Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp "Khảo sát thành phần hóa học cao Methanol trong lá cây Chùm ngây (Moringa oleifera L. họ Moringaceae)" được thực hiện bởi sinh viên Tạ Trần Kiên (ngành Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm TP.HCM) dưới sự hướng dẫn của TS. Mai Đình Trị (Phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ hóa học) vào năm 2013.

Về bối cảnh thực tiễn, tác giả nêu rõ thảo dược tự nhiên đóng vai trò thiết yếu trong y học cổ truyền và hiện đại. Thống kê trích dẫn trong văn bản cho thấy có khoảng 70% đến 80% các loại thuốc điều trị đang lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng bắt nguồn từ hợp chất thiên nhiên. Mặc dù Việt Nam sở hữu nguồn tài nguyên thực vật phong phú, phần lớn dược phẩm trong nước vẫn phải nhập khẩu do năng lực nghiên cứu và nguồn cung cấp dược liệu công nghiệp còn hạn chế; các sản phẩm thuốc sản xuất nội địa mới chỉ đáp ứng vài phần trăm nhu cầu điều trị. Trong các loài dược liệu, cây Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) là loài cây đa dụng, giàu dưỡng chất và hoạt tính sinh học, được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến khích phát triển nhằm phòng chống suy dinh dưỡng và hỗ trợ sức khỏe cộng đồng. Dù vậy, tại thời điểm thực hiện đề tài, cây Chùm ngây ở Việt Nam chủ yếu được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian mà chưa có nhiều công trình nghiên cứu sâu về thành phần hóa học phân lập.

Mục tiêu và các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của đề tài bao gồm:

  1. Thu thập, xử lý nguyên liệu lá Chùm ngây và điều chế các phân đoạn cao chiết thô (Hexan, Chloroform, Ethyl acetate, Methanol) từ dịch chiết ethanol tổng.
  2. Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để cô lập các hợp chất tinh khiết từ phân đoạn cao chiết phân cực cao Methanol (MeOH).
  3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại: phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC), kết hợp phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS, HR-ESI-MS).

Đối tượng nghiên cứu là mẫu lá cây Chùm ngây thu hái tại huyện Xuân Lộc, tỉnh Đồng Nai, do Công ty TNHH SX TM Hạnh Thông cung cấp và được giám định tên khoa học tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào phân đoạn phân cực cao Methanol chiết từ bột lá khô, thực hiện tại Phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học thuộc Viện Công nghệ hóa học và Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm TP.HCM trong năm 2013.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu dựa trên các công trình công bố về thực vật học và hóa học các hợp chất thiên nhiên của chi Moringa (chi duy nhất trong họ Moringaceae gồm 13 loài). Khóa luận hệ thống hóa các nhóm hoạt chất thứ cấp chính đã biết trong cây Chùm ngây, bao gồm:

  • Nhóm hợp chất Phenolic: syringic acid, gallic acid, 4-hydroxymellein, vanilin, 4-hydroxyphenylacetonitrile, propyl p-hydroxybenzoate.
  • Nhóm Flavonoid: kaempferol, kaempferide, rutin, isoquercetin và các dẫn xuất glycoside gắn các phân tử đường rhamnose, glucose.
  • Nhóm Terpenoid và Steroid: $\beta$-sitosterol, stigmasterol, $\beta$-carotene, 3-O-(6'-O-oleoyl-$\beta$-D-glucopyranosyl)-$\beta$-sitosterol.
  • Nhóm Glycoside đặc trưng chứa lưu huỳnh và nitơ: các dẫn xuất glucosinolate, isothiocyanate, carbamate, thiocarbamate (như niazinin, niazimicin, niazirin, 4-($\alpha$-L-rhamnopyranosyloxy)benzyl isothiocyanate).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được tác giả triển khai bao gồm:

  • Phương pháp chiết xuất: Ngâm dầm bột lá khô với cồn ethanol 96° ở nhiệt độ phòng (4 lần, mỗi lần 2 ngày), gom dịch lọc và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không để thu cao ethanol thô. Tiến hành trích ly pha rắn (hòa tan cao ethanol, phối trộn silica gel, sấy khô đuổi dung môi ở 40°C) rồi rửa giải tuần tự bằng dãy dung môi có độ phân cực tăng dần: n-Hexane $\rightarrow$ Chloroform ($\text{CHCl}_3$) $\rightarrow$ Ethyl acetate ($\text{EA}$) $\rightarrow$ Methanol ($\text{MeOH}$).
  • Phương pháp phân lập: Sắc ký cột (SKC) hấp phụ pha thường sử dụng hạt silica gel (cỡ hạt 40–60 $\mu\text{m}$), sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20 kết hợp sắc ký lớp mỏng (SKLM) phân tích trên bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien $60\text{ F}{254}$ và pha đảo $\text{RP18 F}{254\text{s}}$ (Merck). Phát hiện vết chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm (đèn UVITEC) hoặc phun thuốc thử hiện màu $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% trong ethanol (kết hợp gia nhiệt) và $\text{FeCl}_3/\text{EtOH}$.
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^1\text{H}$-NMR ở tần số 500 MHz) và carbon-13 ($^{13}\text{C}$-NMR ở tần số 125 MHz), phổ DEPT (DEPT-90, DEPT-135), phổ tương tác dị nhân một liên kết (HSQC), phổ tương tác dị nhân qua nhiều liên kết (HMBC) trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer. Đo phổ khối lượng ESI-MS và HR-ESI-MS để xác định phân tử lượng và công thức phân tử.
  • Nguồn dữ liệu thực nghiệm: Thu được trực tiếp từ quá trình xử lý 7 kg lá Chùm ngây khô và phân tích phổ nghiệm các phân đoạn tinh khiết cô lập được.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu nêu rõ tầm quan trọng của nguồn dược liệu tự nhiên trong điều trị bệnh, thực trạng khai thác nguồn tài nguyên hóa thực vật tại Việt Nam và tính cấp thiết của việc tìm hiểu thành phần hóa sinh cây Chùm ngây (Moringa oleifera). Tác giả xác định mục tiêu của khóa luận là chiết xuất và khảo sát hóa học phân đoạn cao methanol nhằm đóng góp dữ liệu cấu trúc các hợp chất tự nhiên từ loài cây này.

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp các tư liệu thực vật học, dược lý học và hóa thực vật về cây Chùm ngây:

  • Đặc điểm thực vật: Cây thân gỗ nhỏ, chiều cao từ 8–10 m (cây lâu năm có thể đạt 12 m), đường kính thân 20–40 cm, lá kép lông chim 3 lần lẻ mọc cách. Quả có 3 cạnh dài 25–30 cm, hạt màu đen có 3 cánh màng màu trắng. Cây ra hoa vào tháng 1–2; quả non thu hái sau 55–77 ngày, quả chín sau 100–115 ngày. Tại Việt Nam, cây mọc rải rác từ Quảng Nam trở vào Nam (Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Phú Quốc).
  • Giá trị dinh dưỡng và y học cổ truyền: Lá chứa hàm lượng cao các khoáng chất và vitamin (vitamin C gấp 7 lần cam, provitamin A gấp 4 lần cà rốt, calci gấp 4 lần sữa, kali gấp 3 lần chuối, sắt gấp 3 lần rau diếp, protein gấp 2 lần sữa) cùng các amino acid như lysine (3,37 g/100g protein), methionine, cysteine, leucine, phenylalanine. Y học cổ truyền Ấn Độ và các nước sử dụng vỏ, hạt, lá, rễ để chữa viêm phế quản, sốt, đau dạ dày, hạ huyết áp, lợi tiểu, trị giun sán và lọc nước sinh hoạt.
  • Nghiên cứu dược lý hiện đại: Tác giả dẫn chứng các thử nghiệm khoa học gồm:
    • Tác dụng hạ lipid máu của quả trên thỏ (liều 200 mg/kg/ngày phối hợp thực phẩm giàu cholesterol trong 120 ngày làm giảm cholesterol, phospholipid, triglyceride, VLDL, LDL tương tự Lovastatin 6 mg/kg/ngày).
    • Tác dụng hạ huyết áp trên chuột của các dẫn xuất nitrile và thiocarbamate glycoside ly trích từ lá (Niazinin A, Niazinin B, Niazimicin).
    • Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết lá và hạt bằng ethanol đối với Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis.
    • Hoạt tính chống co giật (ED50 = 65,6 mg/ml) và ức chế phù nề chân chuột do carrageenan (ở liều 1000 mg/kg) của dịch chiết nước tại CEMAT (Guatemala).
    • Tác dụng ngừa thai của dịch chiết rễ trên chuột cắt buồng trứng tại Đại học Jiwaji (Ấn Độ); khả năng giảm nồng độ oxalate niệu và giảm sạn thận trên chuột tại Đại học Dược K.S. (Ấn Độ).
    • Khả năng ức chế virus Epstein-Barr và ức chế tế bào khối u in vitro của các hợp chất niazimicin, 4-($\alpha$-L-rhamnosyloxy)benzyl isothiocyanate.
  • Thành phần hóa học: Liệt kê công thức hóa học của 73 hợp chất đã được các nhà khoa học trên thế giới phân lập từ cây Chùm ngây (gồm 15 chất phenolic, 11 dẫn xuất flavonoid, 6 terpenoid-steroid, 26 glycoside và thiocarbamate/glucosinolate, cùng 15 hợp chất khác như vitamin, alkaloid, amino acid).

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết trang thiết bị, hóa chất và toàn bộ các bước thực nghiệm chiết xuất, phân đoạn và tinh chế hợp chất:

  • Xử lý nguyên liệu: 7 kg lá Chùm ngây khô sau khi phơi trong bóng râm và sấy nhiệt độ thấp được xay thành bột mịn. Chiết ngấm dệt với cồn 96° thu được 1,5 kg cao sệt ethanol.
  • Điều chế các phân đoạn cao thô: Tiến hành trích ly pha rắn 1,5 kg cao thô trên giá mang silica gel thu được 4 phân đoạn có độ phân cực tăng dần: cao Hexan (105 g), cao Chloroform (150 g), cao Ethyl acetate (360 g) và cao Methanol (800 g).
Phân đoạn cao thô Khối lượng thu nhận (g) Tỷ lệ so với cao EtOH thô (%)
Cao n-Hexane 105 7,00%
Cao Chloroform ($\text{CHCl}_3$) 150 10,00%
Cao Ethyl acetate (EA) 360 24,00%
Cao Methanol (MeOH) 800 53,33%
Tổng cao phân đoạn 1415 94,33%
  • Khảo sát cao Methanol: Dùng 800 g cao MeOH thực hiện sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi giải ly Ethyl acetate : Methanol (từ 100% EA, 10:1, 5:1, 1:1 đến 100% MeOH). Kiểm tra SKLM và gom thành 5 phân đoạn ký hiệu M1 đến M5.
  • Phân lập hợp chất MO17: Từ phân đoạn M4 (62,031 g), tiến hành SKC silica gel với hệ giải ly $\text{EA} : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O}$ gradient (20:1:1 $\rightarrow$ 15:1:1 $\rightarrow$ 10:1:1 $\rightarrow$ 7:1:1 $\rightarrow$ 5:1:1 $\rightarrow$ 100% MeOH) thu được 6 phân đoạn phụ (M4.1 đến M4.6). Lấy phân đoạn M4.4 (4,202 g) tiếp tục SKC với hệ dung môi $\text{EA} : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O}$ (20:1:0,1; 15:1:0,1; 10:1:0,1; 5:1:0,1) thu được 4 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn M4.4.4 (49 mg) cho một vết chính màu vàng trên SKLM, được tinh chế tiếp bằng SKC với hệ dung môi $\text{CHCl}_3 : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O}$ (tỉ lệ 7:1:0,1) thu được 6 mg hợp chất MO17 (dạng bột màu trắng).
  • Phân lập hợp chất MO18: Từ phân đoạn phụ M4.5 (8,473 g), tiến hành SKC với hệ dung môi $\text{EA} : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O}$ (tỉ lệ 20:1:1; 15:1:1; 9:2:0,5; 8:4:1 và 100% MeOH) thu được 5 phân đoạn nhỏ. Đoạn M4.5.4 (515 mg) có 2 vết chính trên SKLM (màu vàng và màu đen), tiếp tục cho qua SKC silica gel với hệ dung môi giải ly $\text{EA} : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O}$ (tỉ lệ 9:2:1) cô lập được 39 mg hợp chất MO18 (tinh thể hình kim màu trắng).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này dành cho việc giải mã cấu trúc hóa học của hai mẫu chất MO17 và MO18 dựa trên dữ liệu phổ nghiệm đối chiếu với các công trình quốc tế đã xuất bản.

1. Biện luận cấu trúc hợp chất MO17

Hợp chất MO17 là dạng bột màu trắng, hiện màu vàng với thuốc thử $\text{H}2\text{SO}4/\text{EtOH}$. Phổ khối ESI-MS cho các pic ion phân tử giả tại $m/z\ 302,1046\ [\text{M}+\text{Na}]^+$ và $269,2\ [\text{M}+\text{H}]^+$, chỉ ra sự tồn tại của hai công thức phân tử là $\text{C}{14}\text{H}{17}\text{NO}5$ và $\text{C}{13}\text{H}_{16}\text{O}_6$.

  • Phổ $^{13}\text{C}$-NMR và DEPT thể hiện 27 carbon. Sau khi trừ đi 12 carbon thuộc 2 phân tử đường $\alpha$-L-rhamnose, phần aglycone còn lại 15 carbon: một carbon aldehyde [$\delta_\text{C}\ 191,4$ (C-7)], 12 carbon của hai vòng benzen thế 1,4, một carbon $\text{sp}^2$ tứ cấp [$\delta_\text{C}\ 119,3$ (C-8''')] và một carbon methylen [$\delta_\text{C}\ 21,5$ (C-7''')].
  • Phổ $^1\text{H}$-NMR xác nhận tín hiệu proton aldehyde tại $\delta_\text{H}\ 9,87$ (1H, s, H-7), các proton thơm của hai hệ vòng 1,4-thế tại vùng $\delta_\text{H}\ 7,10 - 7,88$, các proton anomer của đường rhamnose tại $\delta_\text{H}\ 5,54$ (1H, d, $J = 1\text{ Hz}$, H-1') và $\delta_\text{H}\ 5,35$ (1H, s, H-1'''').
  • Tương quan HMBC khẳng định proton anomer H-1' ($\delta_\text{H}\ 5,54$) tương tác với carbon C-4 ($\delta_\text{C}\ 160,8$), proton anomer H-1'''' ($\delta_\text{H}\ 5,35$) tương tác với C-4''' ($\delta_\text{C}\ 155,4$). Proton methylen $\delta_\text{H}\ 3,94$ (2H, s, $\text{H}2-7'''$) tương tác với các carbon thơm C-2'''/C-6''' ($\delta\text{C}\ 129,2$), carbon tứ cấp C-1''' ($\delta_\text{C}\ 124,3$) và carbon nhóm nitrile C-8''' ($\delta_\text{C}\ 119,3$). Proton aldehyde $\delta_\text{H}\ 9,87$ tương tác với C-1 ($\delta_\text{C}\ 130,4$).
  • Kết luận: Mẫu MO17 là hỗn hợp của 2 chất gồm 4-($\alpha$-L-rhamnopyranosyloxy)-benzaldehyde và niazirin.
Vị trí carbon $\delta_\text{C}$ thực nghiệm (ppm) $\delta_\text{H}$ thực nghiệm (ppm, $J$ tính bằng Hz) Tương quan HMBC ($\text{H} \rightarrow \text{C}$)
Phần 4-($\alpha$-L-rhamnopyranosyloxy)-benzaldehyde
C-1 130,4 - -
C-2, C-6 131,6 7,88 (2H, d, $J = 8,5\text{ Hz}$) C-1, C-3, C-4, C-7
C-3, C-5 116,8 7,24 (2H, d, $J = 8,5\text{ Hz}$) C-1, C-4
C-4 160,8 - -
C-7 (-CHO) 191,4 9,87 (1H, s) C-1, C-2, C-6
C-1' (đường) 98,4 5,54 (1H, d, $J = 1,0\text{ Hz}$) C-4, C-3', C-5'
C-6' ($-\text{CH}_3$) 17,9 1,13 (3H, d, $J = 6,0\text{ Hz}$) C-4', C-5'
Phần Niazirin
C-1''' 124,3 - -
C-2''', C-6''' 129,2 7,29 (2H, d, $J = 8,5\text{ Hz}$) C-4''', C-7'''
C-3''', C-5''' 116,8 7,10 (2H, d, $J = 8,5\text{ Hz}$) C-1''', C-4'''
C-4''' 155,4 - -
C-7''' ($-\text{CH}_2-$) 21,5 3,94 (2H, s) C-1''', C-2''', C-6''', C-8'''
C-8''' ($-\text{CN}$) 119,3 - -
C-1'''' (đường) 98,4 5,35 (1H, s) C-4'''
C-6'''' ($-\text{CH}_3$) 17,8 1,09 (3H, d, $J = 6,0\text{ Hz}$) C-4'''', C-5''''

2. Biện luận cấu trúc hợp chất MO18

Hợp chất MO18 thu nhận ở dạng tinh thể hình kim màu trắng, hiện màu vàng với thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4/\text{EtOH}$.

  • Phổ $^1\text{H}$-NMR ghi nhận: Một mũi đơn rộng của nhóm amin bậc nhất $-\text{NH}2$ tại $\delta\text{H}\ 8,54$ (br s); hệ spin vòng benzen thế đối xứng 1,4 gồm 2 mũi đôi tại $\delta_\text{H}\ 7,41$ (2H, d, $J = 8,5\text{ Hz}$, H-3/H-5) và $\delta_\text{H}\ 7,03$ (2H, d, $J = 8,5\text{ Hz}$, H-2/H-6); một nhóm methylen gắn dị tố tại $\delta_\text{H}\ 3,91$ (2H, s, $\text{H}2-7$). Tín hiệu phần đường $\alpha$-rhamnose gồm proton anomer $\delta\text{H}\ 5,39$ (1H, d, $J = 1,5\text{ Hz}$, H-1'), bốn proton carbinol $>\text{CHOH}$ tại $\delta_\text{H}\ 3,78$ (1H, dd, $J = 3,5$ và $2,0\text{ Hz}$, H-2'), $\delta_\text{H}\ 3,64$ (1H, dd, H-3'), $\delta_\text{H}\ 3,45$ (1H, m, H-5'), $\delta_\text{H}\ 3,18$ (1H, t, $J = 9,5\text{ Hz}$, H-4') và một nhóm methyl tại $\delta_\text{H}\ 1,07$ (3H, d, $J = 6,0\text{ Hz}$, $\text{H}_3-6'$).
  • Phổ $^{13}\text{C}$-NMR và DEPT cho thấy MO18 có 13 carbon: 6 carbon thuộc phân tử đường $\alpha$-rhamnose ($\delta_\text{C}\ 98,3$ cho C-1'; $71,8$ cho C-4'; $70,4$ cho C-3'; $70,0$ cho C-2'; $69,5$ cho C-5'; $17,9$ cho C-6') và 7 carbon khung aglycone. Trong 7 carbon này có một carbon methylen gắn nhóm amin tại $\delta_\text{C}\ 41,6$ (C-7), một carbon thơm mang oxy tại $\delta_\text{C}\ 156,1$ (C-1), một carbon thơm tứ cấp tại $\delta_\text{C}\ 127,3$ (C-4), bốn carbon thơm mang hydro gồm $\delta_\text{C}\ 130,6$ (C-3/C-5) và $\delta_\text{C}\ 116,4$ (C-2/C-6).
  • Tương quan HMBC: Proton anomer $\delta_\text{H}\ 5,39$ tương tác với C-1 ($\delta_\text{C}\ 156,1$), chứng minh gốc đường $\alpha$-rhamnose nối vào vòng thơm qua cầu oxy tại vị trí C-1. Proton methylen $\delta_\text{H}\ 3,91$ tương quan với carbon C-4 ($\delta_\text{C}\ 127,3$) và hai carbon CH thơm C-3/C-5 ($\delta_\text{C}\ 130,6$), chứng tỏ nhóm aminomethyl ($-\text{CH}_2\text{NH}_2$) nằm ở vị trí C-4 đối diện.
  • Kết luận: Hợp chất MO18 được xác định là 4-($\alpha$-rhamnosyloxy)benzylamine.
Vị trí carbon $\delta_\text{C}$ (ppm) $\delta_\text{H}$ (ppm, $J$ tính bằng Hz) Tương quan HMBC ($\text{H} \rightarrow \text{C}$)
1 156,1 - -
2, 6 116,4 7,03 (2H, d, $J = 8,5\text{ Hz}$) C-1, C-4
3, 5 130,6 7,41 (2H, d, $J = 8,5\text{ Hz}$) C-1, C-7
4 127,3 - -
7 ($-\text{CH}_2-$) 41,6 3,91 (2H, s) C-3, C-4, C-5
$-\text{NH}_2$ - 8,54 (2H, br s) -
1' (anomer) 98,3 5,39 (1H, d, $J = 1,5\text{ Hz}$) C-1, C-2', C-3', C-5'
2' 70,0 3,78 (1H, dd, $J = 3,5;\ 2,0\text{ Hz}$) C-1', C-3', C-4'
3' 70,4 3,64 (1H, dd, $J = 9,5;\ 3,5\text{ Hz}$) C-1', C-2', C-4', C-5'
4' 71,8 3,18 (1H, t, $J = 9,5\text{ Hz}$) C-2', C-3', C-5', C-6'
5' 69,5 3,45 (1H, m) C-1', C-4', C-6'
6' ($-\text{CH}_3$) 17,9 1,07 (3H, d, $J = 6,0\text{ Hz}$) C-4', C-5'

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tác giả tóm tắt toàn bộ tiến trình phân lập thành công các hợp chất từ phân đoạn cao phân cực MeOH và việc giải cấu trúc dựa trên phổ NMR và MS. Đồng thời, chương này đưa ra các đề xuất về việc tiếp tục phân tách các phân đoạn còn lại và thử nghiệm hoạt tính sinh học.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đạt được các kết quả định lượng cụ thể:

  • Từ 7 kg lá Chùm ngây khô ban đầu, chiết ngâm dầm với ethanol 96° đã thu được 1,5 kg cao sệt thô.
  • Phân tách pha rắn cao thô tạo ra 4 phân đoạn: cao n-hexane (105 g), cao chloroform (150 g), cao ethyl acetate (360 g) và cao methanol (800 g, chiếm tỷ trọng lớn nhất với 53,33%).
  • Phân đoạn thành công 800 g cao methanol qua nhiều lần sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi tăng dần độ phân cực, cô lập được 2 mẫu chất tinh sạch từ phân đoạn M4:
    • Mẫu MO17: Khối lượng 6 mg (dạng bột màu trắng), được xác định là hỗn hợp của 2 chất gồm 4-($\alpha$-L-rhamnopyranosyloxy)-benzaldehyde ($\text{C}{13}\text{H}{16}\text{O}6$) và niazirin ($\text{C}{14}\text{H}_{17}\text{NO}_5$).
    • Mẫu MO18: Khối lượng 39 mg (tinh thể hình kim màu trắng), được xác định là hợp chất 4-($\alpha$-rhamnosyloxy)benzylamine ($\text{C}{13}\text{H}{19}\text{NO}_4$).
  • Về mặt học thuật, đề tài cung cấp bộ dữ liệu quy kết tín hiệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, HSQC, HMBC) và khối phổ chi tiết của các hợp chất rhamnoside phenolic/benzylamine có nguồn gốc từ lá cây Chùm ngây sinh trưởng tại Đồng Nai, đóng góp cơ sở dữ liệu thực nghiệm phục vụ việc định danh hóa thực vật của loài cây này tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản ghi nhận các hạn chế và hướng mở nghiên cứu như sau:

  • Hạn chế của đề tài:
    • Nghiên cứu mới chỉ tập trung xử lý và phân lập các hợp chất từ phân đoạn M4 của cao methanol; các phân đoạn khác (M1, M2, M3, M5) cũng như các cao thô kém phân cực hơn (n-hexane, chloroform, ethyl acetate) chưa được khảo sát chi tiết.
    • Mẫu MO17 cô lập được vẫn tồn tại dưới dạng hỗn hợp của 2 hợp chất (4-($\alpha$-L-rhamnopyranosyloxy)-benzaldehyde và niazirin), chưa thể tách riêng từng chất đơn lẻ ở trạng thái tinh khiết tuyệt đối.
    • Đề tài dừng lại ở việc chiết tách và định danh cấu trúc hóa học, chưa tiến hành đánh giá thực nghiệm các hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, chống oxy hóa, gây độc tế bào) của các hợp chất đã cô lập.
  • Hướng nghiên cứu tiếp (theo kiến nghị của tác giả):
    • Tiếp tục quy trình phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất còn lại trong phân đoạn cao methanol và các phân đoạn cao thô khác.
    • Thực hiện các thử nghiệm sàng lọc hoạt tính sinh học trên các hợp chất tinh khiết đã thu nhận được (đặc biệt là MO18).
    • Mở rộng đối tượng nghiên cứu thành phần hóa học sang các bộ phận khác của cây Chùm ngây như thân, rễ, hoa và quả.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích cho:

  • Giảng viên, sinh viên và học viên cao học chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Dược học: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về trích ly phân bố pha rắn đối với các dịch chiết giàu chất phân cực và quy trình sắc ký cột silica gel phân đoạn sử dụng hệ dung môi ba thành phần $\text{CHCl}_3 : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O}$ và $\text{EA} : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O}$.
  • Những người nghiên cứu về hóa thực vật chi Moringa: Giá trị tham khảo trực tiếp nằm ở bảng quy kết độ dịch chuyển hóa học ($\delta_\text{C}$, $\delta_\text{H}$), hằng số ghép spin ($J$) và phân tích tương quan phổ 2D (HMBC, HSQC) của khung benzylamine và benzaldehyde liên kết gốc đường $\alpha$-L-rhamnoside.

Câu hỏi thường gặp

1. Khối lượng nguyên liệu lá Chùm ngây ban đầu là bao nhiêu và lượng các phân đoạn cao thô thu được như thế nào?
Nghiên cứu sử dụng 7 kg lá Chùm ngây khô thu hái tại huyện Xuân Lộc, tỉnh Đồng Nai. Sau khi ngâm chiết với cồn ethanol 96° thu được 1,5 kg cao ethanol sệt thô. Qua trích ly pha rắn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần, tác giả thu được 105 g cao n-hexane, 150 g cao chloroform, 360 g cao ethyl acetate và 800 g cao methanol.

2. Hợp chất MO17 phân lập được là chất đơn lẻ hay hỗn hợp, và cấu trúc của nó được xác định ra sao?
Hợp chất MO17 (khối lượng 6 mg, dạng bột màu trắng) được xác định là hỗn hợp của 2 chất: 4-($\alpha$-L-rhamnopyranosyloxy)-benzaldehyde và niazirin. Điều này được chứng minh bằng phổ khối ESI-MS ghi nhận hai pic ion phân tử giả ($m/z\ 302,1046\ [\text{M}+\text{Na}]^+$ ứng với $\text{C}{14}\text{H}{17}\text{NO}5$ của niazirin và $269,2\ [\text{M}+\text{H}]^+$ ứng với $\text{C}{13}\text{H}{16}\text{O}6$), đồng thời phổ NMR thể hiện sự tồn tại song song của một nhóm aldehyde ($\delta\text{C}\ 191,4; \delta\text{H}\ 9,87$) và một nhóm nitrile ($\delta_\text{C}\ 119,3$) gắn qua nhóm methylen ($\delta_\text{C}\ 21,5; \delta_\text{H}\ 3,94$).

3. Đặc điểm cấu trúc và dữ liệu phổ nào chứng minh hợp chất MO18 là 4-($\alpha$-rhamnosyloxy)benzylamine?
Hợp chất MO18 (39 mg, tinh thể hình kim màu trắng) có 13 carbon, bao gồm 6 carbon của đường $\alpha$-rhamnose và 7 carbon của aglycone. Dữ liệu phổ chứng minh cấu trúc gồm: tín hiệu của nhóm $-\text{NH}2$ tự do ($\delta\text{H}\ 8,54$, br s), nhóm methylen liên kết amin ($\delta_\text{C}\ 41,6; \delta_\text{H}\ 3,91$), hệ vòng thơm đối xứng 1,4 ($\delta_\text{C}\ 130,6; 116,4; 156,1; 127,3$). Phổ HMBC cho thấy proton anomer của đường ($\delta_\text{H}\ 5,39$) tương tác với carbon thơm C-1 ($\delta_\text{C}\ 156,1$) và proton methylen tương tác với carbon tứ cấp C-4 ($\delta_\text{C}\ 127,3$) cùng C-3/C-5 ($\delta_\text{C}\ 130,6$), khẳng định khung benzylamine mang nhóm thế glycoside ở vị trí para.

4. Quy trình sắc ký cột phân lập MO17 và MO18 từ phân đoạn M4 đã sử dụng các hệ dung môi nào?
Từ 62,031 g phân đoạn M4, tác giả sắc ký cột silica gel pha thường bằng hệ dung môi $\text{EA} : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O}$ (tỉ lệ từ 20:1:1 đến 100% MeOH) để chia thành các phân đoạn nhỏ. Sau đó, MO17 được tinh chế từ phân đoạn M4.4 bằng hệ $\text{CHCl}_3 : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O}$ (7:1:0,1). Hợp chất MO18 được tinh chế từ phân đoạn M4.5 qua phân đoạn phụ M4.5.4 bằng hệ dung môi $\text{EA} : \text{MeOH} : \text{H}_2\text{O}$ (9:2:1).

5. Cơ sở thực vật học của mẫu lá Chùm ngây trong nghiên cứu được kiểm chứng ở đâu?
Mẫu lá cây được thu gom tại huyện Xuân Lộc, tỉnh Đồng Nai thông qua nguồn cung cấp của Công ty TNHH SX TM Hạnh Thông, sau đó được đưa đi giám định tên khoa học chính xác (Moringa oleifera Lam., họ Moringaceae) tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM trước khi tiến hành chiết xuất thực nghiệm.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Tạ Trần Kiên đã thực hiện chiết xuất phân đoạn thành công 1,5 kg cao thô từ 7 kg bột lá khô cây Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) thu hái tại Đồng Nai. Bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thường kết hợp sắc ký lớp mỏng, nghiên cứu đã cô lập được 6 mg mẫu MO17 (dạng bột màu trắng) và 39 mg hợp chất MO18 (tinh thể hình kim màu trắng) từ phân đoạn cao phân cực methanol. Phân tích kết hợp phổ khối lượng và các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, HSQC, HMBC) đã xác định MO17 là hỗn hợp của 4-($\alpha$-L-rhamnopyranosyloxy)-benzaldehyde và niazirin, trong khi MO18 là hợp chất 4-($\alpha$-rhamnosyloxy)benzylamine.