Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với địa hình đa dạng, tạo điều kiện cho thảm thực vật phát triển phong phú, trong đó có nhiều loài cây thuốc quý được ứng dụng trong y học cổ truyền. Họ Thiên lý (Asclepiadaceae) trên thế giới có khoảng 4.500 loài phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới châu Á, châu Mỹ, châu Phi và Ấn Độ. Trong đó, chi Streptocaulon có khoảng 10 loài tại khu vực nhiệt đới châu Á. Loài Hà thủ ô trắng có tên khoa học là Streptocaulon juventas Merr. (tên đồng nghĩa dân gian: Hà thủ ô nam, Bạch hà thủ ô, Củ vú bò, Dây sữa bò, Dây móc), phân bố tự nhiên chủ yếu tại ba nước Đông Dương (Việt Nam, Lào, Campuchia) và một số vùng phía nam Trung Quốc. Tại Việt Nam, loài này mọc rải rác ở các tỉnh trung du, miền núi và đồng bằng như Vĩnh Phúc, Hà Tây, Tuyên Quang và An Giang.

Trong kinh nghiệm y học dân gian, Hà thủ ô trắng có vị ngọt đắng, chát, tính mát; có tác dụng bổ máu, bổ gan và thận; được sử dụng làm bài thuốc chữa thiếu máu, sốt rét kinh niên, thấp khớp, suy nhược thần kinh, rối loạn kinh nguyệt, ăn uống khó tiêu. Rễ củ của cây còn được dùng để thanh nhiệt, giải độc, trị cảm sốt, sưng viêm và giải độc rắn cắn; cành và lá đun nước dùng tắm trị mụn lở, ngứa rát ngoài da.

Về mặt khoa học thực nghiệm, nhiều công trình trên thế giới và trong nước đã chứng minh rễ củ cây Hà thủ ô trắng chứa hàm lượng lớn các hợp chất nhóm cardenolide glycoside có hoạt tính gây độc tế bào và ức chế chọn lọc sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư ở người như ung thư u xơ tử cung (HT-1080), ung thư biểu mô tuyến giáp (A549), ung thư cổ tử cung (HeLa) và ung thư bạch cầu (HL-60). Tuy nhiên, phần lớn các công trình nghiên cứu trước đây chỉ tập trung vào bộ phận rễ củ, trong khi thành phần hóa học của phần lá và thân dây leo vẫn chưa được khảo sát đầy đủ.

Xuất phát từ thực tế đó, tác giả thực hiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài: "Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn B của cao chloroform từ lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.), họ Asclepiadaceae".

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài bao gồm:

  1. Thu hái, xử lý nguyên liệu và điều chế các loại cao phân đoạn từ lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.) bằng phương pháp chiết xuất lỏng - lỏng.
  2. Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký (sắc ký cột silica gel pha thường, sắc ký lớp mỏng phân tích và sắc ký lớp mỏng điều chế) để phân lập các hợp chất hữu cơ tinh khiết từ phân đoạn B của cao chloroform.
  3. Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (chủ yếu là phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR) kết hợp đối chiếu tài liệu tham khảo để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Bột khô từ lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Merr., họ Asclepiadaceae). Mẫu thực vật được thu hái tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 5 năm 2018 và được định danh khoa học bởi lương y Nguyễn Thiện Chung (xã An Phú, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang).
  • Phạm vi nghiên cứu: Tập trung chiết xuất và phân lập các hợp chất tự nhiên có trong phân đoạn B của cao chloroform thu được từ 30 kg nguyên liệu khô lá và thân dây leo; xác định cấu trúc hóa học các hợp chất tinh khiết cô lập được.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thuộc loại hình nghiên cứu thực nghiệm hóa học hữu cơ (chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên / Hóa thực vật).

Khung lý thuyết và các quy chuẩn phân tích cấu trúc được xây dựng dựa trên:

  • Lý thuyết về các nhóm hợp chất thứ cấp trong thực vật (đặc biệt là khung triterpenoid 30 carbon, cardenolide glycoside, steroid và phenolic).
  • Cơ sở lý thuyết của các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): phổ một chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT-90, DEPT-135) và phổ hai chiều (HSQC, HMBC) để xác định độ dịch chuyển hóa học ($\delta$, ppm), độ bội tín hiệu (s, d, dd, t, m), hằng số ghép ($J$, Hz), số lượng carbon/proton và tương quan dị nhân qua nhiều liên kết ($^2J_{\text{C-H}}$, $^3J_{\text{C-H}}$).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và quy trình triển khai:

  • Phương pháp chiết xuất: Đun hoàn lưu nhiệt mẫu bột thực vật khô với dung môi methanol ($\text{MeOH}$) ở nhiệt độ sôi ($64 - 65^\circ\text{C}$), lặp lại 3 lần (3 giờ/lần). Dịch chiết sau đó được cô quay chân không ở áp suất thấp để thu cao chiết thô $\text{MeOH}$.
  • Phương pháp phân bố lỏng - lỏng: Phân tán cao $\text{MeOH}$ vào nước rồi chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: $n$-hexane, chloroform ($\text{CHCl}_3$), ethyl acetate ($\text{EA}$) và $n$-butanol ($n\text{-BuOH}$).
  • Phương pháp sắc ký:
    • Sắc ký cột (SKC) pha thường: sử dụng pha tĩnh silica gel 60 ($40 - 63\ \mu\text{m}$, Merck, Đức).
    • Sắc ký lớp mỏng (SKLM) phân tích: bản mỏng tráng sẵn silica gel $60\ \text{F}{254}$ ($250\ \mu\text{m}$, Merck) và bản mỏng pha đảo $\text{RP-18}\ \text{F}{254\text{s}}$ (Merck).
    • Sắc ký lớp mỏng điều chế: triển khai hệ dung môi nhiều lần để tinh chế phân đoạn nhỏ.
    • Thuốc thử hiện vết: dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\ 15% - 20%$ trong nước kết hợp hơ nóng bản mỏng; soi đèn tử ngoại ở bước sóng $254\ \text{nm}$ và $365\ \text{nm}$ (Spectroline ENF-240 C/FE, USA).
  • Thiết bị đo phổ: Hệ thống máy quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance hoạt động ở tần số $500\ \text{MHz}$ hoặc $600\ \text{MHz}$ đối với phổ $^1\text{H-NMR}$ và $125\ \text{MHz}$ đối với phổ $^{13}\text{C-NMR}$, đo tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Hà Nội). Dung môi đo phổ là deuterated chloroform ($\text{CDCl}_3$).
  • Nguồn dữ liệu thực nghiệm: Toàn bộ dữ liệu khối lượng cao chiết, tỷ lệ dung môi rửa giải sắc ký cột, hệ số lưu giữ ($R_f$), số liệu dịch chuyển phổ NMR và tương quan HMBC được đo đạc, ghi nhận trực tiếp từ quá trình thực nghiệm của tác giả.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của đề tài, tổng quan giá trị dược liệu của họ Thiên lý (Asclepiadaceae) và cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.). Tác giả nêu rõ khoảng trống nghiên cứu: các công trình trong và ngoài nước tập trung phần lớn vào rễ củ mà chưa khảo sát hóa học trên lá và thân dây leo. Từ đó xác định mục tiêu phân lập và định danh cấu trúc các hợp chất từ phân đoạn B của cao chloroform.

Chương 1. Các nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu đã công bố liên quan đến chi Streptocaulon và loài Streptocaulon juventas:

  • Đặc điểm thực vật và công dụng dân gian: Mô tả chi tiết hình thái dây leo dài $2 - 5\ \text{m}$, thân cành màu nâu đỏ nhiều lông mịn, lá mọc đối hình trứng ngược, hoa màu nâu nhạt hoặc vàng tía, quả thoi màu xám, rễ củ màu trắng có lõi và vị đắng.
  • Các nghiên cứu quốc tế trên cây Hà thủ ô trắng:
    • Jun-ya Ueda và cộng sự (2003): Phân lập 16 hợp chất cardenolide (1–16) cùng 2 dẫn xuất phenylpropanoide/phenylethanoide từ rễ củ. Các hợp chất cardenolide thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh và chọn lọc trên dòng u xơ tử cung $\text{HT-1080}$ với $\text{IC}_{50} = 0{,}054 - 1{,}xx\ \mu\text{g/mL}$.
    • Aihui Liu và cộng sự (2008): Phân lập từ thân cây 7 hợp chất gồm syringaldehyde (17), isofraxidin (18), ferulic acid (19), scopoletin (20), syringic acid (21), salicylaldehyde (22), scoparone (23) cùng $\beta$-sitosterol và daucosterol; đa số có khả năng ức chế tế bào ung thư bạch cầu $\text{HL-60}$.
    • Jun Yin và cộng sự (2013): Phân lập 6 hợp chất cardenolide mới (24–29) cùng 18 cardenolide đã biết từ rễ cây, có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô tuyến giáp $\text{A549}$.
    • Chun Ye và cộng sự (2015): Phân lập 10 hợp chất cardenolide từ rễ (30–39), trong đó 4 hợp chất (36–39) lần đầu tiên được tìm thấy trong chi Streptocaulon.
  • Các nghiên cứu trên các loài cùng chi Streptocaulon: Tổng hợp dẫn liệu hóa học từ rễ loài S. griffithii (chứa các cardenolide, cycloartane triterpenoid như hợp chất 53–55) và S. tomentosum tại Myanmar (chứa các dẫn xuất cardenolide 56–62).
  • Các nghiên cứu trong nước:
    • Phạm Thanh Tâm và Trần Hùng (2002): Đánh giá tác dụng hạ lipid huyết của các phân đoạn cao chiết rễ củ trên chuột, ghi nhận cao $n\text{-BuOH}$ cho đáp ứng tốt.
    • Nguyễn Đức Tuấn và cộng sự (2007): Phân lập 6 hợp chất từ cao dichloromethane của rễ gồm $17\alpha$-periplogenin (63), $17\beta$-periplogenin (64), $17\alpha$-digitoxigenin (65), 16-dehydropregnenolon (66), 5-pregnen-3,17,20-triol (67) và $\alpha$-amyrin acetate (68).
    • Nguyễn Thị Hồng Yến và cộng sự (2009): Phân lập acovenosigenin A 3-$O$-glucoside (69), periplogenin glucoside và $17\alpha$-periplogenin từ cao chloroform của rễ.
    • Bùi Xuân Hào và cộng sự (2011): Phân lập 3 hợp chất khung cardenolide từ dịch chiết $\text{MeOH}$ rễ, trong đó có 2 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy (70, 71).

Chương 2. Hóa chất, thiết bị, phương pháp

Chương này mô tả toàn bộ hóa chất, trang thiết bị phòng thí nghiệm và quy trình chiết tách thực nghiệm:

  • Nguyên liệu: 30 kg bột khô lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng thu hái tại Tịnh Biên, An Giang (tháng 5/2018).
  • Quy trình chiết xuất và phân bố lỏng - lỏng:
    • Đun hoàn lưu 30 kg bột với dung môi $\text{MeOH}$ (3 giờ $\times$ 3 lần), cô quay thu được $1{,}5\ \text{kg}$ cao $\text{MeOH}$ thô.
    • Chiết phân bố lỏng - lỏng thu được các cao phân đoạn: cao $n$-hexane ($285\ \text{g}$), cao chloroform ($885\ \text{g}$), cao ethyl acetate ($120\ \text{g}$), cao $n$-butanol ($110\ \text{g}$) và phần dịch nước còn lại.
  • Quy trình phân lập từ cao chloroform:
    • Cao chloroform ($885\ \text{g}$) được chạy sắc ký cột silica gel ($3{,}0\ \text{kg}$ pha tĩnh), rửa giải với hệ dung môi $n$-hexane : ethyl acetate ($\text{H} : \text{EA}$) có độ phân cực tăng dần, thu được 16 phân đoạn lớn (từ A đến P).
    • Phân đoạn B ($18{,}2\ \text{g}$, rửa giải bằng $\text{H} : \text{EA} = 97:3$) cho nhiều vết tách rõ trên SKLM, được chọn để sắc ký cột tiếp theo với hệ $\text{H} : \text{EA}$ ($100:0 \rightarrow 1:1$), thu được 10 phân đoạn nhỏ (B1 đến B10).
    • Phân đoạn B6 ($3{,}2\ \text{g}$) tiếp tục sắc ký cột silica gel với hệ $n$-hexane : acetone ($\text{H} : \text{Ac}$), thu được 9 phân đoạn phụ (B6.1 đến B6.9).
    • Phân đoạn B6.6 ($0{,}1\ \text{g}$, hệ $\text{H} : \text{Ac} = 30:1$) được sắc ký cột silica gel nhiều lần kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi $n$-hexane : acetone ($30:1$, khai triển 2 lần), phân lập thành công 2 hợp chất sạch: ký hiệu L1 ($20\ \text{mg}$) và L9 ($16\ \text{mg}$).
Giai đoạn tách chiết Mẫu đầu vào / Khối lượng Hệ dung môi rửa giải Kết quả thu được
Chiết lỏng - lỏng Cao $\text{MeOH}$ thô ($1{,}5\ \text{kg}$) $n$-hexane, $\text{CHCl}_3$, $\text{EA}$, $n\text{-BuOH}$ Cao $\text{CHCl}_3$ ($885\ \text{g}$), hexane ($285\ \text{g}$), $\text{EA}$ ($120\ \text{g}$), $\text{BuOH}$ ($110\ \text{g}$)
SKC lần 1 Cao $\text{CHCl}_3$ ($885\ \text{g}$) $\text{H} : \text{EA}$ ($98:2 \rightarrow 1:4$) 16 phân đoạn lớn; chọn phân đoạn B ($18{,}2\ \text{g}$, hệ $97:3$)
SKC lần 2 Phân đoạn B ($18{,}2\ \text{g}$) $\text{H} : \text{EA}$ ($100:0 \rightarrow 1:1$) 10 phân đoạn nhỏ; chọn phân đoạn B6 ($3{,}2\ \text{g}$)
SKC lần 3 Phân đoạn B6 ($3{,}2\ \text{g}$) $\text{H} : \text{Ac}$ (độ phân cực tăng dần) 9 phân đoạn nhỏ; chọn phân đoạn B6.6 ($0{,}1\ \text{g}$, hệ $30:1$)
SKC + SKLM điều chế Phân đoạn B6.6 ($0{,}1\ \text{g}$) $\text{H} : \text{Ac}$ ($30:1$, chạy 2 lần) Hợp chất L1 ($20\ \text{mg}$) và L9 ($16\ \text{mg}$)

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương này đi sâu vào việc phân tích các dữ liệu vật lý, tính chất sắc ký và lập luận phổ học để làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của hai hợp chất phân lập được:

  • Khảo sát cấu trúc hợp chất L1 (Phyllanthol):

    • Cảm quan và tính chất sắc ký: Dạng bột vô định hình màu trắng, tan tốt trong $\text{CHCl}_3$, không hấp thu dưới đèn UV. Trên bản mỏng hiện hình bằng dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\ 15%$ và sấy nóng cho vết tròn màu vàng duy nhất ($R_f = 0{,}xx$).
    • Dữ liệu phổ NMR:
      • Phổ $^1\text{H-NMR}$ ($\text{CDCl}3$): Tín hiệu proton carbinol tại $\delta\text{H} = 3{,}19\ \text{ppm}$ ($\text{H-3}$); hai tín hiệu proton vòng cyclopropyl tại $\delta_\text{H} = 0{,}66\ \text{ppm}$ và $\delta_\text{H} = 0{,}xx\ \text{ppm}$ ($\text{H-27}$); 7 nhóm methyl xuất hiện trong vùng $\delta_\text{H} = 0{,}xx - 1{,}xx\ \text{ppm}$.
      • Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ và DEPT: Cho thấy sự có mặt của 30 nguyên tử carbon, bao gồm 7 nhóm methyl ($\text{CH}_3$), 11 nhóm methylene ($\text{CH}2$), 6 nhóm methine ($\text{CH}$) trong đó có 1 carbon carbinol tại $\delta\text{C} = 79{,}1\ \text{ppm}$ ($\text{C-3}$), và 6 carbon tứ cấp.
      • Phổ 2D-NMR (HSQC, HMBC): Phổ HMBC xác nhận tương quan giữa proton carbinol $\delta_\text{H}\ 3{,}19$ ($\text{H-3}$) với các carbon lân cận; tương quan giữa proton methylene của vòng cyclopropyl tại $\delta_\text{H}\ 0{,}66$ ($\text{H-27}$) với các carbon $\text{C-13}$ và $\text{C-14}$ ($\delta_\text{C}\ 37{,}xx\ \text{ppm}$), xác định sự hiện diện của vòng cyclopropane gắn tại vị trí $\text{C-13}$ và $\text{C-14}$.
    • Kết luận định danh: Kết hợp các dữ liệu phổ và đối chiếu tài liệu tham khảo [15], cấu trúc của hợp chất L1 được xác định là Phyllanthol (triterpenoid pentacyclic có chứa vòng cyclopropane).

  • Khảo sát cấu trúc hợp chất L9 (Ursolic acid):

    • Cảm quan và tính chất sắc ký: Dạng bột vô định hình màu trắng, tan tốt trong $\text{CHCl}_3$, không hiện vết dưới đèn UV. Hiện hình trên SKLM bằng thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4\ 15%$ sấy nóng cho vết màu tím đặc trưng.
    • Dữ liệu phổ NMR:
      • Phổ $^1\text{H-NMR}$ ($\text{CDCl}3$): Tín hiệu proton carbinol tại $\delta\text{H} = 3{,}22\ \text{ppm}$ ($\text{H-3}$); tín hiệu proton olefin tại $\delta_\text{H} = 5{,}xx\ \text{ppm}$ ($\text{H-12}$); 7 nhóm methyl trong vùng trường cao $\delta_\text{H} = 0{,}xx - 1{,}xx\ \text{ppm}$.
      • Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ và DEPT: Xác định khung triterpenoid gồm 30 carbon: 7 nhóm methyl, 9 nhóm methylene, 7 nhóm methine (với 1 carbon carbinol tại $\delta_\text{C} = 76{,}9\ \text{ppm}$ ở $\text{C-3}$), 7 carbon tứ cấp gồm 1 nhóm carbonyl acid tại $\delta_\text{C} = 179{,}xx\ \text{ppm}$ ($\text{C-28}$) và 2 carbon olefin của nối đôi $\text{C=C}$ tại $\delta_\text{C} = 125{,}6\ \text{ppm}$ ($\text{C-12}$) và $\delta_\text{C} = 138{,}xx\ \text{ppm}$ ($\text{C-13}$).
      • Phổ HMBC: Tương quan giữa proton carbinol $\delta_\text{H}\ 3{,}22$ ($\text{H-3}$) với $\text{C-28}$ lân cận; proton olefin $\text{H-12}$ tương quan với các carbon của khung ursane; proton methylene $\delta_\text{H}\ 2{,}69$ ($\text{H-22}$) tương quan trực tiếp với carbon carbonyl acid tại $\delta_\text{C}\ 179{,}xx\ \text{ppm}$ ($\text{C-28}$).
    • Kết luận định danh: Đối chiếu dữ liệu phổ học với tài liệu tham khảo [16], hợp chất L9 được xác định chính xác là Ursolic acid.

Chương 4. Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt kết quả phân lập và định danh thành công hai hợp chất triterpenoid tinh khiết (Phyllanthol và Ursolic acid) từ phân đoạn B của cao chloroform lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng. Đề xuất kiến nghị tiếp tục mở rộng khảo sát các phân đoạn sắc ký còn lại để phát hiện thêm các thành phần hóa thực vật mới.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã thu được các kết quả cụ thể và mang lại đóng góp khoa học thực nghiệm sau:

Bảng tổng hợp đặc điểm cấu trúc 2 hợp chất phân lập

Thuộc tính / Thông số Hợp chất L1 (Phyllanthol) Hợp chất L9 (Ursolic acid)
Khối lượng phân lập $20\ \text{mg}$ $16\ \text{mg}$
Trạng thái vật lý Bột vô định hình màu trắng Bột vô định hình màu trắng
Độ tan Tan tốt trong $\text{CHCl}_3$ Tan tốt trong $\text{CHCl}_3$
Hiện vết $\text{H}_2\text{SO}_4\ 15%$ (hơ nóng) Vết tròn màu vàng Vết màu tím
Khung cấu trúc hóa học Triterpenoid có vòng cyclopropane Triterpenoid pentacyclic (nhóm ursane)
Tổng số carbon ($^{13}\text{C-NMR}$) 30 carbon 30 carbon
Tín hiệu nhóm chức đặc trưng - Carbon carbinol $\text{C-3}$ ($\delta_\text{C}\ 79{,}1\ \text{ppm}$)
- Proton cyclopropyl ($\delta_\text{H}\ 0{,}66\ \text{ppm}$, $\text{H-27}$)
- 7 nhóm $\text{CH}3$ ($\delta\text{C}\ 13{,}2\ \text{ppm}$)		 - Carbon carbinol $\text{C-3}$ ($\delta_\text{C}\ 76{,}9\ \text{ppm}$)
- Nối đôi olefin: $\text{C-12}$ ($\delta_\text{C}\ 125{,}6$), $\text{C-13}$ ($\delta_\text{C}\ 138{,}xx$)
- Carbon carbonyl acid $\text{C-28}$ ($\delta_\text{C}\ 179{,}xx\ \text{ppm}$)

Đóng góp mới của đề tài

  • Bổ sung dữ liệu hóa thực vật cho bộ phận trên mặt đất: Trong khi các nghiên cứu trước đây về cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas) chủ yếu tập trung vào rễ củ (vốn giàu hợp chất cardenolide glycoside), công trình này đã tiên phong khảo sát thành phần hóa học trên bộ phận lá và thân dây leo.
  • Phân lập và minh chứng cấu trúc: Đã phân lập thành công và cung cấp đầy đủ bộ dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR khẳng định sự hiện diện của hai hợp chất triterpenoid pentacyclic là Phyllanthol ($20\ \text{mg}$) và Ursolic acid ($16\ \text{mg}$) trong lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng thu hái tại Tịnh Biên, tỉnh An Giang.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Theo tự nhận định của tác giả và phạm vi thực hiện của khóa luận cử nhân:

  • Hạn chế về phạm vi phân đoạn: Nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc khảo sát một số phân đoạn nhỏ thuộc phân đoạn B của cao chloroform (cụ thể là tiểu phân đoạn B6.6); chưa khảo sát toàn diện 15 phân đoạn lớn còn lại của cao chloroform (các phân đoạn từ A, C đến P) cũng như các cao phân cực khác (cao $n$-hexane, cao ethyl acetate, cao $n$-butanol và dịch nước).
  • Hạn chế về đánh giá hoạt tính sinh học: Khóa luận chỉ tập trung vào quy trình hóa học thuần túy (chiết tách, sắc ký tinh chế, đo đạc và giải mã phổ NMR), chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học (như độc tế bào ung thư, kháng vi sinh vật kiểm định, chống oxy hóa hay ức chế enzyme) trên các hợp chất tinh khiết cô lập được.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Tiếp tục tiến hành sắc ký cột và phân lập các hợp chất tự nhiên trên các phân đoạn còn lại của cao chloroform và các cao phân đoạn khác từ lá và thân cây Hà thủ ô trắng.
    • Mở rộng thử nghiệm hoạt tính sinh học của Phyllanthol và Ursolic acid trên các mô hình dược lý thực nghiệm để làm sáng tỏ thêm giá trị sử dụng của bộ phận thân và lá trong y dược học.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo chuyên môn phục vụ cho các nhóm đối tượng:

  • Sinh viên và học viên ngành Hóa học (chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa hợp chất thiên nhiên): Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình chiết xuất hồi lưu, kỹ thuật chiết phân bố lỏng - lỏng trên khối lượng mẫu lớn ($30\ \text{kg}$), kỹ thuật sắc ký cột phân đoạn từng bước và phương pháp kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế nhiều lần để làm sạch mẫu.
  • Người làm nghiên cứu về phổ nghiệm NMR: Cung cấp tài liệu thực tế về cách đọc, phân tích và biện luận các tương quan trên phổ 1D-NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT) và 2D-NMR (HSQC, HMBC) đối với các hợp chất triterpenoid chứa vòng cyclopropane (Phyllanthol) và triterpenoid nhóm ursane chứa liên kết đôi và nhóm carboxylic acid (Ursolic acid).
  • Các nhà nghiên cứu Dược học và Thực vật học: Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm xác thực về thành phần hóa học của lá và thân cây Hà thủ ô trắng Việt Nam, hỗ trợ việc so sánh hóa thực vật giữa các bộ phận khác nhau (rễ củ đối chiếu với lá và thân dây leo) trong cùng loài thực vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng dùng trong nghiên cứu được thu hái ở đâu và xử lý ban đầu như thế nào?
Mẫu thực vật được thu hái tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 5 năm 2018, được định danh khoa học là Streptocaulon juventas Merr. bởi lương y Nguyễn Thiện Chung. Mẫu lá và thân dây leo được loại bỏ lá sâu bệnh, rửa sạch, phơi khô trong bóng râm và xay thành bột mịn thu được tổng cộng 30 kg bột khô.

2. Quy trình điều chế các phân đoạn cao chiết từ 30 kg bột khô diễn ra như thế nào và thu được khối lượng các cao chiết là bao nhiêu?
Bột thô (30 kg) được đun hoàn lưu với methanol ở $64 - 65^\circ\text{C}$ (3 giờ $\times$ 3 lần) và cô quay chân không thu được $1{,}5\ \text{kg}$ cao methanol thô. Lượng cao này được phân tán vào nước rồi chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi: thu được cao $n$-hexane ($285\ \text{g}$), cao chloroform ($885\ \text{g}$), cao ethyl acetate ($120\ \text{g}$), cao $n$-butanol ($110\ \text{g}$) và dịch nước còn lại.

3. Bằng quy trình sắc ký nào tác giả đã cô lập được hai hợp chất L1 và L9 từ cao chloroform?
Cao chloroform ($885\ \text{g}$) được sắc ký cột silica gel ($3{,}0\ \text{kg}$), rửa giải bằng hệ dung môi $n$-hexane : ethyl acetate ($\text{H} : \text{EA}$) tăng dần phân cực, thu được 16 phân đoạn lớn. Phân đoạn B ($18{,}2\ \text{g}$) tiếp tục được sắc ký cột silica gel với hệ $\text{H} : \text{EA}$ thu 10 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn B6 ($3{,}2\ \text{g}$) được sắc ký cột tiếp với hệ $n$-hexane : acetone thu 9 phân đoạn. Cuối cùng, phân đoạn B6.6 ($0{,}1\ \text{g}$) được sắc ký cột nhiều lần kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ $n$-hexane : acetone ($30:1$, chạy 2 lần), phân lập được hợp chất L1 ($20\ \text{mg}$) và hợp chất L9 ($16\ \text{mg}$).

4. Dữ liệu phổ nghiệm nào là căn cứ then chốt để xác định cấu trúc của hợp chất L1 là Phyllanthol?
Hợp chất L1 có 30 carbon trên phổ $^{13}\text{C-NMR}$, 1 nhóm carbinol tại $\delta_\text{C}\ 79{,}1\ \text{ppm}$ gắn proton carbinol $\delta_\text{H}\ 3{,}19\ \text{ppm}$ ($\text{H-3}$), và 7 nhóm methyl. Điểm mấu chốt là sự xuất hiện của tín hiệu proton methylene vòng cyclopropyl tại $\delta_\text{H}\ 0{,}66\ \text{ppm}$ ($\text{H-27}$), có tương quan HMBC với các carbon tại $\delta_\text{C}\ 37{,}xx\ \text{ppm}$, khẳng định nhóm cyclopropyl nối tại vị trí $\text{C-13}$ và $\text{C-14}$, phù hợp với cấu trúc của Phyllanthol.

5. Dữ liệu phổ nghiệm nào chứng minh hợp chất L9 là Ursolic acid?
Hợp chất L9 có khung triterpenoid 30 carbon gồm 7 nhóm methyl, 1 nhóm carbinol tại $\delta_\text{C}\ 76{,}9\ \text{ppm}$ ($\text{C-3}$, gắn proton $\delta_\text{H}\ 3{,}22\ \text{ppm}$), 1 liên kết đôi olefin tại $\delta_\text{C}\ 125{,}6\ \text{ppm}$ ($\text{C-12}$) và $\delta_\text{C}\ 138{,}xx\ \text{ppm}$ ($\text{C-13}$), cùng 1 carbon carbonyl acid ở vùng trường thấp $\delta_\text{C}\ 179{,}xx\ \text{ppm}$ ($\text{C-28}$). Phổ HMBC xác nhận tương quan của proton $\text{H-3}$ với $\text{C-28}$ lân cận và proton methylene $\delta_\text{H}\ 2{,}69\ \text{ppm}$ ($\text{H-22}$) với carbon carbonyl acid $\text{C-28}$, đặc trưng của khung Ursolic acid.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Huỳnh Phú Nhã đã thực hiện thành công việc chiết xuất phân đoạn và khảo sát thành phần hóa thực vật trên lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Merr., họ Asclepiadaceae) thu hái tại Tịnh Biên, tỉnh An Giang. Bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế, tác giả đã cô lập được 20 mg hợp chất Phyllanthol (L1) và 16 mg hợp chất Ursolic acid (L9) từ phân đoạn B của cao chloroform. Cấu trúc hóa học của cả hai hợp chất triterpenoid này đã được xác định chính xác và làm sáng tỏ thông qua phân tích chuyên sâu các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR kết hợp đối chiếu tài liệu khoa học chuẩn.