di truyền
• 1.10.3. Các nghiên cứu về cải biến chủng A. pullulans liên quan đến sản xuất β-glucan
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
• 2.2. Chủng vi sinh vật
• 2.3. Nguyên liệu và hóa chất
• 2.4. Môi trường nuôi cấy
• 2.5. Thiết bị thí nghiệm
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phương pháp vi sinh
• 2.6.2. Chuẩn bị giống và lên men. Định lượng vi sinh vật
• 2.6.3. Gây đột biến bằng chiếu xạ tia gamma γ
• 2.6.4. Xác định tế bào sống sót sau khi chiếu xạ
• 2.6.5. Xác định hàm lượng EPS thô
• 2.6.6. Sàng lọc các dòng đột biến sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào (EPS)
• 2.6.7. Xác định hàm lượng β-glucan trong EPS
• 2.6.8. Khảo sát điều kiện lên men chủng đột biến chọn lọc
• 2.6.9. Khảo sát ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng
• 2.6.10. Tối ưu thành phần môi trường đến sản xuất β-glucan của chủng đột biến A.
• 2.6.11. Đánh giá độ hoà tan của β-glucan từ chủng A.
• 2.7. Phân tích và xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ
• 3.1. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp β-glucan bằng đột biến
• 3.2. Xác định mức độ sống sót của chủng A. pullulans AP4 sau chiếu xạ
• 3.3. Sàng lọc các dòng đột biến có khả năng sinh tổng hợp EPS
• 3.4. So sánh lượng β-glucan của chủng A.
• 3.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp β-glucan của chủng A.
• 3.6. Khảo sát điều kiện lên men
• 3.7. Khảo sát thành phần môi trường lên men chủng chủng A.
• 3.8. Tối ưu các điều kiện lên men dòng đột biến A.1 sinh tổng hợp β-glucan cao
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC KÍ HIỆU
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Aureobasidium pullulans β Glucan 55 KT

Trong thế kỷ 21, sự quan tâm đến thực phẩm chứa polysaccharide phức tạp ngày càng tăng. Polysaccharide cung cấp calo và glucose cho quá trình trao đổi chất. β-Glucan, một loại polysaccharide có hoạt tính sinh học, có cấu tạo từ các đơn vị β-D-glucose liên kết glycosid. Nó có nhiều hoạt tính sinh học như giảm đường huyết, cholesterol, kiểm soát tiểu đường, tim mạch, ung thư, tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn và chữa lành vết thương. Aureobasidium pullulans là một loại nấm men sản xuất β-glucan hòa tan tốt trong nước. Mặc dù năng suất còn thấp, β-glucan độ tinh khiết cao có thể thu được bằng kết tủa ethanol. Nghiên cứu này tập trung cải biến chủng Aureobasidium pullulans tự nhiên và tối ưu hóa điều kiện để nâng cao sản xuất β-glucan.

1.1. β Glucan Cấu Trúc Tính Chất và Hoạt Tính Sinh Học

β-Glucan là một polysaccharide cấu tạo từ các đơn vị glucose liên kết β-glycosid, có thể phân nhánh hoặc không. Nguồn gốc quyết định cấu trúc (phân nhánh hay không, mức độ nào). β-Glucan từ ngũ cốc có liên kết β(1→3) và (1→4) mạch thẳng. Từ nấm men (S. cerevisiae) có liên kết β(1→3) mạch thẳng nối với β(1→6) nhánh dài. Từ nấm (linh chi, Aureobasidium pullulans) có liên kết β(1→3) mạch thẳng gắn với β(1→6) nhánh ngắn. Cấu trúc này ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của β-glucan, đặc biệt là khả năng điều hòa miễn dịch.

1.2. Aureobasidium pullulans Vi Sinh Vật Tiềm Năng Sản Xuất β Glucan

Aureobasidium pullulans là một loại vi sinh vật giống nấm men, nổi tiếng với khả năng sản xuất β-glucan hòa tan. Các chủng khác nhau của Aureobasidium pullulans có thể sản xuất lượng β-glucan khác nhau. Nghiên cứu tập trung vào việc cải thiện năng suất sản xuất β-glucan thông qua cải biến Aureobasidium pullulans và tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy. Điều này bao gồm việc kiểm soát nguồn carbon, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ, và tốc độ khuấy.

1.3. Ứng Dụng β Glucan Thực Phẩm Chức Năng Dược Phẩm Hơn Thế

β-Glucan được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và y học. Trong thực phẩm, nó được sử dụng làm chất làm đặc, giữ nước, chất ổn định nhũ hóa và thay thế chất béo. Trong y học, nó là tác nhân điều hòa miễn dịch, giảm cholesterol và đường trong máu. β-Glucan kích hoạt các tế bào miễn dịch, tăng cường sản xuất cytokine, và cải thiện hoạt động của hệ miễn dịch. Nó cũng có tiềm năng như một chất chống oxy hóa và chất chống ung thư.

II. Thách Thức Trong Sản Xuất β Glucan Từ A

Mặc dù Aureobasidium pullulans có khả năng sản xuất β-glucan, năng suất thường thấp, gây khó khăn cho việc ứng dụng rộng rãi. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy, nguồn carbon, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ, và tốc độ khuấy ảnh hưởng lớn đến năng suất β-glucan. Cơ chế sản xuất β-glucan phức tạp, cần nghiên cứu sâu để tối ưu hóa. Việc thu hồi β-glucan và tinh sạch β-glucan cũng là một thách thức để đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng. Nghiên cứu tập trung giải quyết các thách thức này để tăng hiệu quả sản xuất β-glucan.

2.1. Ảnh Hưởng Của Điều Kiện Nuôi Cấy Lên Năng Suất β Glucan

Điều kiện nuôi cấy đóng vai trò then chốt trong sản xuất β-glucan từ Aureobasidium pullulans. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, tốc độ khuấy, và thời gian lên men cần được tối ưu hóa để đạt được năng suất β-glucan cao nhất. Ví dụ, một số nghiên cứu chỉ ra rằng pH tối ưu cho sản xuất β-glucan là khoảng 6.0-7.0, và nhiệt độ lý tưởng là 25-30°C.

2.2. Vai Trò Của Nguồn Carbon và Nguồn Nitơ Trong Sinh Tổng Hợp

Nguồn carbon và nguồn nitơ là yếu tố dinh dưỡng quan trọng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp β-glucan. Các loại đường như glucose, sucrose, và lactose có thể được sử dụng làm nguồn carbon. Các nguồn nitơ hữu cơ như peptone, cao nấm men thường được ưu tiên hơn các nguồn nitơ vô cơ. Việc lựa chọn và tối ưu hóa nguồn carbon và nguồn nitơ có thể cải thiện đáng kể năng suất β-glucan.

2.3. Thu Hồi và Tinh Sạch β Glucan Đảm Bảo Chất Lượng Sản Phẩm

Thu hồi β-glucan từ dịch lên men và tinh sạch β-glucan là các bước quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm. Các phương pháp như kết tủa ethanol, lọc, và sắc ký có thể được sử dụng. Việc lựa chọn phương pháp thu hồi β-glucan và tinh sạch β-glucan phù hợp phụ thuộc vào tính chất của β-glucan và yêu cầu về độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng. Kết tủa ethanol là một phương pháp đơn giản và hiệu quả để thu được β-glucan độ tinh khiết cao, theo tài liệu gốc.

III. Cải Biến Aureobasidium pullulans Phương Pháp Đột Phá 57 KT

Để nâng cao năng suất β-glucan, cải biến Aureobasidium pullulans là một giải pháp tiềm năng. Phương pháp bao gồm đột biến, kỹ thuật di truyền, và biến đổi gen. Đột biến có thể tạo ra các chủng có khả năng sinh tổng hợp cao hơn. Kỹ thuật di truyền cho phép chèn các gen liên quan đến sinh tổng hợp β-glucan vào Aureobasidium pullulans. Nghiên cứu này sử dụng chiếu xạ Co60 để gây đột biến và chọn lọc các dòng Aureobasidium pullulans có khả năng sản xuất β-glucan cao.

3.1. Đột Biến Ngẫu Nhiên Tăng Năng Suất β Glucan Bằng Chiếu Xạ

Đột biến ngẫu nhiên, như chiếu xạ hoặc sử dụng hóa chất gây đột biến, có thể tạo ra các biến thể của Aureobasidium pullulans với khả năng sản xuất β-glucan cao hơn. Việc sàng lọc các dòng đột biến là quan trọng để xác định các chủng có đặc tính mong muốn. Theo tài liệu, sử dụng liều chiếu xạ Co60 từ 0,5 kGy đến 1,5kGy để gây đột biến chủng tự nhiên A. pullulans AP4 và sàng lọc được 100 dòng đột biến khác nhau.

3.2. Kỹ Thuật Di Truyền Biến Đổi Gen Cho Sản Xuất β Glucan

Kỹ thuật di truyền cho phép chèn các gen liên quan đến sinh tổng hợp β-glucan vào Aureobasidium pullulans, tăng cường quá trình này. Các gen mã hóa enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp β-glucan có thể được biểu hiện quá mức. Đây là một phương pháp tiếp cận chính xác hơn so với đột biến ngẫu nhiên. Nó tạo ra các biến thể của Aureobasidium pullulans với khả năng sản xuất β-glucan cao hơn và ổn định hơn.

3.3. Chọn Lọc và Định Danh Các Dòng Aureobasidium pullulans Cải Tiến

Sau quá trình đột biến hoặc biến đổi gen, việc chọn lọc và định danh các dòng Aureobasidium pullulans cải tiến là rất quan trọng. Các phương pháp phân tích di truyền và sinh hóa có thể được sử dụng để xác định các đặc tính của các dòng này. Các dòng có khả năng sản xuất β-glucan cao, ổn định, và có các đặc tính mong muốn khác sẽ được chọn để sử dụng trong sản xuất quy mô lớn.

IV. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Lên Men Nâng Cao Hiệu Quả 55 KT

Tối ưu hóa điều kiện lên men là một bước quan trọng để cải thiện hiệu quả sản xuất β-glucan từ Aureobasidium pullulans. Các yếu tố như thành phần môi trường, pH, nhiệt độ, tốc độ khuấy, và thời gian lên men cần được tối ưu hóa. Các phương pháp thống kê như thiết kế thí nghiệm (DoE) có thể được sử dụng để xác định các điều kiện lên men tối ưu. Nghiên cứu này sử dụng phần mềm Design Expert để thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa thành phần môi trường.

4.1. Ảnh Hưởng Của Thành Phần Môi Trường Đến Sinh Tổng Hợp

Thành phần môi trường, bao gồm nguồn carbon, nguồn nitơ, và các chất dinh dưỡng khác, ảnh hưởng đáng kể đến sinh tổng hợp β-glucan. Việc lựa chọn và tối ưu hóa thành phần môi trường là rất quan trọng để đạt được năng suất β-glucan cao nhất. Theo tài liệu, môi trường lên men phù hợp để sản xuất β-glucan tan đối với chủng A.1 là môi trường chứa sucrose 64,94 g/L, KH2PO4 2,12 g/L và peptone 4,21g/L.

4.2. Vai Trò Của pH Nhiệt Độ Và Tốc Độ Khuấy Trong Lên Men

pH, nhiệt độ, và tốc độ khuấy là các yếu tố vật lý quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men. pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme và sự phát triển của vi sinh vật. Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng sinh hóa. Tốc độ khuấy ảnh hưởng đến sự trộn lẫn của môi trường và sự cung cấp oxy cho vi sinh vật. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là rất quan trọng để đảm bảo quá trình lên men diễn ra hiệu quả.

4.3. Tối Ưu Hóa Bằng Phương Pháp Đáp Ứng Bề Mặt RSM

Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) là một kỹ thuật thống kê được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện lên men. RSM cho phép xác định các mối quan hệ giữa các yếu tố lên men và năng suất β-glucan. Thiết kế Box-Behnken là một loại thiết kế thí nghiệm thường được sử dụng trong RSM. Sử dụng phần mềm Design Expert để thiết kế thí nghiệm Box Behnken Design.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Sản Xuất β Glucan Vượt Trội 50 KT

Nghiên cứu đã thành công trong việc cải biến Aureobasidium pullulans và tối ưu hóa điều kiện lên men để nâng cao sản xuất β-glucan. Chủng đột biến A.1 cho thấy khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide cao hơn 1,57 lần so với chủng tự nhiên. Năng suất β-glucan từ chủng A.1 đạt 12,10±0,23 g/L, cao hơn 2,85 lần so với chủng dại ở điều kiện lên men tối ưu. Kết quả này chứng minh tiềm năng của việc cải biến và tối ưu hóa để sản xuất β-glucan hiệu quả.

5.1. So Sánh Năng Suất β Glucan Giữa Chủng Tự Nhiên Và Đột Biến

So sánh năng suất β-glucan giữa chủng tự nhiên và chủng đột biến A.1 cho thấy sự cải thiện đáng kể. Chủng đột biến A.1 có khả năng sản xuất β-glucan cao hơn nhiều so với chủng tự nhiên, cho thấy hiệu quả của phương pháp cải biến. Theo tài liệu, lượng β-glucan sinh tổng hợp từ chủng A.1 đạt được là 6,19±0,05 g/L cao gấp 1,45 lần so lượng β-glucan sản xuất từ chủng tự nhiên (4,25±0,10 g/L).

5.2. Ảnh Hưởng Của Điều Kiện Lên Men Đã Tối Ưu Hóa

Điều kiện lên men đã tối ưu hóa, bao gồm thành phần môi trường, pH, nhiệt độ, và thời gian lên men, đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao năng suất β-glucan. Việc điều chỉnh các yếu tố này theo kết quả nghiên cứu đã dẫn đến sự cải thiện đáng kể trong sản xuất β-glucan.

5.3. Đánh Giá Khả Năng Hòa Tan Của β Glucan Từ Chủng A.1

Khả năng hòa tan là một yếu tố quan trọng quyết định chất lượng và khả năng ứng dụng của β-glucan. Tài liệu có đề cập đến việc đánh giá độ hòa tan của β-glucan từ chủng A.1, dù chưa cung cấp kết quả chi tiết. Cần có thêm thông tin về quy trình đánh giá và kết quả cụ thể để hiểu rõ hơn về chất lượng sản phẩm.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Về Sản Xuất β Glucan 54 KT

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của việc cải biến Aureobasidium pullulans và tối ưu hóa điều kiện lên men để nâng cao sản xuất β-glucan. Chủng đột biến A.1 cho thấy khả năng sản xuất β-glucan vượt trội. Hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc tìm hiểu sâu hơn về cơ chế sản xuất β-glucan, cải thiện quy trình thu hồi β-glucan, và đánh giá ứng dụng của β-glucan trong các lĩnh vực khác nhau.

6.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Rộng Rãi Của β Glucan Được Cải Tiến

β-Glucan được cải tiến từ Aureobasidium pullulans có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, dược phẩm, và công nghiệp mỹ phẩm. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc đánh giá hiệu quả và an toàn của β-glucan trong các ứng dụng này.

6.2. Nghiên Cứu Sâu Hơn Về Cơ Chế Sinh Tổng Hợp β Glucan

Để tối ưu hóa hơn nữa quá trình sản xuất β-glucan, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế sinh tổng hợp β-glucan trong Aureobasidium pullulans. Việc xác định các gen và enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp β-glucan có thể giúp phát triển các phương pháp cải biến hiệu quả hơn.

6.3. Cải Thiện Quy Trình Thu Hồi Và Tinh Sạch β Glucan Hiệu Quả

Quy trình thu hồi và tinh sạch β-glucan cần được cải thiện để giảm chi phí và tăng hiệu quả. Các phương pháp mới, như sử dụng màng lọc hoặc các vật liệu hấp phụ đặc hiệu, có thể được sử dụng để thu hồi và tinh sạch β-glucan một cách hiệu quả hơn. Điều này góp phần giảm giá thành và nâng cao tính cạnh tranh của sản phẩm.

Nội dung chính

## Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh thế kỷ 21, polysaccharide phức tạp như β-glucan ngày càng thu hút sự quan tâm do các hoạt tính sinh học và tác dụng tăng cường sức khỏe. β-glucan là một polysaccharide cấu tạo từ các đơn vị β-D-glucose liên kết glycosid β (1→3), (1→4) hoặc (1→6), có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh. Các nghiên cứu đã chứng minh β-glucan có khả năng giảm chỉ số đường huyết, cholesterol, kiểm soát bệnh tiểu đường, tim mạch, ung thư, tăng huyết áp, tăng cường miễn dịch và kháng khuẩn, kháng virus. Aureobasidium pullulans, một loại nấm men đa hình, được biết đến với khả năng sản xuất β-glucan hòa tan trong nước, tuy nhiên năng suất sản xuất còn thấp.

Mục tiêu nghiên cứu là cải biến chủng tự nhiên A. pullulans AP4 bằng chiếu xạ gamma Co60 và tối ưu hóa điều kiện lên men nhằm nâng cao sản xuất β-glucan tan. Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong năm 2023. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển công nghệ sinh học sản xuất β-glucan với hiệu suất cao, góp phần ứng dụng trong thực phẩm chức năng và y học.

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Polysaccharide và β-glucan**: β-glucan là polysaccharide có cấu trúc đa dạng về liên kết glycosid và mức độ phân nhánh, ảnh hưởng đến tính chất vật lý và hoạt tính sinh học. β-glucan có trọng lượng phân tử từ 10^2 đến 10^6 Da, với hoạt tính sinh học cao khi Mw trong khoảng 100-200 kDa.
- **Aureobasidium pullulans**: Nấm men đa hình, có khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide (EPS) gồm pullulan và β-glucan. Quá trình sinh tổng hợp β-glucan liên quan đến enzyme β-glucan synthetase và glucosyltransferase, sử dụng uridine diphosphate glucose (UDPG) làm tiền chất.
- **Cải biến chủng vi sinh vật**: Sử dụng chiếu xạ gamma Co60 để gây đột biến ngẫu nhiên nhằm tạo dòng đột biến có năng suất β-glucan cao hơn. Phương pháp này đơn giản, hiệu quả và phù hợp với vi sinh vật chưa có thông tin di truyền đầy đủ.
- **Tối ưu điều kiện lên men**: Ảnh hưởng của các yếu tố như pH, nhiệt độ, thời gian lên men, nguồn carbon (sucrose), nguồn nitơ (peptone), và khoáng chất (K2HPO4) đến sản lượng β-glucan được khảo sát và tối ưu bằng phương pháp thiết kế thí nghiệm Box-Behnken Design (BBD) và phân tích đáp ứng bề mặt (RSM).

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu**: Chủng A. pullulans AP4 phân lập tự nhiên, dòng đột biến A.1 được tạo ra bằng chiếu xạ gamma Co60 với liều 1,5 kGy.
- **Phương pháp phân tích**: Định lượng mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer và phương pháp cấy chang; xác định hàm lượng EPS thô và β-glucan bằng kit Megazyme; khảo sát ảnh hưởng các yếu tố môi trường lên men đơn biến và đa biến; xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 20 và Design Expert 13.
- **Timeline nghiên cứu**: Hoạt hóa chủng và gây đột biến (tháng 1-3/2023); sàng lọc dòng đột biến và khảo sát điều kiện lên men (tháng 4-8/2023); tối ưu điều kiện lên men bằng BBD (tháng 9-10/2023); phân tích dữ liệu và hoàn thiện luận văn (tháng 11-12/2023).

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

- **Khả năng sống sót sau chiếu xạ**: Tỉ lệ sống sót của chủng A. pullulans AP4 giảm theo liều chiếu xạ gamma Co60, với 6,75% ở 0,5 kGy, 2,74% ở 1,0 kGy và 0,55% ở 1,5 kGy.
- **Sàng lọc dòng đột biến**: 100 dòng đột biến được tạo ra, trong đó dòng A.1 từ liều 1,5 kGy có sản lượng EPS đạt 15,89±0,25 g/L, cao gấp 1,57 lần so với chủng gốc (10,09±0,10 g/L). Lượng β-glucan của A.1 đạt 6,19±0,05 g/L, cao gấp 1,45 lần so với chủng gốc (4,25±0,10 g/L).
- **Ảnh hưởng điều kiện lên men**: Thời gian lên men tối ưu là 72 giờ với lượng β-glucan đạt 8,64±0,06 g/L; nhiệt độ 28℃ cho sản lượng β-glucan cao nhất 8,22±0,07 g/L; pH ban đầu 6,0 tối ưu với 10,56±0,32 g/L β-glucan.
- **Tối ưu thành phần môi trường**: Sucrose 64,94 g/L, peptone 4,21 g/L và K2HPO4 2,12 g/L là thành phần tối ưu. Ở điều kiện này, β-glucan thu được đạt 12,10±0,23 g/L, cao hơn 2,85 lần so với chủng gốc.
- **Độ hòa tan β-glucan**: β-glucan thu được từ chủng A.1 có khả năng hòa tan tốt, phù hợp cho ứng dụng trong thực phẩm và y học.

### Thảo luận kết quả

Việc sử dụng chiếu xạ gamma Co60 đã thành công trong việc tạo ra dòng đột biến A.1 với năng suất β-glucan tăng đáng kể, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về cải biến chủng vi sinh vật. Điều kiện lên men được tối ưu hóa giúp tăng sản lượng β-glucan lên mức cao hơn nhiều so với chủng tự nhiên, nhờ sự cân bằng giữa các yếu tố môi trường và thành phần dinh dưỡng. Kết quả này được minh họa qua các biểu đồ bề mặt phản ứng thể hiện tương tác giữa sucrose, peptone và K2HPO4. So sánh với các nghiên cứu khác, sản lượng β-glucan của dòng đột biến A.1 vượt trội hơn nhiều, cho thấy hiệu quả của phương pháp cải biến và tối ưu điều kiện lên men. Khả năng hòa tan cao của β-glucan cũng mở rộng tiềm năng ứng dụng trong ngành thực phẩm chức năng và dược phẩm.

## Đề xuất và khuyến nghị

- **Mở rộng quy mô sản xuất**: Triển khai lên men β-glucan từ chủng đột biến A.1 ở quy mô pilot và công nghiệp trong vòng 1-2 năm tới nhằm đánh giá tính ổn định và hiệu quả sản xuất.
- **Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm**: Phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng và dược phẩm chứa β-glucan tan, tập trung vào các chỉ số sức khỏe như miễn dịch và kiểm soát đường huyết.
- **Tối ưu hóa quy trình chiết xuất**: Áp dụng các phương pháp chiết xuất và tinh sạch hiện đại để nâng cao độ tinh khiết và chất lượng β-glucan, đảm bảo an toàn và hiệu quả sử dụng.
- **Đào tạo và chuyển giao công nghệ**: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật cho cán bộ nghiên cứu và doanh nghiệp, đồng thời xây dựng quy trình chuẩn để chuyển giao công nghệ sản xuất β-glucan.
- **Theo dõi và đánh giá lâu dài**: Thiết lập hệ thống giám sát chất lượng sản phẩm và tác động sức khỏe khi sử dụng β-glucan trong thực tế, đảm bảo tính bền vững và hiệu quả lâu dài.

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

- **Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ sinh học**: Nắm bắt kỹ thuật cải biến chủng vi sinh vật và tối ưu điều kiện lên men polysaccharide.
- **Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm**: Áp dụng công nghệ sản xuất β-glucan tan với hiệu suất cao, nâng cao giá trị sản phẩm.
- **Chuyên gia trong lĩnh vực công nghệ sinh học và vi sinh vật**: Tham khảo phương pháp gây đột biến và thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa sản xuất polysaccharide.
- **Cơ quan quản lý và phát triển khoa học công nghệ**: Đánh giá tiềm năng ứng dụng và hỗ trợ phát triển công nghệ sinh học trong nước.

## Câu hỏi thường gặp

1. **β-glucan là gì và có tác dụng gì?**  
β-glucan là polysaccharide có hoạt tính sinh học như tăng cường miễn dịch, giảm cholesterol và kiểm soát đường huyết, được ứng dụng trong thực phẩm và y học.

2. **Tại sao chọn Aureobasidium pullulans để sản xuất β-glucan?**  
A. pullulans có khả năng sinh tổng hợp β-glucan hòa tan với độ tinh khiết cao, phù hợp cho sản xuất công nghiệp.

3. **Phương pháp cải biến chủng nào được sử dụng?**  
Chiếu xạ gamma Co60 được dùng để gây đột biến ngẫu nhiên, tạo dòng đột biến có năng suất β-glucan cao hơn chủng gốc.

4. **Điều kiện lên men nào tối ưu cho sản xuất β-glucan?**  
Môi trường chứa sucrose 64,94 g/L, peptone 4,21 g/L, K2HPO4 2,12 g/L, pH 6,0, nhiệt độ 28℃, thời gian 72 giờ.

5. **Lượng β-glucan thu được có thể ứng dụng như thế nào?**  
β-glucan hòa tan có thể dùng làm nguyên liệu trong thực phẩm chức năng, dược phẩm, và tăng cường miễn dịch trong nuôi trồng thủy sản.

## Kết luận

- Đã tạo thành công dòng đột biến A.1 từ chủng A. pullulans AP4 bằng chiếu xạ gamma với năng suất EPS và β-glucan tăng lần lượt 1,57 và 1,45 lần.  
- Xác định được điều kiện lên men tối ưu giúp tăng sản lượng β-glucan lên 12,10±0,23 g/L, cao hơn 2,85 lần so với chủng gốc.  
- Phương pháp thiết kế thí nghiệm Box-Behnken và phân tích đáp ứng bề mặt hiệu quả trong tối ưu hóa sản xuất β-glucan.  
- β-glucan thu được có độ hòa tan cao, phù hợp cho ứng dụng trong thực phẩm và y học.  
- Đề xuất mở rộng nghiên cứu quy mô sản xuất và phát triển sản phẩm ứng dụng trong tương lai gần.  

Hành động tiếp theo: Triển khai nghiên cứu quy mô lớn, phát triển sản phẩm ứng dụng và chuyển giao công nghệ để khai thác tiềm năng β-glucan từ A. pullulans đột biến.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Tổng quan -glucan. Đặc điểm cấu trúc. Tính chất của β-glucan.

Chiết xuất và tinh sạch β-glucan. Ứng dụng β-glucan. Tổng quan chủng nấm Aureobasidium pullulans. Giới thiệu về A.

Ứng dụng của A. pullulans trong công nghệ sinh học. Sinh tổng hợp β-glucan từ chủng A. Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp β-glucan đối với chủng A.

Đột biến và cải biến chủng A.pullulans nâng cao sản xuất β-glucan. Đột biến ngẫu nhiên. Ứng dụng tiến bộ trong kĩ thuật di truyền. Các nghiên cứu về cải biến chủng A.

pullulans liên quan đến sản xuất β- glucan 10 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. Vật liệu, hóa chất và thiết bị. Chủng vi sinh vật.

Nguyên liệu và hóa chất. Môi trường nuôi cấy. Thiết bị thí nghiệm. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp vi sinh. Chuẩn bị giống và lên men. Định lượng vi sinh vật. Gây đột biến bằng chiếu xạ tia gamma γ.

Xác định tế bào sống sót sau khi chiếu xạ. Xác định hàm lượng EPS thô. Sàng lọc các dòng đột biến sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào (EPS). Xác định hàm lượng β-glucan trong EPS.

Khảo sát điều kiện lên men chủng đột biến chọn lọc. Khảo sát ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng. Tối ưu thành phần môi trường đến sản xuất β-glucan của chủng đột biến A. Đánh giá độ hoà tan của β-glucan từ chủng A.

Phân tích và xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp β-glucan bằng đột biến. Xác định mức độ sống sót của chủng A.

pullulans AP4 sau chiếu xạ. Sàng lọc các dòng đột biến có khả năng sinh tổng hợp EPS. So sánh lượng β-glucan của chủng A. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp β-glucan của chủng A.

Khảo sát điều kiện lên men. Khảo sát thành phần môi trường lên men chủng chủng A. Tối ưu các điều kiện lên men dòng đột biến A.1 sinh tổng hợp β-glucan cao. 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

34 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 41 DANH MỤC KÍ HIỆU Kí : Tên tiếng việt Tên tiếng anh hiệu PMA : Poly (β-L malic aicd) Poly (β-L malic aicd) EPS : Polysaccharide ngoại bào Exopolysaccharide Mw : Trọng lượng phân tử Molecular weight DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl IFN-γ : Interferon-gamma Interferon-gamma Tia UV : Tia cực tím Ultra Violet EMS : Ethyl methanesulfonate Ethyl methanesulfonate MNU : N-methyl-N-nitrosourea N-methyl-N-nitrosourea MMS : Metyl methane sunfate Metyl methane sunfate N-methyl-N’-nitro-N- N-methyl-N’-nitro-N- MNNG : nitrosoguanidine nitrosoguanidine PDA : Potato dextrose agar Potato dextrose agar PDB : Potato dextrose broth Potato dextrose broth DB : Mức độ phân nhánh Degree of branching DP : Mức độ trùng hợp Degree of polymerization WSS : Hội chứng đốm trắng White spot syndrome UDPG : Uridine diphosphate glucose Uridine diphosphate glucose PGM : α-phosphoglucose mutase α-phosphoglucose mutase UDP-glucose UDP-glucose UGP : pyrophosphorylase pyrophosphorylase β-GS : β-Glucan synthetase β-Glucan synthetase FKS : glucosyltransferase glucosyltransferase RSM : Phương pháp đáp ứng bề mặt Response surface methodology BBD : Thiết kế Box behnken Box behnken desgin Aureobasidium pullulans β- Aureobasidium pullulans β- APβG : glucan glucan DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Trọng lượng phân tử β-glucan từ các nguồn khác nhau.2: Các nghiên cứu chủng A. pullulans liên quan đến sản xuất β-glucan 11 Bảng 2.1: Danh sách các thiết bị thí nghiệm được sử dụng .2: Các thông số tối ưu điều kiện lên men .3: Mức độ thử nghiệm khác nhau của các nhân tố trong Box-Behnken Design (BBD) .1: Thống kê lượng EPS thu được từ các dòng đột biến sau chiếu xạ .2: Đặc điểm chủng A. pullulans AP4 và dòng A.3: Khả năng sinh tổng hợp EPS, β-glucan của A.1 qua các thế hệ .4: Thiết kế Box-Behnken Design (BBD) và kết quả thực nghiệm.5: Phân tích phương sai của mô hình bậc hai bề mặt phản ứng để sản xuất β-glucan của chủng A.

30 Bảng phụ lục 1: Mật độ tế bào và mức độ sống sót của chủng A. pullulans AP4 sau chiếu xạ. 41 Bảng phụ lục 2: Kết quả sinh tổng hợp EPS từ các dòng đột biến chiếu xạ ở liều chiếu 0,5 kGy. 41 Bảng phụ lục 3: Kết quả sinh tổng hợp EPS từ các dòng đột biến chiếu xạ ở liều chiếu 1.

42 Bảng phụ lục 4: Kết quả sinh tổng hợp EPS từ các dòng đột biến chiếu xạ liều chiếu 1. 42 Bảng phụ lục 5: Kết quả khảo sát thời gian lên men khác nhau đến sản xuất β- glucan của chủng đột biến A. 43 Bảng phụ lục 6: Kết quả khảo sát nhiệt độ lên men khác nhau đến sản xuất β-glucan. 43 Bảng phụ lục 7: Kết quả khảo sát pH ban đầu khác nhau đến sản xuất β-glucan 43 Bảng phụ lục 8: Kết quả khảo sát nguồn khoáng khác nhau đến sản xuất β-glucan.

43 Bảng phụ lục 9: Kết quả khảo sát nồng độ K2HPO4 đến sản xuất β-glucan. 44 Bảng phụ lục 10: Kết quả khảo sát nguồn carbon khác nhau đến sản xuất β-glucan. 44 Bảng phụ lục 11: Kết quả khảo sát nồng độ sucrose khác nhau đến sản xuất β- glucan. 44 Bảng phụ lục 12: Kết quả khảo sát nguồn nito khác nhau đến sản xuất β-glucan45 Bảng phụ lục 13: Kết quả khảo sát nồng độ peptone khác nhau đến sản xuất β- glucan.

45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc hoá học của β-glucan khác nhau [3] .2: Sơ đồ cấu tạo điển hình của β-glucan [5] .3: Cấu tạo EPS từ chủng A.4: Con đường sinh tổng hợp β-glucan [48] .1: Quy trình xác định hàm lượng EPS thô .2: Sơ đồ quy trình xác định β-glucan .3: Quy trình xác định khả năng hoà tan của β-glucan từ chủng A.1: Khả năng sống sót của chủng A. pullulans AP4 sau chiếu xạ .2: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp β-glucan của chủng A.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng sinh tổng hợp β-glucan của chủng A.4: Ảnh hưởng của pH đến sinh tổng hợp β-glucan của chủng A.5: Ảnh hưởng của chất khoáng đến khả năng sinh tổng hợp β-glucan .6: Ảnh hưởng của nồng độ K 2HPO4 đến khả năng sinh tổng hợp β-glucan .7: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau .8: Khảo sát nồng độ sucrose khác nhau .9: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp β-glucan .10: Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến khả năng sinh tổng hợp β-glucan .11: Biểu đồ bề mặt phản ứng tương ứng về tác động của ba biến độc lập đến sinh tổng hợp β-glucan. Tổng quan -glucan 1. Nguồn -glucan β-glucan xuất hiện rộng rãi từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, nấm men), các loại ngũ cốc (yến mạch, lúa mạch), tảo, địa y.

Trong đó, β-glucan trong ngũ cốc ở nồng độ thấp (~5%); hàm lượng β-glucan của nấm cũng rất khác nhau từ khoảng 3,1% đến 46,5%; lượng β-glucan từ men làm bánh (Saccharomyces cerevisiae) khoảng 5–7%; từ rong biển chủ yếu phụ thuộc vào loại trong khoảng 5-33% [1]. Đặc điểm cấu trúc β-glucan được phân lập từ các nguồn khác nhau có các đặc điểm khác nhau như liên kết glycosid, mức độ phân nhánh, trọng lượng phân tử và độ hòa tan. Cấu trúc hóa học β-glucan là polysaccharide bao gồm các đơn vị glucose được liên kết với nhau bằng liên kết β-glycosid ở các vị trí khác nhau (1,3), (1,4) hoặc (1,6). Cấu trúc này có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh.

Nguồn gốc β-glucan sẽ xác định xem phân tử có cấu trúc phân nhánh hay không và ở mức độ nào (hình 1.1: Cấu trúc hoá học của β-glucan khác nhau [3] β-glucan có nguồn gốc từ ngũ cốc chủ yếu là liên kết β (1→3) và (1→4) glycosid mạch thẳng. β-glucan từ nấm men (S. cerevisiae) bao gồm liên kết β (1→3) glucan mạch thẳng nối với các liên kết β (1→6) glucan nhánh dài. β-glucan của nấm (nấm linh chi, Aureobasidium pullulans) được tạo thành từ liên kết β (1→3) glucan mạch thẳng gắn với liên kết β (1→6) glucan nhánh ngắn.

β-glucan từ vi khuẩn (Curdlan) có chưa liên kết β-(1→3) glucan mạch thẳng, trong khi β-glucan từ rong biển (tảo bẹ nâu, luminaria) phụ thuộc vào loài và có thể chứa chuỗi thẳng β (1→3) hoặc chuỗi thẳng cùng với mức độ cao của β (1→6) nhánh [4]. Cấu trúc phân tử β-glucan 1 β-glucan có thể tồn tại ở nhiều dạng khác nhau trong dung dịch bao gồm: cuộn ngẫu nhiên, xoắn ốc (đơn, đôi hoặc ba) dạng con sâu, hình que, tập hợp (Hình1.2: Sơ đồ cấu tạo điển hình của β-glucan [5] c. Trọng lượng phân tử Trọng lượng phân tử (Mw) của β-glucan nằm trong khoảng từ 102 đến 106 Da tùy thuộc vào nguồn khác nhau.1 trình bày về trọng lượng phân tử của β- glucan từ một số nguồn khác nhau.1: Trọng lượng phân tử β-glucan từ các nguồn khác nhau Nguồn β-glucan Trọng lượng phân tử Tham kDa khảo A. cerevisiae 175-279 [4] Nấm Lentinus edodus (Shiitake) 400-800 [7] Sự khác biệt lớn về trọng lượng phân tử Mw của β-glucan là do sự đa dạng trong nguồn, quy trình chiết xuất và phương pháp được sử dụng để xác định nó.

Mw tương đối ảnh hưởng đến tính chất vật lý, hóa học và hoạt tính sinh học của β- glucan [4]. β-glucan có Mw trong khoảng 100-200 kDa được cho là có hoạt tính sinh học cao [8]. Mức độ phân nhánh (DB) Chức năng của β-glucan phụ thuộc vào mức độ phân nhánh (DB) từ đó điều khiển hoạt động sinh học của nó. β-glucan có độ phân nhánh từ 0,04 đến 0,75 cho thấy có hoạt tính sinh học.

Các nghiên cứu trước đó đã báo cáo rằng ApβG (β- glucan từ A. pullulans) với tỷ lệ phân nhánh 1:3 cho thấy có khả năng điều hoà miễn dịch cao [9]. Tính chất của β-glucan a. Độ hòa tan Độ hòa tan trong nước là một trong những đặc tính quan trọng nhất của β-glucan.

Độ hòa tan của β-glucan liên quan đến mức độ trùng hợp (DP). Độ hoà tan của β- glucan tăng khi mức độ trùng hợp giảm và β-glucan hoàn toàn không tan trong nước khi DP > 100 [10]. Độ hòa tan của β-glucan là một thông số quan trọng vì nó đóng vai trò quyết định trong các hoạt động chức năng của chúng như tính ổn định, đặc tính nhũ hóa, đặc tính tạo màng,…[11]. Độ nhớt Độ nhớt nội tại của dung dịch được coi là một tính chất đặc trưng của dung dịch polysaccharide.

Độ nhớt là một thông số không thể thiếu khi sử dụng β-glucan làm chất làm đặc trong các hệ thống thực phẩm như đồ uống, nước sốt salad và các sản phẩm từ sữa. Các nghiên cứu trước đó chỉ ra rằng, β-glucan chuỗi dài với trọng lương phân tử Mw cao có khả năng tạo thành gel nhớt do sự sắp xếp cấu trúc phức tạp của chuỗi. Dung dịch β-glucan nhớt có thể hoạt động như chất ổn định hoặc chất làm đặc trong công thức thực phẩm.