Luận án: Hoạt tính sinh học dẫn xuất hydrazone của gossypol và zerumbone - ĐH Bách khoa Hà Nội

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu tổng hợp đánh giá hoạt tính sinh học các dẫn xuất hydrazone mới của gossypol và zerumbone, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng

• Tác giả: Vũ Văn Vụ
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Khắc Vũ
• Trường học: Đại Học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Của Các Dẫn Xuất Hydrazone Mới Từ Gossypol Và Zerumbone
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ hóa học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. GIỚI THIỆU VỀ HYDRAZONE
• 1.2. Cấu trúc và tính chất vật lý của hydrazone
• 1.3. Các đồng phân của hydrazone
• 1.4. TỔNG QUAN VỀ GOSSYPOL
• 1.5. TỔNG QUAN VỀ ZERUMBONE
• 2. CHƯƠNG 2: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU
• 2.2. HÓA CHẤT DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
• 2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG TỔNG HỢP VÀ TINH CHẾ
• 2.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC
• 2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP
• 2.6. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 2.6.1. Phương pháp độc tế bào
• 2.6.2. Phương pháp kháng vi sinh vật kiểm định
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
• 3.1. TÁCH ĐỒNG PHẦN (-) GOSSYPOL TỪ GOSSYPOL RACEMIC
• 3.1.1. Điều chế (-)-gossypol và (+)-gossypol diasteriomer của D-triptophan methyl ester
• 3.1.2. Điều chế S-(+)-gossypol
• 3.1.3. Điều chế R-(-)-gossypol
• 3.2. TỔNG HỢP CÁC HYDRAZONE CỦA (-) GOSSYPOL
• 3.3. TỔNG HỢP CÁC ZERUMBONE HYDRAZONE
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. TÁCH ĐỒNG PHÂN (-) GOSSYPOL VÀ (+) GOSSYPOL TỪ GOSSYPOL RACEMIC
• 4.2. TỔNG HỢP CÁC HYDRAZONE CỦA GOSSYPOL
• 4.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HYDRAZONE CỦA GOSSYPOL
• 4.4. TỔNG HỢP CÁC HYDRAZONE CỦA ZERUMBONE
• 4.5. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HYDRAZONE ZERUMBONE
• 4.6. LIÊN QUAN CẤU TRÚC - TÁC DỤNG VỀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HYDRAZONE
• NHỮNG CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Dẫn Xuất Hydrazone

Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydrazone đang ngày càng thu hút sự chú ý, đặc biệt trong bối cảnh tìm kiếm các hợp chất mới có tiềm năng ứng dụng trong y học và nông nghiệp. Hydrazone, với cấu trúc hóa học đặc trưng chứa nhóm chức -C=N-NH2, thể hiện nhiều hoạt tính dược lý hứa hẹn, bao gồm khả năng kháng khuẩn, kháng ung thư, và chống oxy hóa. Nghiên cứu này tập trung vào việc tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydrazone mới từ hai hợp chất tự nhiên quan trọng: Gossypol và Zerumbone. Việc kết hợp cấu trúc hydrazone với Gossypol và Zerumbone có thể tạo ra những hợp chất có hoạt tính sinh học vượt trội so với các hợp chất gốc. Bài viết này sẽ đi sâu vào các khía cạnh của nghiên cứu này, từ tổng quan lý thuyết đến kết quả thực nghiệm và thảo luận.

1.1. Cấu Trúc và Đặc Tính Cơ Bản Của Hydrazone

Hydrazone là một nhóm hợp chất hữu cơ quan trọng, được hình thành từ phản ứng giữa hydrazin hoặc các dẫn xuất của nó với aldehyde hoặc ketone. Cấu trúc chung của hydrazone bao gồm một liên kết đôi carbon-nitơ (C=N) gắn với nhóm amin (-NH2), tạo nên một khung phân tử linh hoạt và có khả năng tương tác với nhiều mục tiêu sinh học khác nhau. Theo tài liệu, phân tích tinh thể của các hydrazone cho thấy các nguyên tử thuộc nhóm chức hydrazone nằm trong cùng mặt phẳng. Cấu trúc hydrazone có thể tồn tại ở dạng đồng phân hình học (E/Z), tạo ra sự đa dạng về không gian và ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của chúng.

1.2. Ứng Dụng Tiềm Năng Của Dẫn Xuất Hydrazone Trong Y Học

Dẫn xuất hydrazone thể hiện một loạt các hoạt tính sinh học quan trọng, bao gồm hoạt tính kháng ung thư, hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính chống oxy hóa, và hoạt tính chống viêm. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng dẫn xuất hydrazone có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế khác nhau, chẳng hạn như gây độc tế bào, ức chế quá trình phân chia tế bào, và kích hoạt quá trình tự hủy. Ngoài ra, dẫn xuất hydrazone cũng có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, bao gồm cả vi khuẩn kháng thuốc, mở ra tiềm năng phát triển các loại thuốc kháng sinh mới. Cấu trúc hydrazone có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn và kháng virus.

II. Vấn Đề Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Của Gossypol Zerumbone

Gossypol, một polyphenol tự nhiên chiết xuất từ cây bông vải, và Zerumbone, một sesquiterpene từ gừng gió, đều là những hợp chất có tiềm năng lớn trong y học. Tuy nhiên, độc tính của Gossypol và khả năng hòa tan hạn chế của Zerumbone đã hạn chế ứng dụng của chúng. Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo ra các dẫn xuất hydrazone mới từ Gossypol và Zerumbone, nhằm cải thiện hoạt tính sinh học và giảm thiểu các tác dụng phụ không mong muốn. Việc tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydrazone gossypol và dẫn xuất hydrazone zerumbone sẽ góp phần mở rộng phạm vi ứng dụng của hai hợp chất này trong điều trị bệnh.

2.1. Giới Thiệu Chi Tiết Về Hợp Chất Gossypol

Gossypol là một hợp chất polyphenol có nguồn gốc từ cây bông vải (Gossypium). Phân tử gossypol có sáu nhóm hydroxyl phenolic và hai nhóm aldehyde. Các dạng tautomer của gossypol: dialdehyde (51a), diketone (51b) và dilactol (51c). Gossypol đã được nghiên cứu rộng rãi về hoạt tính sinh học, bao gồm hoạt tính kháng ung thư, hoạt tính kháng virus, và hoạt tính chống oxy hóa. Tuy nhiên, độc tính của Gossypol là một vấn đề đáng quan tâm. Do sự quay của liên kết internaphthyl bị hạn chế, gossypol là một hợp chất bất đối, có hai đồng phân quang hoạt (+) - và (-) - gossypol.

2.2. Giới Thiệu Chi Tiết Về Hợp Chất Zerumbone

Zerumbone là một sesquiterpene được chiết xuất từ thân rễ của cây gừng gió (Zingiber zerumbut). Cấu trúc của zerumbone rất độc đáo với một ketone liên hợp chéo trong một vòng có 11 nguyên tử carbon. Zerumbone đã được chứng minh là có khả năng kháng viêm, kháng khuẩn, và chống oxy hóa. Zerumbone được nghiên cứu rộng rãi với nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Ngoài ra, zerumbone còn có tác dụng điều hòa miễn dịch, chống viêm loét dạ dày.

2.3. Tại Sao Cần Nghiên Cứu Dẫn Xuất Hydrazone Của Gossypol Zerumbone

Việc tạo ra các dẫn xuất hydrazone từ Gossypol và Zerumbone có thể mang lại nhiều lợi ích, bao gồm cải thiện hoạt tính sinh học, giảm độc tính, và tăng cường khả năng hòa tan. Cấu trúc hydrazone có thể tương tác với nhiều mục tiêu sinh học khác nhau, tạo ra các hợp chất có hoạt tính dược lý đa dạng. Tổng hợp hydrazone là một hướng đi tiềm năng để phát triển các loại thuốc mới từ các hợp chất tự nhiên. Nghiên cứu này đánh giá hoạt tính sinh học hydrazone gossypol và hoạt tính sinh học hydrazone zerumbone.

III. Phương Pháp Tổng Hợp Dẫn Xuất Hydrazone Từ Gossypol Zerumbone

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp tổng hợp hóa học hiện đại để tạo ra các dẫn xuất hydrazone mới từ Gossypol và Zerumbone. Các phương pháp này bao gồm phản ứng ngưng tụ giữa Gossypol hoặc Zerumbone với hydrazin hoặc các dẫn xuất hydrazin, sử dụng các chất xúc tác và điều kiện phản ứng khác nhau để tối ưu hóa hiệu suất và độ chọn lọc. Các sản phẩm tổng hợp được tinh chế và xác định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích hóa học hiện đại như spectroscopy NMR, chromatography sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và spectroscopy khối phổ (MS).

3.1. Quy Trình Chi Tiết Tổng Hợp Dẫn Xuất Hydrazone Gossypol

Việc tổng hợp hydrazone gossypol được thực hiện thông qua phản ứng giữa nhóm aldehyde của gossypol với hydrazin hoặc các dẫn xuất hydrazin thích hợp. Phản ứng thường được xúc tác bởi acid hoặc base, và điều kiện phản ứng được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu suất cao và độ chọn lọc tốt. Sau phản ứng, sản phẩm được tinh chế bằng các phương pháp sắc ký cột hoặc kết tinh lại. Các phương pháp spectroscopy được sử dụng để xác định cấu trúc của sản phẩm dẫn xuất hydrazone gossypol.

3.2. Quy Trình Chi Tiết Tổng Hợp Dẫn Xuất Hydrazone Zerumbone

Tương tự, việc tổng hợp hydrazone zerumbone được thực hiện thông qua phản ứng giữa nhóm ketone của zerumbone với hydrazin hoặc các dẫn xuất hydrazin. Phản ứng có thể được xúc tác bằng acid hoặc base, và điều kiện phản ứng được điều chỉnh để đạt được hiệu suất và độ chọn lọc cao nhất. Sản phẩm sau phản ứng được tinh chế bằng các phương pháp sắc ký hoặc kết tinh lại. Phân tích spectroscopy được sử dụng để xác định cấu trúc của sản phẩm dẫn xuất hydrazone zerumbone.

IV. Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Các Dẫn Xuất Hydrazone Mới

Các dẫn xuất hydrazone mới được tổng hợp được đánh giá hoạt tính sinh học bằng nhiều phương pháp in vitro, bao gồm đánh giá hoạt tính kháng ung thư trên các dòng tế bào ung thư khác nhau, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn gây bệnh, và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng các phương pháp đo lường khả năng khử các gốc tự do. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học được phân tích thống kê để xác định mối liên hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydrazone. Sàng lọc hoạt tính sinh học được thực hiện để tìm ra các hợp chất có tiềm năng ứng dụng cao nhất.

4.1. Phương Pháp Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Ung Thư In Vitro

Các dẫn xuất hydrazone gossypol và dẫn xuất hydrazone zerumbone được đánh giá hoạt tính kháng ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau, bao gồm tế bào ung thư vú, tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư ruột kết, và tế bào ung thư gan. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng ung thư bao gồm đo lường khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, đo lường khả năng gây độc tế bào, và đo lường khả năng kích hoạt quá trình tự hủy. IC50 (Inhibitory concentration 50) thường được sử dụng để định lượng khả năng ức chế. Đánh giá độc tính tế bào là một bước quan trọng.

4.2. Phương Pháp Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn In Vitro

Các dẫn xuất hydrazone được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh, bao gồm vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bao gồm đo lường nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC). Nghiên cứu cũng đánh giá hoạt tính chống viêm của các hợp chất này.

4.3. Phân Tích Mối Liên Hệ Cấu Trúc Tác Dụng SAR

Phân tích SAR (Structure-Activity Relationship) được sử dụng để xác định mối liên hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydrazone. Phân tích SAR giúp xác định các nhóm chức quan trọng cho hoạt tính sinh học, và giúp thiết kế các dẫn xuất hydrazone mới có hoạt tính sinh học được cải thiện. Dữ liệu về cơ chế hoạt động hydrazone cũng rất quan trọng trong phân tích này.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Hoạt Tính Vượt Trội Của Dẫn Xuất Mới

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số dẫn xuất hydrazone gossypol và dẫn xuất hydrazone zerumbone mới thể hiện hoạt tính sinh học vượt trội so với các hợp chất gốc. Một số dẫn xuất hydrazone thể hiện hoạt tính kháng ung thư mạnh mẽ trên các dòng tế bào ung thư kháng thuốc, trong khi một số khác thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng trên nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh. Các kết quả này mở ra tiềm năng phát triển các loại thuốc mới từ các dẫn xuất hydrazone gossypol và dẫn xuất hydrazone zerumbone.

5.1. Dẫn Xuất Hydrazone Thể Hiện Hoạt Tính Kháng Ung Thư Mạnh Mẽ

Một số dẫn xuất hydrazone gossypol và dẫn xuất hydrazone zerumbone thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư với nồng độ thấp, cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thuốc điều trị ung thư mới. Các hợp chất này có thể tác động lên nhiều mục tiêu sinh học khác nhau trong tế bào ung thư, gây ra quá trình tự hủy hoặc ức chế sự phân chia tế bào.

5.2. Dẫn Xuất Hydrazone Thể Hiện Hoạt Tính Kháng Khuẩn Phổ Rộng

Một số dẫn xuất hydrazone thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau, bao gồm cả vi khuẩn kháng thuốc. Các hợp chất này có thể tác động lên nhiều mục tiêu sinh học khác nhau trong tế bào vi khuẩn, gây ra sự chết của tế bào hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Hydrazone

Nghiên cứu này đã thành công trong việc tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học của một loạt các dẫn xuất hydrazone mới từ Gossypol và Zerumbone. Các kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng lớn của các dẫn xuất hydrazone gossypol và dẫn xuất hydrazone zerumbone trong việc phát triển các loại thuốc mới điều trị ung thư và các bệnh nhiễm trùng. Các nghiên cứu trong tương lai sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa cấu trúc hóa học của các dẫn xuất hydrazone để cải thiện hoạt tính sinh học và giảm độc tính, cũng như đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất này trong các mô hình in vivo.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu Về Hoạt Tính Sinh Học

Nghiên cứu đã xác định được một số dẫn xuất hydrazone mới từ Gossypol và Zerumbone có hoạt tính sinh học hứa hẹn, bao gồm hoạt tính kháng ung thư và hoạt tính kháng khuẩn. Các hợp chất này có thể là tiền đề cho việc phát triển các loại thuốc mới trong tương lai.

6.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Dẫn Xuất Hydrazone

Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc tối ưu hóa cấu trúc hóa học của các dẫn xuất hydrazone để cải thiện hoạt tính sinh học và giảm độc tính, cũng như đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất này trong các mô hình in vivo. Ngoài ra, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của các dẫn xuất hydrazone để hiểu rõ hơn về tác dụng của chúng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Theo số liệu thống kê của GLOBOCAN năm 2020, ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu với 182.563 ca mắc mới và 122.690 ca tử vong tại Việt Nam. Các loại ung thư phổ biến ở nam giới gồm ung thư phổi, dạ dày, đại trực tràng và tiền liệt tuyến (chiếm khoảng 65,8%); ở nữ giới gồm ung thư vú, phổi, đại trực tràng, dạ dày và gan (chiếm khoảng 59,4%). Song song với ung thư, tình trạng nhiễm khuẩn kháng thuốc cũng là thách thức y tế nghiêm trọng. Việc nghiên cứu, phát triển các hoạt chất điều trị có hiệu quả, độ an toàn và tính chọn lọc cao là yêu cầu cấp thiết.

Trong hóa dược, các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đóng vai trò là chất dẫn đường quan trọng. Hai hợp chất tự nhiên được quan tâm nhiều là gossypol (chiết xuất từ hạt bông thuộc chi Gossypium, họ Malvaceae) và zerumbone (sesquiterpene chiết xuất từ thân rễ cây gừng gió Zingiber zerumbet). Gossypol là một polyphenol bất đối xứng tồn tại dưới hai dạng đồng phân đối quang là (+)-gossypol và (-)-gossypol, trong đó đồng phân (-)-gossypol có hoạt tính sinh học cao hơn dạng (+)-gossypol và hỗn hợp racemic. Zerumbone sở hữu cấu trúc ketone liên hợp chéo trong vòng 11 cạnh, có phổ hoạt tính sinh học rộng nhờ nhóm ketone $\alpha,\beta$-không no. Cấu trúc hydrazone (mang nhóm chức $-\text{C}=\text{N}-\text{N}-$) là một khung cấu trúc có hoạt tính sinh học phong phú như kháng khuẩn, chống ung thư, kháng viêm, chống virus và bảo vệ tim mạch. Tuy nhiên, các công bố về việc chuyển hóa, tổng hợp dẫn xuất hydrazone từ (-)-gossypol và zerumbone tại Việt Nam còn hạn chế.

Luận án "Nghiên cứu tổng hợp, đánh giá hoạt tính sinh học các dẫn xuất hydrazone mới của (-)-gossypol và zerumbone" của nghiên cứu sinh Vũ Văn Vụ, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Khắc Vũ tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội (chuyên ngành Hóa học, mã số 9440112, bảo vệ năm 2022), được triển khai nhằm giải quyết khoảng trống này với 4 nhiệm vụ cụ thể:

1. Tách đồng phân (-)-gossypol từ hỗn hợp gossypol racemic.
2. Tổng hợp các dẫn xuất mới hydrazone của (-)-gossypol.
3. Tổng hợp các dẫn xuất mới hydrazone của zerumbone.
4. Đánh giá hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư và vi khuẩn kiểm định của các dẫn xuất tổng hợp được.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là hợp chất gossypol racemic thương mại và zerumbone phân lập từ thân rễ cây gừng gió, cùng các tiền chất hydrazide, amine để tạo các dẫn xuất base Schiff và hydrazone. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào quy trình tách đồng phân quang học, phương pháp tổng hợp hữu cơ các dãy dẫn xuất mới, xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ học hiện đại và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro (hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng vi sinh vật kiểm định).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước xoay quanh ba hợp phần chính: lớp chất hydrazone, hợp chất gossypol và hợp chất zerumbone.

Về hydrazone, văn bản tổng thuật lịch sử phát hiện các hydrazone trong tự nhiên và các hướng tổng hợp nhân tạo:

• Các hydrazone tự nhiên: List và Luft (1967), Pyysalo (1975), Michelot (1991) đã phát hiện và phân lập 9 dẫn xuất $N$-methyl-$N$-formylhydrazone (AMFH) gây độc từ nấm Gyromitra esculenta. Sawa và cộng sự (2006) phân lập alkaloid cinachyramine chứa nhóm hydrazone từ bọt biển Cinachyrella sp. có hoạt tính gây độc tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ($IC_{50} = 6,8\ \mu\text{g/mL}$).
• Các phương pháp tổng hợp và hoạt tính sinh học của hydrazone: Wang (2011) tổng hợp 1,3-diiminoisoindoline carbohydrazide; Abadi và cộng sự (2003) tổng hợp các hydrazone gắn vòng pyrazole; Nguyễn Hữu Đĩnh và cộng sự (2010) tổng hợp dãy hydrazone chứa vòng furoxan từ isoeugenol; Ravi Kulandasamy và cộng sự (2009) tổng hợp dẫn xuất từ thiophene dihydrazide; Gouda và cộng sự (2011) tổng hợp hydrazone chứa nhân pyridine; Fischer và cộng sự (1958) tổng hợp carbohydrate hydrazone.
• Hoạt tính sinh học của hydrazone: Các nghiên cứu đã chứng minh hydrazone có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng lao (Kamal 2006, Telvekar 2008, Gemma 2008, Khan 2007, Eswaran 2009, Imramovský 2007, Nayyar 2014, Mandewale 2017, Secci 2012); kháng virus HIV-1 và HAV (El-Sabbagh & Rady, Tian 2009); kháng viêm và giảm đau (Mohamed Eissa 2012, Moldovan 2011); chống ung thư trên các dòng HL-60, OVAR-4 (Dewi 2012, Aydin 2013, Cui 2010); ức chế enzyme MAO-B liên quan đến bệnh Parkinson (Sivik-Göktas 2013); chống kết tập tiểu cầu và hạ huyết áp (Leal 2008, Mashayekhi 2013, Lima 2008).

Về gossypol, tài liệu điểm lại lịch sử từ khi Longmore mô tả năm 1886, Marchlewski (1899), Roger Adams (1938) xác định cấu trúc và Edwards (1958) tổng hợp toàn phần. Gossypol tồn tại ở 3 dạng tautomer: dialdehyde (51a), diketone (51b) và dilactol (51c). Do sự quay quanh liên kết $C_2-C_2'$ bị cản trở không gian, gossypol có tính đồng phân đối quang gồm $S$-(+)-gossypol và $R$-(-)-gossypol. Các công bố của Jiang và cộng sự (1990) cho thấy (-)-gossypol có hoạt tính kháng u, kháng virus (Lin 1989, Royer 1986) vượt trội so với (+)-gossypol. Các hướng biến đổi hóa học gồm tổng hợp dẫn xuất methyl hóa (Haas, James), dẫn xuất $O$-glycoside (Yin 2011) và base Schiff (Yang 2012, Lu 2016, Li 2014, Stefan'ska 2009, Dao 2000).

Về zerumbone, Dev S. (1960) lần đầu phân lập từ tinh dầu củ gừng gió (Zingiber zerumbet Smith). Các hướng chuyển hóa chính gồm: biến đổi làm vỡ vòng (Kitagawa 1997, Matthes 2003), biến đổi giữ nguyên vòng (tổng hợp imine, hydrazone, khử nhóm carbonyl, phản ứng cộng Michael) và tạo thêm nhóm chức như azazerumbone (Kumar 2012, Vương Văn Trường 2015, Vũ Tiến Chính 2020). Hoạt tính sinh học của zerumbone bao gồm kháng viêm thông qua ức chế NF-$\kappa\text{B}$, giảm đau (Ting-Yi Chien 2016), kháng khuẩn (chủng B. subtilis, S. aureus, E. coli), và ức chế tăng sinh nhiều dòng tế bào ung thư thông qua cơ chế cảm ứng apoptosis, điều hòa biểu hiện Bax/Bcl-2, hoạt hóa caspase-3 và ức chế CXCR4, VEGF (Sakinah 2007, Rahman 2014, Kalantari 2017).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định là: Tại Việt Nam, việc nghiên cứu tách đồng phân quang học (-)-gossypol có độ tinh khiết cao và chuyển hóa chọn lọc nhóm carbonyl của (-)-gossypol cũng như zerumbone thành các dẫn xuất hydrazone chứa khung thơm thế (nhóm $-\text{F}$, $-\text{Cl}$, $-\text{CH}_3$, $-\text{OCH}_3$) nhằm cải thiện hoạt tính gây độc tế bào và khảo sát tương quan cấu trúc - tác dụng (SAR) còn chưa được thực hiện đầy đủ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết hóa học hữu cơ về cân bằng tautomer (keto-enol, aldehyde-lactol, imine-enamine), hóa học lập thể của các phân tử có tính bất đối xứng trục (atropisomerism của gossypol), và phản ứng cộng ái nhân của amine/hydrazide vào nhóm carbonyl. Về mặt sinh học, cơ sở nghiên cứu dựa trên mô hình thử nghiệm độc tế bào in vitro theo cơ chế ức chế phát triển sinh khối protein tế bào và phương pháp khuếch tán thạch đánh giá khả năng ức chế vi sinh vật.

Phương pháp tổng hợp và phân tích hóa học

• Phản ứng tách đồng phân đối quang: Phân giải hỗn hợp racemic ($\pm$)-gossypol bằng chất phân giải quang học D-tryptophan methyl ester hydrochloride tạo cặp diastereoisomer, sau đó thủy phân giải phóng $R$-(-)-gossypol và $S$-(+)-gossypol trong môi trường acid.
• Phương pháp tổng hợp: Phản ứng ngưng tụ giữa (-)-gossypol với các dẫn xuất benzylamine tạo base Schiff; phản ứng ngưng tụ giữa (-)-gossypol hoặc zerumbone với các dẫn xuất benzohydrazide và phenylacethydrazide có xúc tác acid ($\text{CH}_3\text{COOH}$) hoặc muối kim loại ($\text{ZnCl}_2$) trong dung môi ethanol/methanol.
• Tinh chế: Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản nhôm silica gel $60\ \text{F}_{254}$ (Merck), phát hiện vết bằng đèn tử ngoại (254 nm, 365 nm) hoặc dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\ 10%$ hơ nóng ở $100^\circ\text{C}$; sắc ký cột (CC) sử dụng chất nhồi silica gel cỡ hạt $0,040-0,063\ \text{mm}$.

Phương pháp phân tích	Thiết bị / Thông số kỹ thuật	Cơ sở thực hiện
Cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR)	Bruker Advance-500 MHz ($^1\text{H}$: 500 MHz, $^{13}\text{C}$: 125 MHz), dung môi $\text{CDCl}_3$, $\text{CD}_3\text{OD}$, $\text{DMSO-d}_6$, chất chuẩn nội TMS	Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
Khối phổ phân giải cao (HR-ESI-MS)	Agilent 6530 Accurate-Mass Spectrometer	Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
Góc quay cực riêng ($[\alpha]_D^{20}$)	Máy đo phân cực JASCO P-2000 Polarimeter	Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)	Agilent HPLC, đầu dò UV, cột tách pha Chiralpak IG ($4,6 \times 150\ \text{mm}$), pha động Acetonitrile/Nước chứa $0,2%\ \text{CH}_3\text{COOH}$ (55/45 v/v)	Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
Đo điểm nóng chảy	Thiết bị Electrothermal IA 9200	Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

• Thử nghiệm gây độc tế bào in vitro: Áp dụng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) theo hướng dẫn của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) (Monks, 1991). Thử nghiệm thực hiện trên đĩa 96 giếng ở các dải nồng độ 200, 40, 8 và $1,6\ \mu\text{g/mL}$, ủ 48 giờ. Mật độ quang (OD) được đọc tại bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Bio-Rad. Chất đối chứng dương: Ellipticine ($10; 2; 0,4; 0,08\ \mu\text{g/mL}$); đối chứng âm: DMSO 10%. Giá trị $IC_{50}$ được xử lý bằng phần mềm TableCurve 2Dv4. Địa điểm thực hiện: Viện Công nghệ sinh học, VAST.
• Thử nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định: Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (đục lỗ thạch đường kính 9 mm) đo đường kính vòng ức chế ($DK = D - d$, trong đó $D$ là đường kính vòng vô khuẩn, $d$ là đường kính lỗ khoan). Vi sinh vật thử nghiệm gồm: 2 chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC 25931, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027); 3 chủng vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus ATCC 21768, Bacillus subtilis ATCC 6633); 1 chủng nấm men (Candida albicans ATCC 24433). Chất đối chứng dương: Gentamicin ($200\ \mu\text{g/mL}$) cho vi khuẩn và Ciclopirox olamine ($10\ \mu\text{g/mL}$) cho nấm; đối chứng âm: DMSO. Địa điểm thực hiện: Viện Hóa sinh biển, VAST.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này cung cấp hệ thống cơ sở lý thuyết và các nghiên cứu liên quan về cấu trúc, tính chất lý hóa, các dạng đồng phân và hoạt tính sinh học của hydrazone, gossypol và zerumbone. Tác giả trình bày chi tiết về cấu trúc phẳng của nhóm hydrazone, góc liên kết $\text{C}=\text{N}-\text{N}$ xấp xỉ $120^\circ$, độ dài liên kết $\text{C}=\text{N}$ ($1,27-1,35\ \text{Å}$) và $\text{N}-\text{N}$ ($1,38-1,41\ \text{Å}$), cũng như hiện tượng đồng phân hình học syn/anti. Đối với gossypol, chương phân tích ba dạng tautomer aldehyde (51a), ketone (51b), dilactol (51c) và tính chất đồng phân đối quang quang hoạt $R$-(-) và $S$-(+). Đối với zerumbone, chương phân tích cấu trúc sesquiterpene 11 cạnh với ketone $\alpha,\beta$-không no và các con đường chuyển hóa hóa học chính.

Chương 2: Thiết bị, dụng cụ và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết danh mục hóa chất sử dụng (nguồn gốc từ Merck, AK Scientific, hóa chất tinh khiết và công nghiệp Việt Nam, Trung Quốc); hệ thống thiết bị thực nghiệm (NMR 500 MHz, HR-ESI-MS, HPLC phân tích đối quang, máy đo góc quay cực); các quy trình chuẩn bị mẫu, quy trình phản ứng tổng hợp hữu cơ, và quy chuẩn phương pháp thử nghiệm sinh học (phương pháp nhuộm protein bằng SRB và phương pháp khuếch tán giếng thạch).

Chương 3: Thực nghiệm

Chương 3 trình bày các quy trình thực nghiệm chi tiết, bao gồm:

1. Tách đồng phân đối quang: Cho gossypol racemic phản ứng với D-tryptophan methyl ester hydrochloride (tỷ lệ mol 1:2) có mặt $\text{NaOH}$ trong ethanol ở $45^\circ\text{C}$ trong 2 giờ. Thu được sản phẩm cộng diastereoisomer (-)-diastereoisomer 137. Sau đó, xử lý sản phẩm với $\text{HCl}\ 37%$ trong dichloromethane ở điều kiện nhiệt độ $-5\ \text{đến}\ 0^\circ\text{C}$ dưới khí trơ nitrogen trong 72 giờ để thủy phân giải phóng (-)-gossypol với năng suất cao, độ sạch quang học kiểm tra bằng HPLC và góc quay cực $[\alpha]_D^{20} = -106^\circ$ ($c\ 0,160,\ \text{CHCl}_3$).
2. Tổng hợp các base Schiff của (-)-gossypol (dãy 138a-d): Cho (-)-gossypol phản ứng với các dẫn xuất amine thơm (4-chlorobenzylamine, 4-fluorobenzylamine, 4-methylbenzylamine, 4-methoxybenzylamine) trong ethanol ở nhiệt độ phòng trong 8 giờ, hiệu suất đạt từ 60,7% đến 81,8%.
3. Tổng hợp các hydrazone của (-)-gossypol (dãy 142a-e và dãy 146a-e):
   • Dãy 142a-e: Phản ứng ngưng tụ giữa (-)-gossypol với các dẫn xuất benzohydrazide thế (2-F, 3-F, 4-F, 3-$\text{CH}_3$, 4-$\text{CH}_3$) với xúc tác $\text{ZnCl}_2$ trong ethanol ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ, hiệu suất đạt 50,4 - 63,0%.
   • Dãy 146a-e: Phản ứng ngưng tụ giữa (-)-gossypol với các dẫn xuất phenylacethydrazide thế (2-F, 3-F, 4-F, 2-Cl, 3-Cl) với xúc tác $\text{ZnCl}_2$ trong ethanol ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ, hiệu suất đạt 48,7 - 53,0%.
4. Tổng hợp các dẫn xuất hydrazone của zerumbone (dãy 150a-f và dãy 154a-f):
   • Dãy 150a-f: Cho zerumbone phản ứng với các benzohydrazide thế (có các nhóm 2-F, 3-F, 4-F, 2-$\text{OCH}_3$, 3-$\text{CH}_3$, 4-$\text{CH}_3$) trong ethanol có xúc tác acid acetic ở nhiệt độ phòng trong 8 giờ, hiệu suất đạt 52 - 64%.
   • Dãy 154a-f: Cho zerumbone phản ứng với các phenylacethydrazide thế (chứa các nhóm thế 2-F, 3-F, 4-F, 2-Cl, 3-Cl, 4-Cl) trong ethanol có xúc tác acid acetic ở nhiệt độ phòng trong 8 giờ, hiệu suất đạt 65 - 76%.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này tập trung biện luận cấu trúc các chất tổng hợp được và phân tích kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học:

• Tách đồng phân (-)-gossypol: Phân tích phổ HPLC và NMR khẳng định việc tách thành công (-)-gossypol từ hỗn hợp racemic thông qua trung gian D-tryptophan methyl ester với độ tinh khiết quang học cao.
• Xác định cấu trúc các dãy chất mới: Dựa trên phân tích phổ $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR và HR-ESI-MS:
  • Các base Schiff 138a-d tồn tại chủ yếu ở dạng enamine do có liên kết hydro nội phân tử bền vững giữa proton nhóm $-\text{NH}-$ và oxy carbonyl liền kề.
  • Các dẫn xuất hydrazone của (-)-gossypol (142a-e, 146a-e) và zerumbone (150a-f, 154a-f) được chứng minh cấu trúc thông qua sự xuất hiện của các tín hiệu đặc trưng của liên kết $\text{C}=\text{N}-\text{NH}-$, các proton của nhóm thơm và độ chuyển dịch hóa học tương ứng của khung cacbon.
• Kết quả hoạt tính sinh học:
  • Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Các dãy dẫn xuất được sàng lọc trên tập hợp các dòng tế bào ung thư người (như Hep-G2, MCF-7, HCT116, A549, HeLa, PC-3, ACHN, NCI-H23, NUGC-3). Kết quả cho thấy nhiều dẫn xuất hydrazone thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn hợp chất gốc zerumbone và gossypol racemic.
  • Khảo sát tương quan cấu trúc - tác dụng (SAR): Nhóm thế trên vòng thơm của phần hydrazide ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính:
    • Các dẫn xuất chứa nhóm thế hút điện tử halogen (đặc biệt là nhóm fluoro $-\text{F}$ và chloro $-\text{Cl}$) tại các vị trí ortho hoặc para có xu hướng duy trì hoặc làm tăng hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng thử nghiệm.
    • Các dẫn xuất chứa nhóm thế đẩy điện tử ($-\text{CH}_3$, $-\text{OCH}_3$) thể hiện mức độ biến thiên hoạt tính phụ thuộc vào dòng tế bào đích.
  • Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Một số dẫn xuất hydrazone tổng hợp được thể hiện đường kính vòng ức chế rõ rệt trên các chủng vi khuẩn Gram dương (B. subtilis, S. aureus) và vi khuẩn Gram âm (E. coli).

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các kết quả khoa học chính sau:

1. Đã thiết lập và thực hiện thành công quy trình phân giải quang học hỗn hợp gossypol racemic để thu hồi đồng phân quang học $R$-(-)-gossypol có độ tinh khiết cao bằng phương pháp tạo dẫn xuất diastereoisomer với D-tryptophan methyl ester, theo dõi độ tinh khiết bằng HPLC chiral.
2. Đã tổng hợp thành công 4 dãy dẫn xuất hydrazone và 1 dãy base Schiff mới với tổng số 26 hợp chất sạch, bao gồm:
   • 04 dẫn xuất base Schiff của (-)-gossypol (138a-d).
   • 05 dẫn xuất benzohydrazone của (-)-gossypol (142a-e).
   • 05 dẫn xuất phenylacethydrazone của (-)-gossypol (146a-e).
   • 06 dẫn xuất benzohydrazone của zerumbone (150a-f).
   • 06 dẫn xuất phenylacethydrazone của zerumbone (154a-f).
3. Đã xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của tất cả các hợp chất mới tổng hợp bằng các phương pháp phổ học hiện đại ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, HR-ESI-MS, đo góc quay cực riêng).
4. Đã đánh giá hoạt tính sinh học in vitro của các dẫn xuất tổng hợp được về khả năng gây độc tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư người và khả năng ức chế các chủng vi sinh vật kiểm định (Gram âm, Gram dương, nấm men); bước đầu rút ra quy luật tương quan cấu trúc và hoạt tính (SAR) liên quan đến bản chất và vị trí của các nhóm thế fluoro, chloro, methyl, methoxy trên khung hydrazone.

Về kiến nghị, luận án đề xuất tiếp tục lựa chọn các dẫn xuất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động ở mức độ phân tử (như sự biến đổi chu kỳ tế bào, con đường tín hiệu apoptosis, ức chế enzyme đích) và tiến hành thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản luận án phản ánh một số phạm vi và giới hạn nghiên cứu:

• Phạm vi thử nghiệm sinh học mới dừng lại ở các mô hình sàng lọc in vitro (đo giá trị $IC_{50}$ trên tế bào nuôi cấy và đường kính vòng kháng khuẩn trên đĩa thạch), chưa thực hiện thử nghiệm dược lý học trên cơ thể sống (in vivo).
• Nghiên cứu tập trung vào hai chuỗi dẫn xuất chính là benzohydrazone và phenylacethydrazone của (-)-gossypol và zerumbone; chưa mở rộng khảo sát các cấu trúc dị vòng khác hoặc các dẫn xuất thế đa nhóm phức tạp hơn.
• Hướng nghiên cứu tiếp được xác định là: mở rộng thư viện các dẫn xuất hydrazone dị vòng, tiến hành mô phỏng gắn kết phân tử (molecular docking) với các protein mục tiêu (như họ protein Bcl-2 hoặc thụ thể liên quan đến NF-$\kappa\text{B}$), và đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn cùng hiệu quả điều trị trên mô hình khối u ghép thực nghiệm.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo cho:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa học hữu cơ, Hóa dược và Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Cung cấp phương pháp thực nghiệm tách đồng phân đối quang atropisomer của gossypol bằng tác nhân quang hoạt D-tryptophan methyl ester và các quy trình tổng hợp hydrazone có xúc tác chọn lọc.
• Các nhà nghiên cứu phát triển thuốc: Cung cấp bộ dữ liệu phổ đầy đủ ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, phổ giãn, MS, HPLC) của 26 hợp chất mới, cùng các số liệu sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn in vitro, phục vụ cho việc định hướng thiết kế cấu trúc các phân tử có hoạt tính sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án lại lựa chọn tách đồng phân (-)-gossypol thay vì sử dụng gossypol racemic để tổng hợp dẫn xuất? Văn bản nêu rõ rằng gossypol tự nhiên tồn tại ở dạng hỗn hợp racemic gồm (+)-gossypol và (-)-gossypol do sự cản trở quay quanh trục $C_2-C_2'$. Các nghiên cứu dược lý trước đó đã chứng minh đồng phân (-)-gossypol có hoạt tính kháng ung thư, kháng virus và hiệu lực sinh học cao hơn đáng kể so với đồng phân (+)-gossypol và dạng racemic. Do đó, việc tách và sử dụng riêng (-)-gossypol nhằm mục tiêu tạo ra các dẫn xuất có hiệu lực sinh học tối ưu.

2. Hợp chất nào được sử dụng làm tác nhân phân giải quang học để tách (-)-gossypol khỏi hỗn hợp racemic? Tác giả sử dụng D-tryptophan methyl ester hydrochloride phản ứng với gossypol racemic trong môi trường kiềm ($\text{NaOH}$) và ethanol để tạo cặp diastereoisomer. Sau khi phân lập được (-)-diastereoisomer 137, quá trình thủy phân bằng $\text{HCl}\ 37%$ ở nhiệt độ $-5\ \text{đến}\ 0^\circ\text{C}$ trong 72 giờ giải phóng ra (-)-gossypol với góc quay cực $[\alpha]_D^{20} = -106^\circ$.

3. Nhóm chức nào trên phân tử zerumbone đóng vai trò quyết định đến hoạt tính sinh học và là trung tâm phản ứng tổng hợp hydrazone? Nhóm ketone $\alpha,\beta$-không no (ketone liên hợp chéo trong vòng 11 cạnh) là trung tâm hoạt tính sinh học của zerumbone, có khả năng tham gia phản ứng cộng Michael với nhóm $-\text{SH}$ của protein tế bào ung thư. Đây cũng chính là nhóm carbonyl được tác giả sử dụng để thực hiện phản ứng ngưng tụ với các hydrazide tạo liên kết hydrazone ($-\text{C}=\text{N}-\text{NH}-c$).

4. Phương pháp nào được sử dụng để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính tốt là gì? Hoạt tính gây độc tế bào được đánh giá bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) trên đĩa 96 giếng theo chuẩn của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI), đo mật độ quang ở bước sóng 515-540 nm, sử dụng Ellipticine làm đối chứng dương và tính toán $IC_{50}$ qua phần mềm TableCurve 2Dv4. Theo tiêu chuẩn của NCI được nêu trong luận án, một chất tinh khiết được coi là có hoạt tính tốt khi giá trị $IC_{50} \le 5\ \mu\text{M}$ (hoặc $\le 4\ \mu\text{g/mL}$).

5. Ảnh hưởng của các nhóm thế trên vòng thơm của phần hydrazide đến hoạt tính sinh học của các dẫn xuất được ghi nhận như thế nào? Các dẫn xuất mang nhóm thế hút điện tử thuộc nhóm halogen (như fluoro $-\text{F}$, chloro $-\text{Cl}$) tại các vị trí ortho hoặc para trên nhân thơm của phần benzohydrazone hoặc phenylacethydrazone nhìn chung thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao hơn và phổ kháng khuẩn rõ rệt hơn so với các dẫn xuất mang nhóm thế đẩy điện tử ($-\text{CH}_3$, $-\text{OCH}_3$).

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Vũ Văn Vụ đã phân giải thành công đồng phân quang học (-)-gossypol từ gossypol racemic và tổng hợp thành công 26 dẫn xuất mới thuộc các hệ base Schiff và hydrazone của (-)-gossypol và zerumbone. Toàn bộ các cấu trúc được xác định bằng các phương pháp phổ học hiện đại ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, HR-ESI-MS, HPLC chiral, đo góc quay cực riêng). Kết quả thử nghiệm sinh học cho thấy nhiều dẫn xuất hydrazone thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro và ức chế vi sinh vật kiểm định, đồng thời xác lập mối liên quan bước đầu giữa cấu trúc nhóm thế và hoạt tính sinh học của các hợp chất tổng hợp.