Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn Tạo Tủa Calcite Từ Đá Tại Nghệ An

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu công nghệ sinh học phân lập tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn tạo tủa calcite từ các mẫu đá, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân,

• Tác giả: Lê Trần Hiệp Thương
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoàng Dũng
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn Tạo Tủa Calcite Từ Đá Tại Nghệ An
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan tủa calcite
• 1.2. Tổng quan vi khuẩn tạo kết tủa calcite
• 1.3. Sơ lược về ma trận Plackett - Burman và Box - Behnken
• 1.4. Giới thiệu phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)
• 1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo tủa calcite
• 1.6. Các công trình nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 1.7. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 1.8. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị
• 2.3. Môi trường và hóa chất
• 2.4. Đối tượng nghiên cứu
• 2.5. Nội dung nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 3.2. Tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn ở quy mô phòng thí nghiệm
• 3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt tính tạo kết tủa calcite của vi sinh
• 3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến hoạt tính tạo kết tủa calcite
• 3.5. Thử nghiệm khả năng tạo kết tủa calcite các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.6. Khả năng giảm tính thấm
• 3.7. Kiểm tra tầm lượng tủa
• 3.8. Phân tích cấu trúc vi mô
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Vi Khuẩn Tạo Tủa Calcite Tại Nghệ An

Calcite, dạng bền nhất của CaCO3, là thành phần phổ biến trong đá trầm tích như đá vôi. Khoảng 10% đá trầm tích là đá vôi. Calcite cũng xuất hiện trong đá hoa biến chất, mạch khoáng, suối nước nóng và hang động. Thành phần chính của vỏ sinh vật biển cũng chứa calcite. Calcite có nhiều dạng và màu sắc, từ vàng đồng đến xanh lá cây. Biến thể trong suốt được gọi là 'Calcite quang học'. Calcite hòa tan trong acid, giải phóng CO2. Nước ngầm cũng có thể hòa tan hoặc lắng đọng calcite, tùy thuộc vào nhiệt độ, pH và nồng độ ion. Quá trình này có thể tạo ra hang động. Nghiên cứu này tập trung vào việc khai thác tiềm năng của đá vôi Nghệ An để phân lập vi khuẩn tạo tủa calcite.

1.1. Đặc Điểm Cấu Trúc Tinh Thể Tủa Calcite

Tinh thể calcite có dạng hình thoi nhọn, tù, phẳng, lăng trụ hoặc tam giác lệch. Ngoài ra, calcite còn tồn tại ở dạng sợi, hình hộp, lát mỏng hoặc khối đặc. Màu sắc giao động từ vàng đồng đến xanh lá cây. Biến thế trong suốt được gọi là 'Calcite quang học', có tính chất 'phân đôi' hình ảnh. Cấu trúc tinh thể này quan trọng trong việc ứng dụng tủa calcite trong xây dựng và xử lý môi trường.

1.2. Vai Trò Sinh Địa Hóa Của Calcite Trong Môi Trường

Calcite đóng vai trò quan trọng trong các chu trình sinh địa hóa. Sự hình thành và hòa tan calcite ảnh hưởng đến độ pH của môi trường đất và nước. Sự lắng đọng calcite có thể bẫy các chất ô nhiễm, góp phần vào quá trình xử lý môi trường. Nghiên cứu này hướng đến việc tận dụng vai trò sinh địa hóa của calcite để phát triển các ứng dụng bền vững, đặc biệt là sử dụng vi khuẩn bản địa.

II. Thách Thức Giải Pháp Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy

Quá trình khoáng hóa do sinh học tạo ra calcite thường liên quan đến bề mặt tế bào vi sinh vật và hoạt động trao đổi chất làm tăng độ kiềm của môi trường. Thủy phân urea, xúc tác bởi enzyme urease, là phổ biến nhất. Khả năng tạo tủa calcite phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nồng độ calcium, carbon hòa tan, pH và vị trí tâm hoạt động trên bề mặt vi khuẩn. Việc lựa chọn chủng vi khuẩn an toàn, có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường khắc nghiệt là cần thiết. Nghiên cứu này tập trung vào tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn để đạt hiệu quả tạo tủa calcite cao nhất.

2.1. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Hiệu Quả Tạo Tủa Calcite

Nồng độ calcium, nồng độ carbon hòa tan và độ pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến vi khuẩn cũng như quá trình tạo tủa calcite. Các chủng tiềm năng cần đáp ứng được các yếu tố này. Ngoài ra, cần quan tâm đến tính an toàn của các chủng vi khuẩn, khả năng tồn tại lâu dài và chịu được các điều kiện khắc nghiệt trong vật liệu. Vì vậy, việc sàng lọc vi khuẩn tạo tủa calcite cần ưu tiên các yếu tố này.

2.2. Ưu Tiên An Toàn Sinh Học Khả Năng Thích Nghi

Việc lựa chọn vi khuẩn bản địa giúp tăng khả năng thích nghi với điều kiện địa phương, đồng thời giảm thiểu rủi ro về an toàn sinh học so với việc sử dụng các chủng vi khuẩn ngoại lai. Phân lập vi khuẩn bản địa từ đá tại Nghệ An là một hướng đi tiềm năng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Phân Lập Tối Ưu Hóa Nuôi Cấy

Đề tài "Phân lập, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn tạo tủa calcite từ các mẫu đá tại tỉnh Nghệ An" được thực hiện nhằm phân lập, đánh giá khả năng tạo tủa calcite của các chủng vi khuẩn thu thập từ các mỏ đá. Mục tiêu là tạo nền tảng cho việc tạo xi măng sinh học. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân lập vi khuẩn bản địa, sau đó tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để tăng hiệu quả tạo tủa calcite. Các phương pháp phân tích XRD và SEM được sử dụng để xác định thành phần và cấu trúc của tủa.

3.1. Quy Trình Phân Lập Định Danh Vi Khuẩn Tiềm Năng

Quy trình nghiên cứu bắt đầu bằng việc thu thập mẫu đá vôi Nghệ An. Sau đó, tiến hành nghiền mẫu và phân lập vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn phân lập được sàng lọc dựa trên khả năng tạo tủa calcite. Các chủng có tiềm năng nhất được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử, cụ thể là phân tích trình tự gen 16S rRNA. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành calcite như nhiệt độ, pH và các thành phần dinh dưỡng.

3.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Nuôi Cấy Bằng Phương Pháp RSM

Để tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) được sử dụng. Phương pháp này giúp xác định các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tạo tủa calcite và tìm ra điều kiện nuôi cấy tối ưu. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, nồng độ urea và nồng độ calcium được điều chỉnh và đánh giá ảnh hưởng của chúng đến lượng tủa calcite tạo thành.

3.3. Phân Tích XRD SEM Xác Định Thành Phần Cấu Trúc

Phân tích XRD (Nhiễu xạ tia X) được sử dụng để xác định thành phần khoáng vật của tủa calcite. Phân tích SEM (Kính hiển vi điện tử quét) được sử dụng để quan sát cấu trúc vi mô của tủa calcite và sự tương tác giữa vi khuẩn và tủa calcite. Các phân tích này cung cấp thông tin quan trọng về chất lượng và tính chất của tủa calcite tạo thành.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Chủng Lysinibacillus Fusiformic NSNA1

Đề tài đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn có khả năng tạo kết tủa calcite từ 7 mẫu đá thu tại các mỏ đá tại Nghệ An. Sau quá trình tuyển chọn và định danh, chủng vi khuẩn Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 cho thấy khả năng tạo tủa tốt với sản lượng tủa đạt 15,86 g/L và tiềm năng ứng dụng cao. Các điều kiện phù hợp cho quá trình tạo calcite bao gồm pH 8, nhiệt độ 40°C, nguồn Ca2+ từ CaCl2 với nồng độ 250 mM, nồng độ urea là 400 mM và nồng độ vi khuẩn là 108 CFU/mL.

4.1. Khả Năng Tạo Tủa Calcite Của Chủng Lysinibacillus fusiformic

Chủng Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 cho thấy khả năng tạo tủa tốt với sản lượng tủa đạt 15,86 g/L. Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng cao của chủng vi khuẩn này trong việc sản xuất xi măng sinh học và các ứng dụng khác liên quan đến tạo tủa calcite.

4.2. Ảnh Hưởng Của Các Yếu Tố Môi Trường Đến Khả Năng Tạo Tủa

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng pH, nhiệt độ, nồng độ calcium và nồng độ urea ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo tủa calcite của Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6. Việc tối ưu hóa các yếu tố này giúp tăng hiệu quả tạo tủa calcite. pH 8, nhiệt độ 40°C, 250 mM Ca2+ từ CaCl2 và 400 mM urea là các điều kiện tối ưu cho quá trình này.

V. Ứng Dụng Thực Tế Cải Thiện Tính Thấm Của Cát

Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 cho hoạt tính tạo tủa tốt nhất bằng phương pháp đáp ứng bề mặt cũng được thực hiện. Sản lượng tủa calcite sau khi tối ưu đạt 16,9 g/L. Ngoài ra, đề tài còn tiến hành thử nghiệm ngâm cột cát có bổ sung dịch vi khuẩn Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 trong dung dịch CaCl2 + urea với tỉ lệ 1:1. Kết quả thử nghiệm cho thấy, sau 14 ngày, tính thấm của cột cát giảm xuống.

5.1. Thử Nghiệm Giảm Tính Thấm Của Cột Cát Bằng Vi Khuẩn

Thử nghiệm ngâm cột cát có bổ sung dịch vi khuẩn Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 trong dung dịch CaCl2 + urea cho thấy tính thấm của cột cát giảm xuống sau 14 ngày. Điều này chứng tỏ rằng vi khuẩn có khả năng liên kết các hạt cát thông qua quá trình tạo tủa calcite, từ đó cải thiện tính chất cơ học của vật liệu.

5.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Trong Xây Dựng Xử Lý Môi Trường

Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 có tiềm năng ứng dụng trong việc kết dính cát thông qua sự hình thành tủa calcite. Điều này mở ra cơ hội ứng dụng trong xây dựng, ví dụ như gia cố nền móng, hoặc trong xử lý môi trường, ví dụ như ổn định đất và ngăn chặn xói mòn.

VI. Kết Luận Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Này

Nghiên cứu này đã thành công trong việc phân lập và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 từ đá tại Nghệ An. Kết quả cho thấy tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn này trong việc tạo tủa calcite và cải thiện tính chất của vật liệu xây dựng. Hướng phát triển tiếp theo có thể tập trung vào việc nghiên cứu cơ chế tạo tủa calcite của vi khuẩn và ứng dụng trong nông nghiệp.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Chính Ý Nghĩa Khoa Học

Nghiên cứu đã xác định được chủng vi khuẩn Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 có khả năng tạo tủa calcite cao và tối ưu hóa được điều kiện nuôi cấy cho chủng vi khuẩn này. Kết quả này đóng góp vào sự hiểu biết về quá trình tạo tủa calcite do vi sinh vật và mở ra cơ hội ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Mở Rộng Ứng Dụng Tiềm Năng

Các hướng nghiên cứu mở rộng có thể bao gồm nghiên cứu cơ chế tạo tủa calcite ở cấp độ phân tử, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố khác như sự hiện diện của các kim loại nặng đến quá trình tạo tủa calcite, và ứng dụng trong nông nghiệp để cải tạo đất và cung cấp calcium cho cây trồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh phát triển nhanh chóng của ngành xây dựng, nhu cầu cải thiện độ bền và tính bền vững của vật liệu xây dựng ngày càng trở nên cấp thiết. Theo ước tính, sản xuất xi măng hiện nay tiêu tốn lượng lớn năng lượng và phát thải khí nhà kính, đồng thời vật liệu xi măng dễ bị nứt, gây hư hại cấu trúc và tăng chi phí sửa chữa. Một giải pháp sinh học tiên tiến là công nghệ cảm ứng tạo kết tủa calcite do vi sinh vật (MICP - Microbe Inducing Calcite Precipitation) đã được nghiên cứu nhằm khắc phục các vấn đề này. Công nghệ MICP sử dụng vi khuẩn tạo calcite (CaCO₃) như một chất kết dính sinh học, có khả năng làm liền vết nứt và gia cố vật liệu xây dựng một cách tự nhiên, thân thiện với môi trường.

Luận văn tập trung phân lập và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn tạo tủa calcite từ các mẫu đá tại tỉnh Nghệ An, một vùng có nguồn tài nguyên khoáng sản phong phú với trữ lượng đá vôi trên 1 tỷ tấn. Mục tiêu cụ thể là tuyển chọn các chủng vi khuẩn bản địa có hoạt tính tạo calcite cao, phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam, đồng thời xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu trong quy mô phòng thí nghiệm nhằm phát triển xi măng sinh học ứng dụng thực tiễn. Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2022 đến tháng 6/2023 tại Phòng Vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới, TP. Hồ Chí Minh.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc khai thác nguồn vi sinh vật bản địa để phát triển công nghệ xây dựng xanh, giảm phát thải khí nhà kính và tăng cường độ bền vật liệu xây dựng, góp phần thúc đẩy phát triển bền vững ngành xây dựng Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết MICP (Microbe Inducing Calcite Precipitation): Quá trình vi sinh vật tạo kết tủa calcite thông qua thủy phân urea bằng enzyme urease, làm tăng pH môi trường và tạo điều kiện kết tủa CaCO₃ trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Quá trình này gồm bốn giai đoạn chính: thủy phân urea, tăng pH, hấp thụ ion Ca²⁺ và hình thành tinh thể calcite.

• Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology - RSM): Kỹ thuật thống kê dùng để tối ưu hóa các yếu tố môi trường nuôi cấy vi khuẩn nhằm đạt hiệu suất tạo calcite cao nhất. Thiết kế thí nghiệm Box-Behnken được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng và tương tác của các biến như nhiệt độ, nồng độ urea và nồng độ calcium.

• Thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman: Dùng để sàng lọc các yếu tố môi trường có ảnh hưởng chính đến quá trình tạo calcite, giúp giảm số lượng thí nghiệm cần thiết.

Các khái niệm chính bao gồm: enzyme urease, nồng độ vi khuẩn (CFU/mL), pH môi trường, nồng độ urea và calcium, hoạt tính tạo tủa calcite, và các chỉ số đo lường như khối lượng calcite (g/L).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 7 mẫu đá được thu thập từ các mỏ đá vôi tại tỉnh Nghệ An, Việt Nam. Từ các mẫu này, 12 chủng vi khuẩn có khả năng tạo calcite được phân lập.

• Phương pháp phân tích: Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường đặc biệt (B4, UCB) và đánh giá khả năng tạo tủa calcite bằng phương pháp cân khối lượng calcite sau 7-14 ngày nuôi cấy. Hoạt tính enzyme urease được định lượng bằng phương pháp Phenol-hypochloride. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR và giải trình tự gen 16S rDNA).

• Thiết kế thí nghiệm: Sử dụng thiết kế Plackett-Burman để sàng lọc các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tạo calcite, tiếp theo tối ưu hóa các yếu tố chính bằng thiết kế Box-Behnken trong RSM.

• Timeline nghiên cứu: Từ tháng 12/2022 đến tháng 6/2023, bao gồm phân lập vi khuẩn, đánh giá hoạt tính, tối ưu điều kiện nuôi cấy và thử nghiệm ứng dụng trong cố định cát.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn: 12 chủng vi khuẩn tạo calcite được phân lập từ 7 mẫu đá tại Nghệ An. Chủng Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 được chọn làm ứng viên chính do có sản lượng tủa calcite cao nhất đạt 15,86 g/L.

2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường: Các điều kiện tối ưu cho hoạt tính tạo calcite của NSNA1.6 là pH 8, nhiệt độ 40°C, nồng độ Ca²⁺ từ CaCl₂ là 250 mM, nồng độ urea 400 mM và mật độ vi khuẩn 10⁸ CFU/mL. Sau tối ưu bằng RSM, sản lượng calcite tăng lên 16,9 g/L, cao hơn khoảng 6,6% so với điều kiện ban đầu.

3. Thử nghiệm ứng dụng: Ngâm cột cát với dung dịch vi khuẩn NSNA1.6 và hỗn hợp CaCl₂ + urea (tỉ lệ 1:1) trong 14 ngày cho thấy tính thấm của cột cát giảm đáng kể, chứng tỏ khả năng kết dính cát nhờ sự hình thành calcite.

4. Định danh và đặc điểm vi khuẩn: Vi khuẩn NSNA1.6 thuộc loài Lysinibacillus fusiformic, có khả năng tạo bào tử giúp tồn tại lâu dài trong môi trường khắc nghiệt, phù hợp cho ứng dụng công nghiệp.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy vi khuẩn bản địa từ Nghệ An có tiềm năng lớn trong công nghệ MICP, phù hợp với điều kiện khí hậu và nguồn nguyên liệu địa phương. Sản lượng calcite đạt được tương đương hoặc vượt trội so với các nghiên cứu quốc tế sử dụng các chủng vi khuẩn nhập khẩu. Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng RSM giúp tăng hiệu quả tạo calcite, đồng thời giảm chi phí và thời gian nghiên cứu.

Thí nghiệm cố định cát minh chứng cho ứng dụng thực tiễn của vi khuẩn trong gia cố đất và vật liệu xây dựng, góp phần giảm thiểu tác động môi trường so với phương pháp truyền thống. Các biểu đồ đường chuẩn ammonium chloride và đồ thị đáp ứng bề mặt minh họa rõ ràng mối quan hệ giữa các yếu tố môi trường và sản lượng calcite, hỗ trợ đánh giá chính xác và tối ưu hóa quy trình.

So với các nghiên cứu trước đây, luận văn đã bổ sung dữ liệu về vi khuẩn bản địa và áp dụng thiết kế thí nghiệm thống kê hiện đại, nâng cao tính ứng dụng và khả năng nhân rộng công nghệ MICP tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình nuôi cấy quy mô công nghiệp: Áp dụng điều kiện tối ưu pH 8, nhiệt độ 40°C, nồng độ CaCl₂ 250 mM, urea 400 mM và mật độ vi khuẩn 10⁸ CFU/mL để sản xuất vi sinh vật tạo calcite với sản lượng cao, phục vụ cho các dự án xây dựng và gia cố đất trong vòng 12 tháng tới.

2. Ứng dụng trong sửa chữa và gia cố vật liệu xây dựng: Sử dụng vi khuẩn Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 để xử lý các vết nứt trên bê tông và xi măng, giảm chi phí bảo trì và tăng tuổi thọ công trình, ưu tiên triển khai tại các công trình xây dựng ở miền Trung Việt Nam trong 2 năm tới.

3. Mở rộng nghiên cứu ứng dụng trong xử lý môi trường: Khai thác khả năng kết tủa calcite để cố định kim loại nặng và chống xói mòn đất, phối hợp với các đơn vị môi trường để thử nghiệm thực địa trong vòng 18 tháng.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật MICP cho cán bộ kỹ thuật và doanh nghiệp xây dựng, đồng thời xây dựng quy trình chuẩn để nhân rộng công nghệ trên toàn quốc trong 3 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Khoa học Môi trường: Nghiên cứu sâu về vi sinh vật tạo calcite, phương pháp tối ưu hóa nuôi cấy và ứng dụng công nghệ MICP trong xây dựng và xử lý môi trường.

2. Doanh nghiệp xây dựng và vật liệu xây dựng: Áp dụng công nghệ sinh học để cải thiện độ bền và khả năng tự phục hồi của vật liệu, giảm chi phí bảo trì và tăng tính bền vững công trình.

3. Cơ quan quản lý môi trường và phát triển bền vững: Tham khảo giải pháp công nghệ xanh, thân thiện môi trường trong xử lý đất và nước, góp phần giảm phát thải khí nhà kính.

4. Các tổ chức đào tạo và chuyển giao công nghệ: Sử dụng luận văn làm tài liệu giảng dạy, đào tạo kỹ thuật và phát triển các dự án ứng dụng công nghệ MICP tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Vi khuẩn Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 có ưu điểm gì so với các chủng khác?
   Chủng này có khả năng tạo calcite với sản lượng lên đến 16,9 g/L sau tối ưu, chịu được điều kiện pH và nhiệt độ cao, đồng thời có khả năng tạo bào tử giúp tồn tại lâu dài trong môi trường khắc nghiệt.

2. Điều kiện nuôi cấy tối ưu để tạo calcite là gì?
   Các điều kiện tối ưu gồm pH 8, nhiệt độ 40°C, nồng độ CaCl₂ 250 mM, urea 400 mM và mật độ vi khuẩn 10⁸ CFU/mL, giúp tăng hiệu suất tạo calcite lên khoảng 6,6% so với điều kiện ban đầu.

3. Công nghệ MICP có thể ứng dụng trong những lĩnh vực nào?
   MICP được ứng dụng trong sửa chữa vết nứt bê tông, gia cố đất, xử lý kim loại nặng trong môi trường và chống xói mòn đất, mang lại giải pháp thân thiện môi trường và hiệu quả kinh tế.

4. Phương pháp tối ưu hóa RSM có vai trò gì trong nghiên cứu?
   RSM giúp xác định và tối ưu các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến hoạt tính tạo calcite, giảm số lượng thí nghiệm và nâng cao hiệu quả nghiên cứu, từ đó áp dụng hiệu quả trong sản xuất quy mô lớn.

5. Làm thế nào để bảo quản vi khuẩn tạo calcite lâu dài?
   Vi khuẩn được bảo quản bằng phương pháp giữ ống thạch nghiêng ở 4°C trong khoảng 3 tháng hoặc bảo quản lạnh đông với glycerol 40% ở -70°C trong 1-2 năm, đảm bảo duy trì hoạt tính sinh học.

Kết luận

• Đã phân lập và định danh 12 chủng vi khuẩn tạo calcite từ mẫu đá tại Nghệ An, trong đó Lysinibacillus fusiformic NSNA1.6 có hoạt tính cao nhất với sản lượng calcite đạt 15,86 g/L.
• Điều kiện nuôi cấy tối ưu gồm pH 8, nhiệt độ 40°C, nồng độ CaCl₂ 250 mM, urea 400 mM và mật độ vi khuẩn 10⁸ CFU/mL, giúp tăng sản lượng calcite lên 16,9 g/L sau tối ưu hóa bằng RSM.
• Thử nghiệm ngâm cột cát cho thấy vi khuẩn NSNA1.6 có khả năng giảm tính thấm, chứng minh tiềm năng ứng dụng trong gia cố đất và vật liệu xây dựng.
• Luận văn góp phần phát triển công nghệ MICP sử dụng vi khuẩn bản địa, phù hợp với điều kiện khí hậu và tài nguyên Việt Nam, mở ra hướng nghiên cứu và ứng dụng mới trong xây dựng xanh.
• Đề xuất triển khai nghiên cứu mở rộng, ứng dụng công nghiệp và đào tạo chuyển giao công nghệ trong vòng 1-3 năm tới nhằm thúc đẩy phát triển bền vững ngành xây dựng và môi trường.

Quý độc giả và các đơn vị quan tâm được khuyến khích tiếp cận và ứng dụng kết quả nghiên cứu để phát triển các giải pháp xây dựng và xử lý môi trường hiệu quả, thân thiện với thiên nhiên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TONG QUAN 1. Téng quan tia calcite Calcite là khoáng chat carbonate được xem là dang bền nhất của CaCOs, là thành phần phô biến trong đá trầm tích, như đá vôi, phần lớn được tạo thành từ vỏ của các loài sinh vật biên đã chết. Xấp xi 10% đá trầm tích là đá vôi. Calcite là khoáng vật chính trong đá hoa biến chất, xuất hiện ở các mạch khoáng trong mỏ đá ở các suối nước nóng và thường tôn tại trong hang đá như là thạch nhũ và măng đá.

Calcite cũng có thể được thấy ở trong đá núi lửa, đá xuất xứ từ manti như carbonatite, kimberlite, nhưng tồn tại ít ở peridotite. Calcite thường là thành phần chính của vỏ các loài sinh vật biên, như sinh vật phù du (gai vôi và trùng có lỗ, phần cứng của tảo đỏ). Có hơn 300 loại calcite được tìm thấy với các dang và màu sắc khác nhau. Tinh thé calcite có dạng hình thoi nhọn đến tù, dạng phẳng, lăng trụ, hoặc hình tam giác lệch.

Ngoài ra, calcite cũng tồn tại đưới dang thé sợi, hình hộp, lát mỏng, hoặc khối đặc (Hazen và Robert, 2004). Màu sắc giao động từ vàng đồng, da cam, màu quả mâm xôi, hồng diệu đến tim hoa cà, nâu, xanh da trời và thậm chí xanh lá cây. Biến thé calcite trong suốt được gọi là “Calcite quang học” hay “Spat Aixolen”; loại tinh thé có tinh chất rất đặc biệt có thé “phân đôi” hình anh do các tính lưỡng chiết quang cao. Calcite giống như các muối carbonate, phần lớn sẽ bị hòa tan trong các loại acid và giải phóng khí carbon dioxide (Sharp và ctv, 1965).

Calcite cũng có thê bị hòa tan bởi nước ngầm hoặc lắng đọng bởi nước ngầm, điều này phụ thuộc vào các yếu tố như nhiệt độ nước (ít tan hơn trong nước khi nhiệt độ tăng), độ pH và nồng độ ion hòa tan (Sharp và ctv, 1965). Khi điều kiện hòa tan thuận lợi, việc loại bỏ calcite có thé làm tăng đáng ké độ xốp và độ thấm của đá. Khi điều này tiếp tục trong một thời gian dài, sự hình thành các hang động có thể xảy ra. Calcite cũng xuất hiện như một khoáng chat dang mach trong tram tích từ suối nước nóng và trong các hang động dưới dạng nhũ đá và măng đá như hang Snowy River Caver ở Lincoln County, New Mexico (River, 2004).

Cũng có thể thấy 2 mối liên hệ chặt chẽ giữa sự phát triển của vi sinh vật và sự kết tủa của các khoáng chat này, bao gồm các hồ hình tế bào (D) và vách ngăn (E); Mặc dù những tỉnh thể này đã được rửa sạch khỏi tế bào vi khuẩn trước SEM, nhưng sự liên kết chặt chẽ giữa vi khuẩn và tỉnh thể có thể được nhìn thấy bởi sự xuất hiện và tiếp tục bám cua tế bào với tinh thể (F) (Banks và ctv, 2010). Tong quan vi khuẩn tạo kết tủa calcite Quá trình khoáng hoá do sinh học tạo nên thường được thực hiện trong môi trường mở và quá trình này thường liên quan đến cấu trúc bề mặt tế bào vi sinh vật và các hoạt động trao đôi chất dẫn đến sự gia tăng độ kiềm của môi trường, do đó tạo điều kiện cho kết tủa calcite. Trong số các hoạt động trao đôi chất này, phô biến nhất là quá trình thuỷ phân urea được xúc tác bởi các enzyme urease. Tuy nhiên việc có được tinh thé calcite nhờ vi khuẩn phải chịu anh hưởng bởi đa yếu tố khác nhau, bao gồm: (i) nồng độ calcium, (11) nồng độ carbon hoà tan, (iii) độ pH của môi trường và (iv) các vị trí tâm hoạt động có sẵn trên bề mặt vi khuẩn (De Muynck và ctv, 2010).

Các yêu tô nông độ calcium, nông độ carbon hoà tan, độ pH của môi trường anh hưởng trực tiếp đến vi khuẩn cũng như quá trình tạo tủa calcite nên các chủng tiềm năng cần tìm phải đáp ứng được các yếu tô này. Ngoài ra, một số vấn đề khác phải được quan tâm đến khi tuyên chọn các chúng vi khuẩn sử dụng cho các thí nghiệm gồm có: (i) Tính an toàn của các chủng vi khuẩn, những vi khuẩn được chọn sử dung phục vụ con người phải an toàn sinh học và không gây bệnh, (ii) Có khả năng tồn tại lâu dai trong môi trường và chịu được các điều kiện khắc nghiệt trong vật liệu. Chính vì vậy, hiện nay khi sàng lọc các vi khuẩn tạo tủa calcite các nhà nghiên cứu ưu tiên hướng đến những vi khuẩn có khả năng tạo bào tử, bào tử vi khuẩn có thé tồn tại hàng trăm năm dưới dạng tiềm an qua giai đoạn khắc nghiệt và khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mam va phát triển (Anbu và ctv, 2016). Một số chủng vi khuan có khả năng tạo tủa có thé kê đến như: Bacillus sp.

CR2 được phân lập từ đất ham mỏ Urumdji, Trung Quốc dùng calcium chloride là nguồn calcium bé sung cho quá trình MICP, loài vi khuan này cho hoạt tinh urease là 432 U/mL và sản xuất ra nhiều calcite (Achal and Pan, 2014); B. pasteurii NCIM 2477 nằm trong bộ sưu tập vi sinh vật công nghiệp quốc gia, Pune, An Độ với hoạt tính urease là 18 U/mL, được phát hiện là loài sản xuất urease cao nhất và là tác nhân hiệu quả gây lắng dong calcite trên bé mat gach (Sarada va ctv, 2009); K. flava CR1 được phân lập từ đất tại mỏ quặng, Urumai, Trung Quốc (Achal và ctv, 201 1), trong nghiên cứu này cho thấy K. flava CRI đã tạo ra một lượng đáng ké urease (472 U/mL ) va đã loại bỏ 95% đồng khỏi đất bị 6 nhiễm; Ö.

megaterium SS3 phân lập từ đất đá vôi tại Andhra Pradesh, An Độ (Dhami và ctv, 2013); kết qua phân lập cho thấy vi khuan này sản xuất ra một lượng lớn urease (690 U/mL), ứng dụng B. megaterium SS3 làm xử lý bề mặt sinh học đã làm giảm 40% khả năng hấp thụ nước, giảm 31% độ xốp và tăng 18% cường độ nén của vật liệu xây dựng; Halomonas sp. SR4 được phân lập từ chất thải ở vùng mỏ, Trung Quốc, trong nghiên cứu cho thấy vi khuẩn đã tạo ra lượng urease cao gây ra sự kết tủa calcite góp phần loại bỏ 80% stronti phóng xạ có trong nước thải (Achal và ctv, 2012). Cơ chế tạo kết tua calcite của vi khuẩn Hiện tại, MICP theo sáu cơ chế khác nhau, bao gồm phân giải urea (thủy phân urea), quang hợp, khử sulphat hòa tan, khử nitrat, amon hóa các axit amin và oxy hóa metan.

Trong số sáu con đường, MICP định hướng phân giải urea là phương pháp ít phức tạp nhất và được nghiên cứu nhiều nhất đã trải qua nhiều phân tích kỹ thuật và công nghệ sinh học (Harkes va ctv, 2010), (Maheswaran và ctv 2014), (Omoregie va ctv, 2019). Quá trình hình thành kết tủa calcite nhờ vi khuẩn có thé được chia thành 4 giai đoạn: (i) thủy phân urea, (ii) sự gia tăng pH môi trường, (iii) sự hấp thụ ion Ca?" lên bề mặt, (iv) hình thành tinh thé calcite. Những chủng vi khuẩn có kha năng kết tủa qua con đường phân giải urea đặc trưng bởi khả năng tông hợp enzyme urease. Cơ chế cụ thé của từng giai đoạn được mô tả qua các phản ứng sau Enzyme ureare của vi sinh vật thuỷ phan urea dé tạo ra (CO3” ) và (NHT” ), làm tăng nồng độ pH và nồng độ (CO¿? ), sau đó cùng với (Ca?') trong môi trường tao tủa dưới dang CaCO; (Kim va ctv, 2012).

-78% của vi khuẩn COOH + NEG (PT 1) NH2COOH + HO — NH; + H2COs (PT 2) Hai sản phẩm NH3 và HạCO› tiếp tục được cân bang trong nước tạo dạng bicarbonate, ammonium và ion hydroxide (PT 3 va 4). Tiếp theo, phản ứng thuận nghịch này sẽ tạo kết tủa với các ion kim loại. Sự hình thành NH¡” làm tăng pH cục bộ đồng thời phản ứng tiếp tục xảy ra tạo kết tủa calcite (Kim và ctv, 2012). Kết tủa calcite được diễn ra ở bề mặt tế bào vi khuẩn nếu dat đủ cả hai nồng độ Ca?" và CO3* trong dung dich.

Ca?" + tế bào vi khuẩn tế bao- Ca?" (PT 6) Ca?! + COs? > CaCO (PT 7) > Cl —>NH,CI CO(NH;); Substrate Hình 1. Mô hình tóm tắt vai trò của vi khuân phân giải urea trong quá trình kết tủa calcite khi có nồng độ ion Ca?! (Al-Thawadi, 2008). Các quá trình liên quan đến sự kết tủa calcite là: (A) thủy phân urea (PT 1, 2 & 3), (B) tăng độ kiềm (PT 4), (C) sự hap phụ bê mặt của các ion Ca”` (PT 5,6) và ( D) sự tạo mâm và sự lớn lên của tinh thé (PT 7). EPS là viét tat của extra-polysaccharide trong trường hợp có sự hiện điện của EPS bao quanh các tê bào phân giải urea.

; Hoạt động sản sinh enzyme urease của hau hét các vi khuan đêu liên quan đên các gen ureA, ureB và ureC, các gen nằm gần nhau và được sắp xếp từ nhỏ đến lớn (Mobley và ctv, 1995). Tuy nhiên, cấu trúc urease của vi khuẩn Helicobacter pylori lại khá độc đáo, chỉ bao gồm hai đơn vi con; mã hóa bởi gen wreA và gen ureB (Akada và ctv, 2000). Ngoài các gen cấu trúc, các loài vi khuẩn khác nhau, chang hạn như Proteus mirabilis, Klebsiella aerogenes, Bacillus sp. ngoại trừ Bacillus subtilis, đã thém cac gen phu lién quan đến việc lắp ráp vị trí hoạt động phụ thuộc niken của enzym trong hệ thống operon của chúng.

Trong trường hợp của Bacillus subtilis, câu trúc tô chức của operon urease bao gồm ba gen cấu trúc wreABC (Wray va ctv, 1997). Các gen phụ bên cạnh operon có thé suy đoán rằng các gen đó nam trong một operon độc lập ở nơi khác trong bộ gen. Gen điều hòa duy nhất của operon urease được xác định cho đến nay là ureR, được tìm thấy trong operon của Proteus mirabilis. Urease từ vi sinh vật này được tạo ra bởi sự hiện điện của urease và người ta đã chứng minh rằng urease là một chất hoạt hóa tích cực liên kết với chất xúc tiễn của urea (Nicholson và ctv, 1993).

Vai trò của MICP Sửa chữa vết nứt Levrel và ctv (1999) là nhóm nghiên cứu đầu tiên sửa chữa vết nứt bằng phương pháp sinh học. Tác giả đã sử dụng chủng Bacillus cereus đê hàn gắn vết nứt trên mẫu đá Tuffeau. Gần đây nhất, Jongvivatsakul và ctv (2019) đã sử dung Bacillus sphaericus (LMG 22257) theo phương pháp nhỏ giọt dé tiến hành han gắn các vết nứt trên những mẫu vữa. Kết quả sau 20 ngày cho thấy LMG 22257 giúp giảm §5% diện tích vết nứt so với mẫu đối chứng.

Phương pháp nhỏ giọt lên bề mặt sẽ không đảm bảo rằng kết tủa được hình thành từ sâu bên trong vết nứt mà có thể chỉ xuất hiện ở bề mặt.