Khóa luận tốt nghiệp phân lập nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn bacillus trên đất trồng cây vú sữa tỉnh tiền giang

Nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus trong đất trồng cây vú sữa tại Tiền Giang, phân tích vai trò và tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp bền vững.

Chuyên ngành

Công nghệ sinh học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

Khóa luận tốt nghiệp

2021

61
3
0

Phí lưu trữ

30 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

1. MỤC LỤC

1.1. LỜI CAM ĐOAN

1.2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1.3. DANH MỤC BẢNG

1.4. DANH MỤC HÌNH

1.5. Mục đích và yêu cầu của đề tài

1.5.1. Mục đích của đề tài

1.5.2. Yêu cầu của đề tài

1.6. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.6.1. Giới thiệu về cây vú sữa

1.6.2. Giá trị của cây vú sữa

1.6.3. Tình hình sản xuất vú sữa tại Việt Nam

1.6.4. Tình hình sản xuất vú sữa trên thế giới

1.6.5. Vi khuẩn Bacillus

1.6.5.1. Cơ chế của vi khuẩn Bacillus
1.6.5.2. Phân bố, phân loại vi khuẩn Bacillus

1.7. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.7.1. Đối tượng nghiên cứu. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

1.7.2. Vật liệu nghiên cứu

1.7.3. Nội dung nghiên cứu

1.7.4. Phương pháp nghiên cứu

1.7.4.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn
1.7.4.2. Phương pháp định danh vi khuẩn Bacillus đã tuyển chọn dựa vào mô tả đặc điểm hình thái
1.7.4.3. Phương pháp xác định đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus đã tuyển chọn
1.7.4.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chịu mặn muối NaCl và hoạt tính phân giải cellulose của mẫu vi khuẩn Bacillus đã tuyển chọn

1.7.5. Phương pháp xử lý số liệu

1.8. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

1.8.1. Phân lập, tuyển chọn mẫu vi khuẩn

1.8.2. Định danh chủng vi khuẩn Bacillus dựa vào đặc điểm hình thái

1.8.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sinh trưởng, phát triển của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn

1.8.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Bacillus spp.
1.8.3.2. Ảnh hưởng của ngưỡng pH đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Bacillus spp.
1.8.3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Bacillus spp.
1.8.3.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Bacillus spp.
1.8.3.5. Ảnh hưởng của độ mặn muối NaCl đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Bacillus spp.

1.8.4. Xác định hoạt tính cellulose

1.9. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC XỬ LÝ THỐNG KÊ

Tóm tắt

I. Giới thiệu về khóa luận tốt nghiệp

Khóa luận tốt nghiệp với đề tài 'Phân lập, nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus trên đất trồng cây vú sữa tỉnh Tiền Giang' được thực hiện bởi sinh viên Lê Thị Phương Trang, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Đức Thành và ThS. Trần Thị Hồng Hạnh. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập vi khuẩn từ đất trồng cây vú sữa tại tỉnh Tiền Giang, nhằm xác định các đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus và đánh giá tiềm năng ứng dụng của chúng trong nông nghiệp.

1.1. Mục đích và yêu cầu của đề tài

Mục đích chính của đề tài là phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất trồng cây vú sữa và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng. Yêu cầu cụ thể bao gồm việc phân lập, định danh vi khuẩn, xác định các đặc điểm sinh học, và đánh giá khả năng chịu mặn cũng như hoạt tính phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn.

II. Tổng quan về cây vú sữa và vi khuẩn Bacillus

Cây vú sữa, có tên khoa học là Chrysophyllum cainino, là một loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao tại tỉnh Tiền Giang. Vi khuẩn Bacillus là một chi vi khuẩn hiếu khí, hình que, có khả năng sinh bào tử và phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Chúng được biết đến với khả năng kích thích sinh trưởng thực vật, hấp thụ chất dinh dưỡng, và phòng trừ các tác nhân gây bệnh cây trồng.

2.1. Giá trị của cây vú sữa

Cây vú sữa không chỉ cung cấp quả giàu dinh dưỡng mà còn có nhiều tác dụng chữa bệnh. Quả vú sữa chứa nhiều vitamin, khoáng chất, và axit amin, giúp tăng cường hệ miễn dịch và phòng ngừa mất nước. Lá và vỏ cây cũng được sử dụng trong y học dân gian để điều trị các bệnh như tiểu đường và thấp khớp.

2.2. Đặc điểm và ứng dụng của vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật thông qua việc sản xuất các chất như auxin và cytokinin. Chúng cũng có thể chuyển hóa lân khó tan thành dạng dễ hấp thụ, giúp cải thiện dinh dưỡng cho cây trồng. Ngoài ra, Bacillus còn được sử dụng trong phòng trừ bệnh hại cây trồng nhờ khả năng sản xuất kháng sinh và tăng cường khả năng kháng bệnh của cây.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện bằng cách phân lập vi khuẩn từ mẫu đất trồng cây vú sữa tại tỉnh Tiền Giang. Các phương pháp bao gồm phân lập vi khuẩn trên môi trường King’s B, định danh dựa trên đặc điểm hình thái, và đánh giá các đặc điểm sinh học như khả năng chịu mặn và hoạt tính phân giải cellulose.

3.1. Phân lập và định danh vi khuẩn

Vi khuẩn được phân lập từ mẫu đất trồng cây vú sữa bằng phương pháp pha loãng đất trên môi trường King’s B. Sau đó, các chủng vi khuẩn được định danh dựa trên đặc điểm hình thái và hóa sinh.

3.2. Đánh giá đặc điểm sinh học

Các đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus được đánh giá thông qua các thí nghiệm về khả năng chịu mặn và hoạt tính phân giải cellulose. Kết quả cho thấy vi khuẩn Bacillus spp. TGVS01 có khả năng chịu mặn với nồng độ muối NaCl 1% và hoạt tính phân giải cellulose cao.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus spp. TGVS01 sinh trưởng tốt trên môi trường King’s B, với ngưỡng pH từ 6 đến 8. Chủng vi khuẩn này cũng có khả năng chịu mặn và hoạt tính phân giải cellulose, mở ra tiềm năng ứng dụng trong cải thiện đất trồng và phòng trừ bệnh hại cây vú sữa.

4.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn Bacillus spp. TGVS01 sinh trưởng tốt nhất trên môi trường King’s B, với nguồn cacbon là saccharose và nguồn nitơ là cao thịt bò. Điều này cho thấy môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi khuẩn.

4.2. Khả năng chịu mặn và phân giải cellulose

Chủng vi khuẩn Bacillus spp. TGVS01 có khả năng chịu mặn với nồng độ muối NaCl 1% và hoạt tính phân giải cellulose cao. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn này trong cải thiện đất trồng và phòng trừ bệnh hại cây vú sữa.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus trên đất trồng cây vú sữa tại tỉnh Tiền Giang. Kết quả cho thấy tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn Bacillus trong cải thiện đất trồng và phòng trừ bệnh hại cây vú sữa. Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp.

5.1. Kết luận

Nghiên cứu đã phân lập thành công vi khuẩn Bacillus spp. TGVS01 từ đất trồng cây vú sữa tại tỉnh Tiền Giang. Chủng vi khuẩn này có khả năng chịu mặn và hoạt tính phân giải cellulose, mở ra tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp.

5.2. Kiến nghị

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về khả năng ứng dụng của vi khuẩn Bacillus trong cải thiện đất trồng và phòng trừ bệnh hại cây vú sữa. Đồng thời, cần thực hiện các thử nghiệm thực địa để đánh giá hiệu quả thực tế của chủng vi khuẩn này.

12/02/2025

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Tiền Giang là một tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Với địa hình tương đối bằng phẳng, đất phù sa trung tính, ít chua dọc sông Tiền, chiếm khoảng 53% diện tích toàn tỉnh, thích hợp cho nhiều loại giống cây trồng và vật nuôi. Tiền Giang được thiên nhiên ưu đãi để phát triển nhiều loại cây trồng đặc sản, trong đó, nhiều loại đã có thương hiệu trên thị trường như: xoài cát Hòa Lộc, sầu riêng, dứa, thanh long, vú sữa Lò Rèn… Những loại cây ăn quả đặc sản này đã giúp rất nhiều nông dân thoát nghèo, vươn lên làm giàu; góp phần thay đổi bộ mặt nông thôn. Diện tích cây ăn quả của tỉnh Tiền Giang đạt hơn 80.000 ha, tăng khoảng 10.000 ha so với năm 2015, sản lượng khoảng 1,5 triệu tấn.

Trong đó, nhiều loại cây ăn quả có vùng trồng tập trung như: dứa 15.500 ha, sầu riêng hơn 13.000 ha, thanh long gần 10. Giống vú sữa Lò rèn (Tiền Giang) được đánh giá là có chất lượng tốt nhất. Vú sữa là loại trái cây giàu chất dinh dưỡng như canxi, photpho, kali, magie… Đặc biệt đây là nguồn cung cấp vitamin dồi dào, chứa hàm lượng nước và chất xơ cao. Nhờ vậy ăn vú sữa có thể giúp phòng ngừa hiện tượng mất nước vào mùa hè, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể.

Vú sữa không kén đất và được xếp vào nhóm cây ăn trái cho giá trị kinh tế cao, dễ tiêu thụ. Bên cạnh những nguồn lợi về mặt sức khoẻ thì vú sữa cũng là một trong những loại trái cây có giá trị lớn trong việc xuất khẩu. Trong những năm gần đây, các khu vườn vú sữa Lò Rèn Vĩnh Kim đã đối mặt với nguy cơ suy thoái nghiêm trọng do bị bệnh khô cành, thối rễ… Bệnh thối rễ là một trong những đối tượng dịch hại nguy hiểm và gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho vùng trồng vú sữa tập trung ở tỉnh Tiền Giang. Bệnh thường xuất hiện và gây hại nặng trên những vườn vú sữa già cỗi, kể cả đối với những vườn trong giai đoạn kiến thiết cơ bản làm sụt giảm 1 đáng kể năng suất và thậm chí gây chết cây.

Bệnh còn tấn công ở vị trí cổ rễ hay một số vị trí cục bộ trên rễ chính (nằm gần mặt đất) từ đó làm cho toàn bộ hệ thống rễ bị thối khô và hóa nâu, nếu phát hiện muộn thì sẽ rất khó phòng trừ. Bệnh thối rễ do nhiều tác nhân gây ra như nấm Fusarium solani, F.oxysporium, Pythium helicoides (Nguyễn Minh Châu và ctv. Các tác nhân này đều có nguồn gốc phát sinh từ đất nên việc phòng trừ nhóm nấm bệnh này bằng biện pháp hóa học là rất khó khăn do đặc tính sinh học, sinh thái của các nhóm nấm này, chúng có khả năng tồn tại lâu dài và thích ứng với các điều kiện ngoại cảnh khó khó khăn dưới dạng bào tử hậu hoặc dạng hạch. Hơn nữa việc sử dụng nhiều thuốc bảo vệ thực vật hóa học để phòng trừ bệnh đã làm tăng khả năng kháng thuốc của các loài nấm này, gây ô nhiễm cho môi trường.

Do đó, việc tăng hiệu quả phòng trừ bệnh và giảm việc sử dụng thuốc hóa học là hướng đi toàn cầu trong nền sản xuất nông nghiệp hiện đại yêu cầu sử dụng các phương pháp khác như biện pháp sinh học trong bảo vệ thực vật. Bacillus là một tác nhân sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh hại cây trồng. Chúng có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnh với phổ tác động rộng, không gây hại cho con người và cây trồng. Mặt khác, Bacillus còn tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ khó phân hủy thành những chất hữu cơ đơn giản cho cây trồng dễ sử dụng, giúp cải tạo đất, khống chế và tiêu diệt một số loại vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng bởi các chức năng sinh học chuyên biệt của chúng (Lê Đức Mạnh và ctv, 2003).

Trong nông nghiệp, các vi khuẩn thuộc chi Bacillus tham gia vào quá trình hòa tan các chất từ khó tan sang dạng dễ tan, cải tạo đất, tăng năng suất hoặc đối kháng với một số nấm bệnh và vi khuẩn ở vùng rễ cây trồng, làm phong phú thêm hệ vi sinh vật đất và trả lại độ phì nhiêu cho đất. Xuất phát từ thực tiễn đó, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới và trong nước hiện nay việc thực hiện đề tài: “Phân lập, nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus trên đất trồng cây vú sữa tỉnh Tiền 2 Giang” mang tính cấp thiết. Đề tài được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Đức Thành - Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Di truyền Nông nghiệp và ThS.

Trần Thị Hồng Hạnh - Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1. Mục đích của đề tài Phân lập, xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus trên đất trồng cây vú sữa tại tỉnh Tiền Giang. Yêu cầu của đề tài - Phân lập, định danh vi khuẩn Bacillus trên các mẫu đất trồng cây vú sữa thu thập ở tỉnh Tiền Giang.

- Xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus đã tuyển chọn. - Đánh giá hoạt tính chịu mặn muối NaCl và hoạt tính phân giải cellulose của mẫu vi khuẩn Bacillus đã tuyển chọn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu về cây vú sữa Cây vú sữa có tên khoa học là Chrysophyllum cainino, thuộc họ Hồng xiêm (Sapotaceae).

Cây được trồng làm cây cảnh hoặc cây ăn quả để lấy quả. Có nhiều tên khác nhau cho cây vú sữa tùy thuộc vào nơi nó hiện diện như star apple, cainito và caimito. Cây vú sữa có nguồn gốc ở đảo Antilles và Tây Ấn. Nó đã lan rộng đến các vùng đất thấp của Trung Mỹ và hiện được trồng ở khắp các vùng nhiệt đới, bao gồm cả Đông Nam Á.

Giá trị của cây vú sữa Vú sữa không những cung cấp nhiều chất dinh dưỡng, vitamin mà còn có nhiều tác dụng chữa bệnh đã được khoa học chứng minh và đã qua chứng thực trong dân gian. Theo dinh dưỡng học, quả vú sữa chứa khoảng 78,4 – 85,7% nước. Mỗi 100 g ăn được của quả vú sữa có chứa 0,72 g – 2,33 g protein; 14,65 g carbohydrate và từ 8,45 g đến 10,39 g tổng số đường. Hơn nữa, quả vú sữa cũng chứa một số khoáng chất (canxi, sắt, phốt phát), vitamin (A, B2, C) và axit amin (tryptophan, methionine, lysine) (Đoàn Văn Hậu và Lê Phương Thảo, 2020).

Cây vú sữa không những có giá trị dinh dưỡng cao nằm ở phần quả. Chất chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của cây vú sữa chứa phenol, alkaloid, flavonoid, steroid, saponin, tannin và glycoside tim được tìm thấy trong vỏ thân hoặc quả. Những thành phần này hứa hẹn có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và các hoạt động sinh học khác (Đoàn Văn Hậu và Lê Phương Thảo, 2020). Lớp cùi thịt của quả ăn được và rất ngon, dùng làm các món tráng miệng.

Vú sữa có vị ngọt, hay được phục vụ dưới dạng tươi hoặc làm lạnh (khoảng 10 - 15°C). 4 Lá của vú sữa được dùng ở một số khu vực làm dạng như chè và người ta coi nó có tác dụng chống các bệnh đái đường và thấp khớp,ngoài ra còn có khả năng giúp lành vết thương (nước trích bằng ethanol từ lá). Khi cây đang ở giai đoạn phát triển thì lá của cây vú sữa có màu xanh. Lá trên các cành mọc so le nhau, có hình ovan đơn, đầu nhọn, có mép liền và có chiều dài từ 5 - 10cm; rộng 3 - 10cm; cuống 10 - 15mm; lá dai.

Vỏ cây được coi là có chứa chất bổ và có tác dụng điều hòa huyết áp, nước sắc vỏ cây được dùng để chống ho. Vỏ thân có nhiều chất chát, làm thuốc sắc trị tiêu chảy và xuất huyết; trị bệnh lậu và bệnh đường tiểu. Cây vú sữa có tốc độ sinh trưởng nhanh. Phù hợp với điều kiện nhiệt đới nhiệt độ 22 – 34 ⁰C, chỉ ra hoa tốt trong điều kiện có hai mùa mưa nắng phân biệt và không chịu được gió to do cây có tán lá dày và rễ nông.

Khi được chăm bón cẩn thận thì khoảng sau 3 năm sau có thể thu hoạch được. Cây vú sữa khi đậu trái đến khi thu hoạch mất khoảng thời gian từ 180 - 200 ngày. Mùa thu hoạch vú sữa từ tháng 2 - 3 dương lịch hàng năm. Tình hình sản xuất vú sữa tại Việt Nam Đến năm 2017, Việt Nam là nước đầu tiên xuất khẩu vú sữa vào thị trường lớn của Mỹ (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2017).

Tiền Giang có trên 77.000 ha cây ăn quả các loại, sản lượng hàng năm trên 1,3 triệu tấn. Riêng về vú sữa, ở phía Nam, chỉ 3 tỉnh có diện tích trồng vú sữa tập trung lớn: Tiền Giang, Hậu Giang và Tp. Trong đó, Tiền Giang lớn nhất với khoảng 3.100 ha tập trung tại huyện Châu Thành và các huyện lân cận gồm hai giống chủ lực: vú sữa Lò rèn Vĩnh Kim và vú sữa nâu, sản lượng hàng năm khoảng 50. Đặc biệt, vú sữa Lò rèn Vĩnh Kim là giống vú sữa đặc sản nổi tiếng của tỉnh.

Theo người dân ở đây giá vú sữa tăng rất mạnh, lúc cao điểm 28. Khi cuối vụ, tuy giá có giảm nhưng vẫn đạt 20. Với giá này, sau khi trừ chi phí nông dân còn lãi hàng trăm triệu đồng/ha (Minh Trí, 2018). 5 Trong những năm gần đây, diện tích cây trồng vú sữa ở Tiền Giang giảm sút sâu, hiện nay, diện tích vú sữa Lò Rèn trên địa bàn tỉnh còn trên 330 ha, tập trung chủ yếu tại huyện Châu Thành, khoảng 210 ha.

Các diện tích còn lại ở huyện Cái Bè, Cai Lậy và thị xã Cai Lậy (Hoàng Nam, 2021). Nguyên nhân chính là do những năm gần đây bệnh khô cành, thối rễ trên cây vú sữa chiếm tỷ lệ cao nhưng chưa có giải pháp ngăn chặn hiệu quả làm cho cây suy kiệt dần, kết hợp với thời tiết diễn biến bất thường đã ảnh hưởng đến khả năng cho trái của cây vú sữa. Ngoài ra, do nông dân trồng dày, lạm dụng phân bón vô cơ, cộng với việc xử lý cho trái sớm liên tục nhiều năm làm cây mất cân đối về dinh dưỡng. Những năm gần đây, các loại cây ăn trái như sầu riêng, mít, bưởi da xanh đang mang lại hiệu quả kinh tế cao nên nhà vườn có nhiều sự lựa chọn hơn so với trước.

Tình hình sản xuất vú sữa trên thế giới Cây vú sữa được phổ biến rất rộng trong nhiều nước, những vùng eo đất, nhất là ở Costa Rica, Cuba, Dominica, Haiti, Honduras, Jamaica, Mexico, Antilles của Hà Lan, Nicaragua, Panama, v.

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ

Tài liệu "Nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus trong đất trồng cây vú sữa tại Tiền Giang" cung cấp cái nhìn sâu sắc về đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus, một loại vi khuẩn có vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng đất và năng suất cây trồng. Nghiên cứu này không chỉ giúp người đọc hiểu rõ hơn về sự phân bố và tính chất của vi khuẩn Bacillus trong môi trường đất trồng cây vú sữa, mà còn chỉ ra những lợi ích tiềm năng của việc ứng dụng vi khuẩn này trong nông nghiệp, từ đó nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp bền vững.

Để mở rộng kiến thức về các khía cạnh liên quan đến giáo dục và phát triển năng lực trong lĩnh vực nông nghiệp và sinh học, bạn có thể tham khảo thêm tài liệu Luận văn thạc sĩ khoa học giáo dục đề xuất một số biện pháp rèn luyện kĩ năng hệ thống hóa kiến thức cho học sinh trong dạy học phần sinh học vi sinh vật sinh học 10 thpt, nơi bạn có thể tìm hiểu về phương pháp giảng dạy sinh học vi sinh vật. Bên cạnh đó, tài liệu Nghiên cứu thực nghiệm xác định vật liệu và kết cấu để nâng cao tuổi thọ trục vít côn máy ép củi trấu luận văn thạc sĩ cũng có thể cung cấp thêm thông tin về ứng dụng công nghệ trong nông nghiệp. Những tài liệu này sẽ giúp bạn có cái nhìn toàn diện hơn về các vấn đề liên quan đến sinh học và nông nghiệp.