Tổng quan luận án
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Bệnh ung thư hiện là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới, chỉ đứng sau nhóm bệnh về tim mạch. Mỗi năm, căn bệnh này cướp đi sinh mạng của khoảng 8 triệu người, chiếm xấp xỉ 15% tổng số ca tử vong trên phạm vi toàn cầu. Theo các dự báo từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), trong vòng hai thập kỷ tiếp theo, toàn cầu có thể ghi nhận thêm 22 triệu ca mắc mới và số ca tử vong có thể chạm mốc 13 triệu người mỗi năm. Tại Việt Nam, số liệu thống kê của tổ chức GLOBOCAN năm 2020 chỉ ra rằng có khoảng 182.563 ca mắc mới và 122.690 trường hợp tử vong do ung thư; tính trung bình trong 100.000 dân thì có 159 người được chẩn đoán mắc mới và 106 người tử vong vì bệnh lý này. Ở nam giới Việt Nam, các loại ung thư phổ biến nhất bao gồm ung thư phổi, dạ dày, đại trực tràng và tiền liệt tuyến (chiếm khoảng 65,8% tổng số các ca ung thư). Ở nữ giới, các bệnh ung thư phổ biến hàng đầu là ung thư phổi, đại trực tràng, dạ dày và gan (chiếm khoảng 59,4%). Xét trên cả hai giới, các loại ung thư có tỷ lệ mắc cao nhất gồm ung thư phổi, vú, dạ dày và đại trực tràng. Mặc dù các phương pháp điều trị truyền thống như hóa trị, phẫu thuật và xạ trị đã đạt được nhiều bước tiến, các biện pháp này vẫn tồn tại những hạn chế nhất định về độc tính và hiệu quả lâu dài.
Song song với gánh nặng ung thư, tình trạng gia tăng của các bệnh nhiễm trùng và sự xuất hiện của các chủng vi sinh vật kháng thuốc đang trở thành mối quan ngại nghiêm trọng đối với hệ thống y tế toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Tình trạng vi khuẩn kháng lại các loại kháng sinh hiện hành đặt ra nguy cơ đưa nhân loại quay trở lại giai đoạn khó điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn thường gặp như viêm phổi, lao, lậu và nhiễm khuẩn do Salmonella. Thực trạng này đặt ra yêu cầu cấp bách về việc nghiên cứu và phát triển các loại thuốc mới có hiệu lực cao, an toàn và có tính chọn lọc đối với tế bào đích.
Trong nghiên cứu phát triển dược phẩm, các hợp chất có hoạt tính sinh học phân lập từ tự nhiên đóng vai trò là chất dẫn đường quan trọng. Hai hợp chất tự nhiên nhận được sự quan tâm rộng rãi là gossypol (phân lập từ cây bông vải) và zerumbone (phân lập từ cây gừng gió Zingiber zerumbet). Cả hai khung cấu trúc này đều đã được chứng minh là có hoạt tính sinh học đa dạng, đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn. Tuy nhiên, các công bố khoa học liên quan đến việc tổng hợp và đánh giá hoạt tính của các dẫn xuất mới, đặc biệt là các dẫn xuất dạng hydrazone trên cơ sở hai phân tử dẫn đường này, vẫn còn rất khiêm tốn tại Việt Nam. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài luận án "Nghiên cứu tổng hợp, đánh giá hoạt tính sinh học các dẫn xuất hydrazone mới của (-) - gossypol và zerumbone" đã được thực hiện nhằm khai thác và biến đổi cấu trúc của hai hợp chất tự nhiên trên để tạo ra các dẫn xuất hydrazone có hiệu lực sinh học cao hơn.
Mục tiêu nghiên cứu
Luận án xác định 4 mục tiêu cụ thể được đánh số như sau:
- Tách đồng phân (-)-gossypol từ hỗn hợp gossypol racemic.
- Tổng hợp các dẫn xuất mới hydrazone của (-)-gossypol.
- Tổng hợp các dẫn xuất mới hydrazone của zerumbone.
- Đánh giá hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư và kháng khuẩn của các dẫn xuất tổng hợp được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Hợp chất gossypol racemic thương mại; đồng phân quang học đối quang (-)-gossypol; hợp chất zerumbone tinh khiết được chiết xuất từ thân rễ cây gừng gió (Zingiber zerumbet Smith); các amin thơm, dẫn xuất hydrazine, dẫn xuất hydrazide; cùng hệ thống các dẫn xuất base Schiff và hydrazone mới được tổng hợp từ (-)-gossypol và zerumbone.
- Phạm vi nghiên cứu:
- Phạm vi nội dung: Quy trình tách đồng phân đối quang gossypol sử dụng D-tryptophan methyl ester hydrochloride; quy trình phản ứng tổng hợp hóa học tạo khung hydrazone và base Schiff; các phương pháp xác định cấu trúc hóa học (phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, phổ tương quan hai chiều COSY, HSQC, HMQC, HMBC, NOESY, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, phổ hồng ngoại IR, phổ lưỡng sắc tròn CD, năng suất quay cực riêng, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC); khảo sát hoạt tính sinh học in vitro gồm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người (như Hep-G2, MCF-7, HCT-116, PC-3, A549, HeLa,...) và hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định.
- Thời gian và không gian thực hiện: Nghiên cứu được hoàn thành tại Bộ môn Hóa dược và Bảo vệ thực vật, Bộ môn Hóa hữu cơ thuộc Viện Kỹ thuật Hóa học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, phối hợp cùng Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên (VAST) và Cục Bảo vệ thực vật; bảo vệ năm 2022.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trước được luận án điểm lại
Luận án đã hệ thống hóa lịch sử và các công bố khoa học trong và ngoài nước liên quan đến ba nhóm nội dung chính: hóa học nhóm chức hydrazone, hóa học và hoạt tính của gossypol, và hóa học và hoạt tính của zerumbone.
1. Hóa học và hoạt tính sinh học của nhóm hydrazone
- Đặc điểm cấu trúc và tự nhiên: Nhóm chức hydrazone (-C=N-N-) được phân biệt với imine và oxime nhờ sự hiện diện của liên kết đơn N-N có độ dài thực tế khoảng 1,38-1,41 Å, ngắn hơn liên kết N-N trong phân tử hydrazine tiêu chuẩn (1,46 Å), trong khi liên kết C=N dao động từ 1,27-1,35 Å. Góc liên kết C=N-N xấp xỉ 120°. Hợp chất hydrazone có thể tồn tại ở các dạng đồng phân hình học syn/anti (cis/trans quanh liên kết C=N), trong đó dạng syn thường chiếm ưu thế bền vững hơn dạng anti. Trong tự nhiên, List và Luft (1967) cùng Pyysalo và Michelot (1989) đã xác định acetaldehyde N-methyl-N-formylhydrazone (AMFH) cùng 9 dẫn xuất N-methyl-N-formyl khác là các thành phần độc tố trong loài nấm Gyromitra esculenta. Đến năm 2006, Suwanborirux và cộng sự đã phân lập được alkaloid chứa khung hydrazone có tên cinachyramin từ bọt biển Cinachyrella sp. tại vùng biển Okinawa, thể hiện độc tính tế bào yếu đối với dòng ung thư cổ tử cung HeLa với giá trị IC50 là 6,8 µg/mL.
- Phương pháp tổng hợp: Luận án trích dẫn quy trình của Wang (2011) điều chế 1,3-diimineoisoindolin carbohydrazide (3) từ 4-ethoxy-2-carboxylic ethyl ester; nghiên cứu của Abadi và cộng sự tổng hợp các hydrazone thế 1,3,4 của pyrazole từ 4-bromoacetophenone và 4-nitrophenylhydrazine; công trình của Nguyễn Hữu Đĩnh và cộng sự (2010) tổng hợp dãy dẫn xuất hydrazone chứa vòng furoxan từ isoeugenol; nghiên cứu của Ravi Kulandasamy và cộng sự điều chế các hydrazone chứa nhân thiophene (19); nghiên cứu của Gabr và cộng sự (2011) điều chế hydrazone 22 và 23 từ dẫn xuất sulfonamide để thử hoạt tính chống ung thư; cùng nghiên cứu của Fischer và cộng sự tạo hydrazone từ dẫn xuất carbohydrate D-glucuronolactone và D-mannuronolactone.
- Hoạt tính sinh học của dẫn xuất hydrazone:
- Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus: Dẫn xuất hydrazone chứa khung sterol (25, 26) được ghi nhận có nồng độ ức chế nấm Candida albicans ở mức 1,5 µg/mL; Khan và cộng sự tổng hợp các dẫn xuất steroidal hydrazine có hoạt tính kháng khuẩn in vitro; Abdel-Wahab tổng hợp các hợp chất (27-29) kháng 6 dòng vi khuẩn với MIC từ 21,9 đến 43,8 µg/mL; Palekar tổng hợp các chất (30-32) từ terephthalic dihydrazide kháng E. coli và S. typhimurium; Kamal và cộng sự tổng hợp hydrazone chứa khung 1,2,4-benzothiadiazine ức chế vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Rv với giá trị MIC đạt 1 µg/mL; Telvekar và cộng sự phát triển dẫn xuất benzofuran-3-carbohydrazide (33-35) kháng lao; Gemma và cộng sự ghi nhận các hydrazone ức chế 100% dòng H37Rv với MIC < 1 µM; các dẫn xuất chứa khung ferrocene có MIC từ 2,5-5 µg/mL; Kumar và cộng sự (2007) báo cáo dẫn xuất indole-2,3-dione có IC50 = 7,6 µg/mL; Eswaran và cộng sự thử nghiệm hydrazone chứa vòng quinolon (36-38) cho giá trị MIC từ 6,25-25 µg/mL; Imramovský và cộng sự tổng hợp hydrazone chứa nhân ciprofloxacin với MIC đạt 0,78 µg/mL; Secci và cộng sự tổng hợp hydrazone chứa khung thiazole (39-41) ức chế Candida albicans với MIC = 0,25 µg/mL; El-Sabbagh và Rady khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan A (Hepatitis A); Tian và cộng sự tổng hợp các chất (42-44) ức chế protein vỏ ngoài HIV-1 với EC50 từ 0,17 đến 0,21 µM.
- Kháng viêm, giảm đau: Mohamed Eissa (2012) phát triển bishydrazone từ anthranilic acid làm giảm phù chân chuột gây bởi carrageenan từ 1% đến 48,72%; Moldovan và cộng sự phát hiện dẫn xuất phenylthiazole (45-47) ức chế sinh tổng hợp NO mạnh hơn thuốc đối chứng meloxicam.
- Chống ung thư: Dawood và cộng sự tổng hợp dẫn xuất hydrazone của plumbagin (48-50); Aydin tổng hợp dẫn xuất của flurbiprofen ức chế tế bào ung thư bạch cầu HL-60 đạt 66,37% và ung thư buồng trứng OVCAR-4 đạt 77,34%; Cui và cộng sự (2010) phát hiện arylhydrazone chứa vòng furan có IC50 = 16,4 µM trên dòng ung thư HL-60, mạnh hơn thuốc đối chứng doxorubicin (IC50 = 53,3 µM).
- Tác dụng lên thần kinh và tim mạch: Soyer-Gölçü và cộng sự (2013) phát hiện dẫn xuất hydrazone của benzoxazone ức chế enzyme MAO-B với hằng số Ki đạt 35,44 và 24,20 nM; Leal và cộng sự chứng minh hoạt tính chống tăng huyết áp thông qua thụ thể adenosine A2A; Mashayekhi (2013) ghi nhận dẫn xuất hydrazone chứa indole và diathiazole ức chế kết tập tiểu cầu với IC50 = 3 µM; Lima và cộng sự khảo sát các hợp chất chứa đồng thời hydrazone, sulfonate và amine chống kết tập tiểu cầu.
2. Hóa học và hoạt tính sinh học của Gossypol
- Lịch sử và cấu trúc: Gossypol (51) có tên IUPAC là 1,1',6,6',7,7'-hexahydroxy-5,5'-diisopropyl-3,3'-dimethyl-[2,2'-binaphthalene]-8,8'-dicarbaldehyde, được Longmore mô tả lần đầu năm 1886, sau đó Marchlewski nghiên cứu năm 1899, Roger Adams xác định cấu trúc vào cuối thập niên 1930 và Edwards khẳng định bằng phương pháp tổng hợp toàn phần năm 1958. Phân tử gồm hai nhân naphthyl liên kết qua trục C2-C2' với góc nhị diện 70°-90°, tạo nên tính bất đối xứng trục và hai đồng phân đối quang (+)-gossypol và (-)-gossypol. Gossypol tồn tại ở ba dạng biến thể hỗ biến (tautomer): dialdehyde (51a), diketone (51b) và lactol/hemiacetal (51c). Dạng 51a chiếm ưu thế trong các dung môi như chloroform, acetone hay dioxane; trong khi dung môi DMSO-d6 thì dạng lactol 51c chiếm tỷ lệ lớn nhất (dạng 51a chỉ chiếm khoảng 13%). Quá trình acid hóa về pH ≤ 1 làm cân bằng chuyển dịch sang dạng lactol 51c; trong cồn phân tử lượng thấp, phản ứng tách nước có thể tạo thành anhydrogossypol (52).
- Hoạt tính sinh học: Gossypol được nghiên cứu tránh thai ở nam giới tại Trung Quốc trong thập niên 1970 trên quy mô gần 8.000 người; có khả năng kháng nấm sợi (Aspergillus flavus, A. parasiticus, Fusarium); kháng virus có vỏ như HIV-1 và HSV-2 (Roger và cs. xác định (-)-gossypol có IC50 = 5,2 µM, mạnh hơn nhiều so với (+)-gossypol có IC50 = 50,7 µM); ức chế tế bào ung thư tiền liệt tuyến (PC-3, DU-145, LAPC-4 với IC50 từ 3-5 mmol/L) thông qua cơ chế kích hoạt protein p53 và gây tổn thương DNA.
- Biến đổi hóa học của gossypol: Haas và cộng sự tổng hợp dẫn xuất methyl hóa (52-54) bằng methyl iodide với hiệu suất từ 43% đến 91%; James và cộng sự dùng dimethyl sulfate tạo tetramethyl ether (54) và hexamethyl ether (55, 56); phản ứng tạo dẫn xuất O-glycoside tetraacetate (57, 58); Yang và cộng sự tổng hợp base Schiff của gossypol gắn amino acid kháng HIV-1 và virus cúm H5N1; Lu và cộng sự tổng hợp các base Schiff chứa chuỗi kỵ nước ức chế các dòng tế bào DU-145, MCF-7, HCT-116 với IC50 từ 2-4 µM thông qua tương tác với protein Bcl-2; Li và cộng sự tổng hợp base Schiff dạng enamin kháng virus trên cây khoai tây. Về phân giải quang hoạt, Jiang và cộng sự đã phát triển phương pháp dùng amino acid ester như phenylalanine methyl ester để tạo diastereomer rồi tách bằng sắc ký hoặc kết tinh.
3. Hóa học và hoạt tính sinh học của Zerumbone
- Đặc điểm cấu trúc: Zerumbone (107) là một sesquiterpene ketone vòng 11 cạnh, công thức phân tử C15H22O (M = 218,33458 g/mol), tên IUPAC là (2E,6E,10E)-2,6,9,9-tetramethylcycloundeca-2,6,10-trien-1-one. Hợp chất được phân lập lần đầu bởi Dev S. năm 1960 từ cây gừng gió (Zingiber zerumbet Smith, hàm lượng đạt 37,5% trong tinh dầu). Trung tâm tạo hoạt tính là nhóm ketone α,β-không no liên hợp chéo.
- Các hướng biến đổi hóa học: Luận án chia các nghiên cứu biến đổi hóa học của zerumbone thành 3 hướng chính:
- Biến đổi mở vòng hoặc thu hẹp vòng zerumbone: Nghiên cứu của nhóm Kitagawa và cộng sự (1980-2003) và Matthes.
- Chuyển hóa giữ nguyên kích thước vòng: Phản ứng tạo imine, hydrazone, khử nhóm carbonyl C=O, hoặc phản ứng cộng hợp Michael vào vị trí liên kết đôi liên hợp.
- Tạo thêm nhóm chức hoặc dị vòng trên khung zerumbone: Kumar và cộng sự điều chế azazerumbone bằng phản ứng chuyển vị Beckmann; Chinh và cộng sự (2015) ghép nối zerumbone với 2',4'-dihydroxychalcone qua cầu nối 1,2,3-triazole và trimethylene (hợp chất 128 và 131) cho hoạt tính độc tế bào trên Hep-G2, LU, MCF-7, P338, SW480 với giá trị IC50 từ 0,58-1,01 µg/mL.
- Hoạt tính sinh học của zerumbone: Ting-Yi Chien chứng minh tác dụng kháng viêm trên mô hình chuột ở liều 1 và 5 mg/kg đường uống; hoạt tính kháng khuẩn được thể hiện qua giá trị MIC của zerumbone, zerumbol, azazerumbone, zerumbone oxime trên các chủng Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica; hoạt tính ức chế trên 17 dòng tế bào ung thư (Rahman và cộng sự); ức chế phiên mã yếu tố NF-κB do phản ứng cộng hợp Michael của nhóm thiol (-SH) trong protein vào nối đôi liên hợp; kích hoạt con đường chết rụng apoptosis phụ thuộc caspase-3 và PARP, ức chế phosphoryl hóa FOXO1 và Akt, phân cắt Notch, giảm biểu hiện VEGF; Sakinah và cộng sự chứng minh zerumbone làm tăng biểu hiện protein pro-apoptotic Bax và kìm hãm protein chống chết rụng Bcl-2 trên dòng ung thư gan HepG2.
Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết
Mặc dù các tài liệu quốc tế đã chứng minh đồng phân quang học (-)-gossypol có hoạt lực sinh học vượt trội so với dạng (+)-gossypol và hỗn hợp racemic, việc nghiên cứu tách chiết quang hoạt và tổng hợp các dẫn xuất hydrazone mới từ (-)-gossypol tinh khiết quang học vẫn chưa được thực hiện đầy đủ tại Việt Nam. Tương tự, zerumbone là nguồn tài nguyên dồi dào từ cây gừng gió mọc hoang tại các tỉnh miền núi phía Bắc, song việc biến đổi hóa học nhóm chức carbonyl của hợp chất này thành các dẫn xuất hydrazone chứa nhân thơm thế khác nhau nhằm tăng cường độc tính chọn lọc trên tế bào ung thư còn thiếu các dữ liệu thực nghiệm toàn diện. Do đó, luận án tập trung giải quyết khoảng trống này bằng cách xây dựng quy trình phân lập (-)-gossypol từ hỗn hợp racemic, tổng hợp các dãy hydrazone mới của (-)-gossypol và zerumbone, đồng thời đánh giá mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học (SAR) của các hợp chất tạo thành.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết và khái niệm áp dụng
- Lý thuyết phân giải đối quang thông qua tạo chất đối phân (diastereomer): Dựa trên nguyên tắc cho hỗn hợp đối quang biến dịch racemic phản ứng với một tác nhân bất đối quang tinh khiết (D-tryptophan methyl ester) để tạo thành cặp diastereomer có tính chất hóa lý, độ tan và khả năng kết tinh khác nhau, từ đó tách riêng biệt và thu hồi đồng phân quang hoạt đích (-)-gossypol qua quá trình thủy phân.
- Hóa học lập thể và cân bằng hỗ biến (tautomerism): Phân tích sự chuyển dịch cân bằng giữa dạng dialdehyde, diketone, lactol của phân tử gossypol trong các môi trường dung môi khác nhau; phân tích cân bằng hỗ biến enamin - imine của các dẫn xuất base Schiff và hydrazone của gossypol.
- Cơ chế phản ứng ngưng tụ tạo hydrazone: Phản ứng cộng ái nhân của nhóm hydrazide hoặc amine bậc một vào nhóm carbonyl (aldehyde của gossypol hoặc ketone của zerumbone), tiếp theo là phản ứng tách loại phân tử nước để hình thành liên kết C=N.
- Thuyết tương quan cấu trúc - hoạt tính (SAR): Đánh giá mức độ ảnh hưởng của các nhóm thế hút electron (halogen: -F, -Cl) và nhóm thế đẩy electron (-CH3, -OCH3) trên nhân thơm của dẫn xuất hydrazone tới khả năng gây độc tế bào ung thư và ức chế vi sinh vật kiểm định.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp tổng hợp và tinh chế hóa học:
- Kỹ thuật hồi lưu nhiệt độ, khuấy từ ở nhiệt độ phòng.
- Sử dụng xúc tác acid (H2SO4, CH3COOH) hoặc xúc tác muối Lewis (ZnCl2).
- Kiểm tra tiến trình phản ứng và độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck - Đức), hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc sử dụng thuốc thử phun hiện màu là dung dịch H2SO4 10% rồi hơ nóng ở 100°C.
- Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp kết tinh lại phân đoạn và sắc ký cột (CC) pha thường với chất nhồi silica gel (Merck).
- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo phổ 1H-NMR và 13C-NMR trên máy Bruker AVANCE, sử dụng chất chuẩn nội tetramethylsilane (TMS) và dung môi pha đo (như DMSO-d6, CDCl3). Xác định độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) và hằng số tương tác spin-spin (J, Hz). Thực hiện các phổ tương quan hai chiều COSY, HSQC, HMQC, HMBC, NOESY khi cần giải mã các cấu trúc phức tạp.
- Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): Xác định chính xác khối lượng ion phân tử, từ đó khẳng định công thức nguyên của các dẫn xuất mới tổng hợp.
- Phổ hồng ngoại (IR): Xác định các nhóm chức đặc trưng (-OH, C=O, C=N, N-H, nhân thơm).
- Đo độ quay cực riêng ([α]D): Xác định độ tinh khiết quang học của (-)-gossypol và các dẫn xuất quang hoạt.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Đánh giá độ tinh khiết và kiểm soát quá trình phân tách các đồng phân quang học.
- Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học:
- Phương pháp thử độc tính tế bào in vitro: Đánh giá khả năng ức chế sự sinh trưởng của các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy trong môi trường DMEM sử dụng thuốc thử MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) hoặc thuốc thử huỳnh quang sulforhodamine B (SRB). Kết quả được biểu thị thông qua nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào (IC50 hoặc GI50).
- Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn và vi nấm kiểm định theo phương pháp pha loãng liên tiếp trên phiến vi lượng.
Nguồn hóa chất và mẫu vật
- Gossypol nguyên liệu: Hãng AK Scientific.
- D-tryptophan methyl ester hydrochloride: Hãng Merck.
- Zerumbone: Chiết tách và cung cấp từ Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - VAST).
- Các dẫn xuất amine và acid hữu cơ: 4-chlorobenzylamine (98%), 4-fluorobenzylamine (98%), 4-methylbenzylamine (98%), 4-methoxybenzylamine (98%), hydrazine hydrate (80%), 2-fluorobenzoic acid (98%), 3-fluorobenzoic acid (98%), 4-fluorobenzoic acid (98%), 3-methylbenzoic acid (97-98%), 2-fluorophenylacetic acid (98%), 3-fluorophenylacetic acid (98%), 4-fluorophenylacetic acid (98%), 2-chlorophenylacetic acid (98%), 4-chlorophenylacetic acid (98%), 2-methoxybenzoic acid (98%) từ hãng Merck và hóa chất thương mại tiêu chuẩn.
- Các dung môi, muối vô cơ: ZnCl2, triethylamine, Na2SO4, NaHCO3, H2SO4 98%, HCl 37%, acetic acid, ethanol, methanol, ethyl acetate, dichloromethane, n-hexane.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 cung cấp nền tảng lý thuyết và cơ sở tài liệu gồm ba phần chính:
- Tổng quan về Hydrazone: Phân tích đặc điểm cấu trúc phẳng của liên kết C=N-N, các yếu tố ảnh hưởng tới độ dài liên kết và độ bền base của các alkyl và aryl hydrazone; sự chuyển dịch đồng phân hình học dạng syn và anti; phân lập các hydrazone trong tự nhiên từ nấm Gyromitra esculenta và bọt biển Cinachyrella sp.; các phương pháp tổng hợp hữu cơ thông dụng và phổ hoạt tính sinh học phong phú (kháng khuẩn, kháng vi khuẩn lao H37Rv, kháng nấm, kháng virus HIV-1 và HAV, kháng viêm thông qua ức chế sinh tổng hợp NO, độc tính tế bào ung thư, ức chế enzyme MAO-B và chống kết tập tiểu cầu).
- Tổng quan về Gossypol: Trình bày chi tiết nguồn gốc tự nhiên từ hạt bông (Gossypium); lịch sử nghiên cứu từ Longmore (1886) đến Edwards (1958); cấu trúc dimer chứa hai nhân sesquiterpene liên kết C2-C2' với tính bất đối xứng trục sinh ra hai đồng phân (+)-gossypol và (-)-gossypol; cân bằng giữa 3 dạng hỗ biến dialdehyde (51a), diketone (51b) và lactol (51c); hoạt tính tránh thai nam giới; hoạt tính kháng nấm sợi gây độc (Aspergillus flavus); hoạt tính kháng virus; và đặc biệt là độc tính ức chế chọn lọc trên các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt (LAPC-4, PC-3, DU-145). Chương này cũng điểm lại các nhóm dẫn xuất biến đổi cấu trúc của gossypol như dẫn xuất methyl hóa, O-glycoside và nhóm dẫn xuất base Schiff/hydrazone.
- Tổng quan về Zerumbone: Khái quát nguồn gốc thực vật từ cây gừng gió (Zingiber zerumbet Smith); cấu trúc ketone sesquiterpene vòng 11 cạnh chứa ba liên kết đôi trans; các hướng biến đổi hóa học chính (mở/thu hẹp vòng, giữ nguyên kích thước vòng, ghép thêm nhóm chức dị vòng); hoạt tính kháng viêm in vivo trên chuột; hoạt tính kháng khuẩn; và cơ chế ức chế tế bào ung thư thông qua ức chế yếu tố phiên mã NF-κB, ức chế các kinase Akt, giải phóng cytochrome C từ ty thể, hoạt hóa caspase-3, PARP và kích hoạt con đường chết theo chương trình apoptosis.
Dưới đây là một số bảng số liệu quan trọng được luận án tổng kết từ các công trình trước:
Bảng 1: Hoạt tính in vitro của các base Schiff từ gossypol trên một số dòng tế bào ung thư (trích dẫn từ Lu và cộng sự)
| Hợp chất | DU-145 (IC50, µM) | MCF-7 (IC50, µM) | HCT-116 (IC50, µM) | CT-26 (IC50, µM) |
|---|---|---|---|---|
| 84 | 17,16 ± 4,17 | > 100 | > 100 | 12,76 ± 1,21 |
| 85 | > 100 | > 100 | > 100 | 5,40 ± 0,33 |
| 96 | 17,68 ± 1,11 | > 100 | 0,52 ± 0,78 | > 100 |
| 97 | 6,23 ± 0,35 | 8,24 ± 0,57 | 7,75 ± 0,99 | 29,70 ± 1,23 |
| 98 | 9,47 ± 0,87 | 5,64 ± 0,89 | 5,24 ± 1,21 | 4,25 ± 0,25 |
| 99 | 2,39 ± 0,31 | 4,39 ± 0,46 | 2,75 ± 1,01 | 8,39 ± 0,98 |
| 100 | 7,36 ± 2,05 | 8,22 ± 1,20 | 3,38 ± 2,32 | 16,59 ± 3,01 |
| 101 | 8,56 ± 2,44 | 11,46 ± 0,52 | 0,64 ± 0,35 | 13,75 ± 1,27 |
| 102 | 11,42 ± 1,27 | 8,95 ± 0,21 | 13,12 ± 2,58 | 5,59 ± 0,49 |
Bảng 2: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của zerumbone và một số dẫn xuất kháng khuẩn
| Hợp chất | B. cereus (µM) | S. aureus (µM) | E. coli (µM) | Y. enterocolitica (µM) |
|---|---|---|---|---|
| Zerumbone | 429 | 536 | 322 | 1073 |
| Zerumbol | 257 | 215 | 322 | 536 |
| Azazerumbone | 322 | 429 | 322 | 536 |
| Zerumbone oxime | 257 | 429 | 429 | 644 |
Chương 2: Thiết bị, dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
Chương này mô tả chi tiết:
- Danh mục thiết bị: Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker, cân phân tích điện tử Ohaus Explorer Pro EP613C (độ chính xác 10^-3 g) và EP4102C (độ chính xác 10^-2 g), các dụng cụ thủy tinh chuyên dụng (bình cầu 3 cổ, ống sinh hàn, phễu nhỏ giọt, cột sắc ký).
- Hệ thống hóa chất: Bảng thống kê chi tiết 43 loại hóa chất, dung môi công nghiệp và dung môi tinh khiết dùng cho phản ứng, sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.
- Các quy trình thực nghiệm: Quy trình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột pha thuận (silica gel), phương pháp đo năng suất quay cực và quy trình thử nghiệm sinh học (đo độc tính tế bào ung thư theo phương pháp MTT/SRB và thử nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định theo phương pháp vi pha loãng).
Chương 3: Thực nghiệm
Chương 3 trình bày các quy trình tổng hợp hóa học cụ thể được triển khai trong luận án:
- Tách đồng phân (-)-gossypol từ gossypol racemic:
- Điều chế sản phẩm cộng diastereomer giữa gossypol racemic và D-tryptophan methyl ester hydrochloride trong dung môi ethanol với sự có mặt của triethylamine.
- Tách riêng diastereomer (-)-gossypol-(D-tryptophan methyl ester)2 và (+)-gossypol-(D-tryptophan methyl ester)2 dựa trên sự khác biệt về độ tan và kết tinh.
- Thủy phân sản phẩm cộng diastereomer trong môi trường acid để thu hồi S-(+)-gossypol và R-(-)-gossypol tinh khiết quang học.
- Tổng hợp các dẫn xuất base Schiff và hydrazone của (-)-gossypol:
- Quy trình tổng hợp dãy base Schiff 138a-d: Cho (-)-gossypol phản ứng với các dẫn xuất benzylamine mang nhóm thế khác nhau (4-chloro, 4-fluoro, 4-methyl, 4-methoxy) trong dung môi EtOH ở nhiệt độ phòng trong 8 giờ; hiệu suất phản ứng đạt từ 60,7% đến 81,8%.
- Quy trình tổng hợp dãy hydrazone 142a-e: Dẫn xuất benzoic acid thế được ester hóa trong MeOH (xúc tác H2SO4, hồi lưu 12 giờ), chuyển thành benzohydrazide tương ứng bằng hydrazine hydrate 80% trong EtOH (khuấy ở nhiệt độ phòng 10 giờ), sau đó cho phản ứng ngưng tụ với (-)-gossypol trong EtOH có mặt xúc tác ZnCl2 ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ; hiệu suất đạt từ 50,4% đến 63,0%.
- Quy trình tổng hợp dãy hydrazone 146a-e: Tương tự quy trình trên nhưng xuất phát từ các dẫn xuất phenylacetic acid thế, phản ứng ngưng tụ với (-)-gossypol sử dụng xúc tác ZnCl2 trong thời gian 12 giờ; hiệu suất đạt từ 48,7% đến 53,0%.
- Tổng hợp các dẫn xuất hydrazone của zerumbone:
- Quy trình tổng hợp dãy hydrazone 150a-f và 154a-f: Zerumbone tinh khiết được cho phản ứng ngưng tụ với các dẫn xuất benzohydrazide hoặc phenylacetohydrazide trong dung môi EtOH, sử dụng xúc tác acid acetic (CH3COOH) ở nhiệt độ phòng trong 8 giờ. Dãy 150a-f đạt hiệu suất từ 52% đến 64%; dãy 154a-f đạt hiệu suất từ 65% đến 76%.
Chương 4: Kết quả và thảo luận
Chương 4 tập trung biện luận cấu trúc hóa học và phân tích các kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học:
- Phân tách và xác định cấu trúc đồng phân quang học gossypol: Luận án biện giải sự thành công của quy trình phân giải quang hoạt gossypol racemic thông qua phổ 1H-NMR, 13C-NMR của sản phẩm cộng (-)-diastereomer (137) và của (-)-gossypol tự do. Đánh giá độ tinh khiết quang học qua sắc ký HPLC và năng suất quay cực riêng.
- Biện luận cấu trúc các dẫn xuất của (-)-gossypol: Phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của các base Schiff 138a-d (chứng minh sự tồn tại ưu thế của dạng tautomer enamin thay vì dạng imine thông qua tín hiệu proton liên kết hydro nội phân tử), các phổ của dẫn xuất hydrazone 142c, 142e, 146d.
- Biện luận cấu trúc các hydrazone của zerumbone: Phân tích chi tiết phổ 1H-NMR, 13C-NMR và phổ giãn của các hợp chất tiêu biểu như 150f, 154e, chứng minh sự tạo thành liên kết hydrazone tại nhóm carbonyl C=O của vòng zerumbone mà vẫn bảo toàn nguyên vẹn khung sesquiterpene 11 cạnh.
- Đánh giá hoạt tính sinh học và khảo sát mối quan hệ cấu trúc - tác dụng (SAR):
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dãy hợp chất trên nhiều dòng tế bào ung thư người.
- Khảo sát hoạt tính ức chế đối với một số chủng vi khuẩn kiểm định.
- Thảo luận mối tương quan cấu trúc - hoạt tính (SAR) dựa trên bản chất các nhóm thế: phân tích ảnh hưởng của nhóm hút electron clo (-Cl), nhóm fluoro (-F) và các nhóm đẩy electron (-CH3, -OCH3) trên nhân thơm đối với hiệu lực gây độc tế bào ung thư.
Bảng 3: Tổng hợp các dãy dẫn xuất hydrazone và base Schiff mới được tổng hợp trong luận án
| Dãy hợp chất | Khung cấu trúc nền | Tác nhân ngưng tụ | Điều kiện phản ứng | Hiệu suất tổng hợp |
|---|---|---|---|---|
| 138a-d | (-)-Gossypol | Dẫn xuất benzylamine thế | EtOH, nhiệt độ phòng, 8 giờ | 60,7 - 81,8% |
| 142a-e | (-)-Gossypol | Dẫn xuất benzohydrazide | EtOH, xúc tác ZnCl2, nhiệt độ phòng, 16 giờ | 50,4 - 63,0% |
| 146a-e | (-)-Gossypol | Dẫn xuất phenylacetohydrazide | EtOH, xúc tác ZnCl2, nhiệt độ phòng, 12 giờ | 48,7 - 53,0% |
| 150a-f | Zerumbone | Dẫn xuất benzohydrazide | EtOH, xúc tác CH3COOH, nhiệt độ phòng, 8 giờ | 52,0 - 64,0% |
| 154a-f | Zerumbone | Dẫn xuất phenylacetohydrazide | EtOH, xúc tác CH3COOH, nhiệt độ phòng, 8 giờ | 65,0 - 76,0% |
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học
- Đã thiết lập và hoàn thiện quy trình tách đồng phân quang học đối quang (-)-gossypol từ hỗn hợp racemic gossypol thông qua phản ứng tạo diastereomer với D-tryptophan methyl ester hydrochloride. Quy trình này cung cấp sản phẩm (-)-gossypol có độ tinh khiết quang học cao, được kiểm soát chặt chẽ bằng HPLC và các phương pháp quang phổ.
- Tổng hợp thành công nhiều dãy dẫn xuất mới thuộc nhóm base Schiff (138a-d) và hydrazone (142a-e, 146a-e) của (-)-gossypol, cùng hai dãy hydrazone mới của zerumbone (150a-f, 154a-f). Cấu trúc của tất cả các hợp chất mới đều được xác định rõ ràng thông qua hệ thống phổ nghiệm hiện đại (NMR 1D, 2D, HR-ESI-MS, IR).
- Đóng góp vào lý thuyết hóa học lập thể các hợp chất thiên nhiên: Luận án đã làm sáng tỏ trạng thái cân bằng hỗ biến (tautomerism) của các dẫn xuất base Schiff gossypol trong dung dịch, xác nhận dạng hỗ biến enamin chiếm ưu thế nhờ liên kết hydro nội phân tử bền vững giữa proton nhóm -NH và oxy của nhóm carbonyl/hydroxyl lân cận.
- Cung cấp các dẫn liệu thực nghiệm về mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính (SAR): Luận án làm rõ ảnh hưởng của các nhóm thế hút electron (như -F, -Cl) và nhóm thế đẩy electron (như -CH3, -OCH3) trên vòng thơm của cầu nối hydrazone đối với khả năng gây độc tế bào ung thư và hoạt tính kháng khuẩn.
Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất
- Xây dựng được các quy trình tổng hợp hóa học diễn ra trong điều kiện tương đối êm dịu (nhiệt độ phòng, sử dụng các xúc tác thông dụng như ZnCl2 hoặc acid acetic), quy trình xử lý và tinh chế sản phẩm thuận lợi, hiệu suất phản ứng đạt mức từ trung bình đến khá cao (48,7% đến 81,8%).
- Đã sàng lọc và phát hiện được các dẫn xuất hydrazone có hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh, mở ra hướng ứng dụng các hợp chất tự nhiên sẵn có tại Việt Nam (đặc biệt là zerumbone từ cây gừng gió) làm chất dẫn đường trong nghiên cứu phát triển các tác nhân hóa trị liệu chống ung thư thế hệ mới.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của luận án
- Nghiên cứu mới dừng lại ở việc đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy và các chủng vi khuẩn kiểm định); chưa thực hiện các thử nghiệm dược lý chuyên sâu in vivo trên động vật thực nghiệm để đánh giá dược động học, khả năng hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ.
- Hiệu suất tổng hợp của một số dãy dẫn xuất hydrazone chứa khung (-)-gossypol còn ở mức trung bình (dao động quanh mức 48,7 - 63,0%) do trở ngại lập thể cồng kềnh của bộ khung binaphthyl và độ bền nhạy cảm của các nhóm chức trong phân tử gossypol.
- Các nhóm thế gắn vào nhân thơm của hydrazone chủ yếu tập trung vào các nhóm đơn giản (-F, -Cl, -CH3, -OCH3), chưa mở rộng sang các dị vòng phức tạp hoặc các chuỗi liên kết peptide để đánh giá sâu rộng hơn phổ tác dụng.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Tiếp tục tối ưu hóa điều kiện phản ứng tổng hợp nhằm nâng cao hơn nữa hiệu suất của các phản ứng ngưng tụ hydrazone của (-)-gossypol.
- Mở rộng khảo sát cơ chế phân tử chi tiết của các dẫn xuất hydrazone có hoạt tính cao nhất (như sự biến đổi protein Bax/Bcl-2, sự hoạt hóa hệ enzyme caspase-3, caspase-9, hoặc con đường truyền tín hiệu NF-κB).
- Lựa chọn các dẫn xuất tiềm năng nhất để thử nghiệm độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và hiệu lực kháng u trên mô hình động vật thí nghiệm (in vivo).
Giá trị tham khảo
Đối tượng thụ hưởng
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Hóa học, Hóa dược: Là tài liệu học thuật giá trị về kỹ thuật tổng hợp hữu cơ các hợp chất thiên nhiên phức tạp, phương pháp phân giải hỗn hợp racemic tạo đồng phân quang hoạt, và kỹ năng phân tích phổ NMR, MS để giải mã cấu trúc tautomer enamin/imine.
- Giảng viên và các nhà nghiên cứu: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình thực nghiệm, điều kiện phản ứng tạo khung hydrazone sử dụng các hệ xúc tác ZnCl2, CH3COOH, và các dữ liệu so sánh hoạt tính sinh học in vitro.
- Các viện nghiên cứu dược liệu và doanh nghiệp phát triển thuốc: Nguồn dữ liệu khoa học về tiềm năng khai thác nguồn hoạt chất tự nhiên từ cây gừng gió (Zingiber zerumbet) và hạt bông nhằm định hướng phát triển các sản phẩm dược phẩm điều trị ung thư và nhiễm khuẩn.
Các nội dung đáng tham khảo nhất
- Quy trình phân lập đồng phân (-)-gossypol bằng D-tryptophan methyl ester tại [Mục 3.1, Trang 41-44].
- Dữ liệu quy trình thực nghiệm và phổ nghiệm chi tiết của các dãy hợp chất hydrazone 142a-e, 146a-e, 150a-f, 154a-f tại [Chương 3 và Chương 4].
- Khung biện luận và phân tích trạng thái cân bằng hỗ biến enamin - imine của base Schiff gossypol tại [Chương 4].
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao luận án phải thực hiện quy trình phân tách đồng phân (-)-gossypol mà không sử dụng trực tiếp gossypol racemic thương mại?
Theo các nghiên cứu dược lý được luận án tổng quan (điển hình như công bố của Roger và cộng sự), hai đồng phân quang học đối quang của gossypol có hiệu lực sinh học hoàn toàn khác nhau. Trong đó, đồng phân (-)-gossypol có hoạt tính kháng virus (IC50 = 5,2 µM đối với HIV-1) và hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh hơn vượt trội so với đồng phân (+)-gossypol (IC50 = 50,7 µM) cũng như dạng racemic. Do đó, việc tách riêng dạng (-)-gossypol tinh khiết là bắt buộc để nâng cao hiệu lực sinh học và độ tinh khiết quang học của các dẫn xuất tổng hợp tiếp theo.
2. Tác nhân nào được sử dụng để phân giải quang hoạt gossypol racemic và quy trình diễn ra theo nguyên lý nào?
Luận án sử dụng D-tryptophan methyl ester hydrochloride làm tác nhân bất đối quang để phản ứng với gossypol racemic trong dung môi ethanol với sự hỗ trợ của triethylamine. Phản ứng tạo ra hai chất đối phân diastereomer tương ứng là (-)-gossypol-(D-tryptophan methyl ester)2 và (+)-gossypol-(D-tryptophan methyl ester)2. Do hai diastereomer này có độ tan và tính chất kết tinh khác nhau, chúng được tách riêng bằng phương pháp kết tinh lại/sắc ký, sau đó tiến hành thủy phân trong môi trường acid để thu hồi đồng phân quang hoạt (-)-gossypol tự do.
3. Trung tâm phản ứng quyết định hoạt tính của phân tử zerumbone nằm ở vị trí nào và cấu trúc này tham gia tương tác sinh học ra sao?
Trung tâm hoạt tính của zerumbone nằm ở nhóm ketone α,β-không no liên hợp chéo trong vòng 11 cạnh. Vị trí liên kết đôi liên hợp với nhóm carbonyl có khả năng tham gia phản ứng cộng hợp ái nhân Michael với nhóm thiol (-SH) của các gốc cysteine trên các protein đích trong tế bào ung thư, từ đó làm bất hoạt chức năng của các protein này, ức chế yếu tố phiên mã NF-κB và thúc đẩy tế bào ung thư đi vào con đường chết rụng (apoptosis).
4. Các dẫn xuất hydrazone của zerumbone (150a-f và 154a-f) được tổng hợp trong điều kiện thực nghiệm nào và hiệu suất đạt được là bao nhiêu?
Các dẫn xuất hydrazone 150a-f và 154a-f được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ giữa zerumbone với các dẫn xuất benzohydrazide (dãy 150) hoặc phenylacetohydrazide (dãy 154) trong dung môi ethanol, sử dụng xúc tác acid acetic (CH3COOH) ở nhiệt độ phòng, thời gian phản ứng là 8 giờ. Hiệu suất tổng hợp của dãy 150a-f đạt từ 52% đến 64%, trong khi dãy 154a-f đạt hiệu suất cao hơn, từ 65% đến 76%.
5. Dạng hỗ biến (tautomer) nào chiếm ưu thế ở các dẫn xuất base Schiff của (-)-gossypol khi phân tích trên phổ NMR?
Qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR, luận án khẳng định các dẫn xuất base Schiff của (-)-gossypol tồn tại chủ yếu ở dạng hỗ biến enamin chứ không phải dạng imine. Cấu trúc enamin được làm bền vững nhờ hệ liên hợp và liên kết hydro nội phân tử mạnh hình thành giữa proton của nhóm amine (-NH) với nhóm carbonyl hoặc hydroxyl liền kề trên nhân naphthalene.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Vũ Văn Vụ đã hoàn thành việc nghiên cứu phân lập đồng phân đối quang (-)-gossypol từ gossypol racemic và tổng hợp thành công các dãy dẫn xuất mới dạng base Schiff và hydrazone của (-)-gossypol cũng như của zerumbone với hiệu suất từ 48,7% đến 81,8%. Cấu trúc hóa học và đặc tính lập thể của các sản phẩm tổng hợp được xác định bằng các phương pháp phân tích phổ nghiệm hiện đại (NMR 1D, 2D, HR-ESI-MS, HPLC, đo độ quay cực). Kết quả đánh giá sinh học in vitro đã chứng minh tiềm năng ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn của các dẫn xuất hydrazone mới, đồng thời cung cấp các dữ liệu thực nghiệm có giá trị về mối liên quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của hai khung phân tử tự nhiên gossypol và zerumbone.