ĐẶT VẤN ĐỀ Về tình hình mắc bệnh ung thư vú trên thế giới, ung thư vú đứng vị trí thứ hai trong nhóm bệnh lý ung thư gây tử vong cao ở phụ nữ (World Health Organization – WHO, 2018. Trên thế giới, hàng năm có khoảng 2,1 triệu trường hợp ung thư vú mới được chẩn đoán và trong năm 2018 có 670.000 trường hợp tử vong do mắc ung thư vú (Ghoncheh et al. Ở Việt Nam vào năm 2018, có khoảng 15.229 trường hợp ung thư vú mới được phát hiện (WHO, 2018). Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu về dấu chứng sinh tiềm năng để ứng dụng trong chẩn đoán và tiên lượng sớm đối với các bệnh lý ung thư, cụ thể là là hướng nghiên cứu tính chất methyl hóa bất thường trên vùng promoter các gen kiểm soát cơ chế sinh ung đối với bệnh lý ung thư vú.
Gen Polyposis coli adenomatous (APC) là gen ức chế khối u (Polakis et al, 1997; NCBI, Genomic context). Gen APC mã hóa protein APC, đây là protein tham gia con đường điều hòa kinh điển, tương tác với β-catenin trong tế bào chất và thúc đẩy sự phosphoryl hóa β-catenin ức chế khối u (William et al, 2018), đóng vai trò trong quá trình thoái hóa protein cat-catenin, kích hoạt Tcf/Lef và gây ra sự sao chép bất thường của các chất gây ung thư (Fearnhead et al, 2001). Công trình nghiên cứu của Begam và cộng sự (2018), dựa vào phương pháp QMSP (Quantiative Methylation specific Polymerase chain reation) và phương pháp MSP (Methylation-specific PCR), xác định tần số methyl hóa gen APC là 38% trên tổng số 50 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 0% trên tổng số 45 mẫu lành ở Ấn Độ. Gen Death-Associated Protein Kinase (DAPK) thuộc nhóm gen điều hòa chu trình tế bào định vị trên nhiễm sắc thể 9q21.33 (Truong et al.
DAPK là một protein kinase đa chức năng liên quan đến quá trình điều hòa apoptosis, autophagy, membrane blebbing và phản ứng viêm (Huang et al., 2018), đóng vai trò trong việc điều khiển tế bào chất theo chương trình (Truong et al. Công trình nghiên cứu của Yadav và cộng sự (2018), nghiên cứu về sự methyl hóa trên gen DAPK trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú dựa vào MSP (Methylation-specific PCR) và phương pháp QMSP (Quantiative Methylation specific Polymerase chain reation), xác định tần vii số methyl hóa bất thường trên gen DAPK là 55% trên 60 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 0% trên 60 mẫu lành ở Ấn Độ. Tiếp nối hướng nghiên cứu về dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên lượng, chẩn đoán sớm một số bệnh ung thư vú chúng tôi tiến hành đề tài khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát tính chất methyl hóa bất thường trên gen APC và DAPK trên bộ mẫu ung thư vú ở Việt Nam: phân tích tổng hợp & khảo sát thực nghiệm”. Mục tiêu nghiên cứu Xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường (vượt mức) trên vùng promoter gen APC, DAPK trong bệnh ung thư vú trên thế giới và ở Việt Nam, tập trung vào nội dung phân tích tổng hợp và khảo sát thực nghiệm bằng phương pháp Nested- MSP trên một số mẫu bệnh phẩm (mẫu mô vú) ở người Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu Phân tích tổng hợp (Meta – analysis): thu thập dữ liệu khoa học trên thế giới và dựa vào công cụ phần mềm phù hợp để xác định chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio: OR) phản ánh độ chênh của sự xuất hiện tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC và DAPK ở bộ mẫu ung thư vú so với ở bộ mẫu lành. Khảo sát trên máy tính: thu thập và khảo sát bộ mồi phù hợp với phương pháp Nested- MSP nhằm xác định tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC và DAPK trên bộ mẫu ung thư vú trên bộ mẫu lành. Khảo sát thực nghiệm: thiết lập quy trình Nested-MSP khảo sát tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen APC và DAPK đối với một số mẫu bệnh phẩm ung thư vú trên người Việt Nam. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I.
Gen Polyposis Coli Adenomatous (APC) Hình I.1 Vị trí gen APC trên nhiễm sắc thể số 5 (https://www.gov/gene/324) Gen Polyposis coli adenomatous (APC) là gen ức chế khối u, định vị trên nhiễm sắc thể số 5 (5q21 – q22) (Polakis et al. Gen APC mã hóa protein APC (2853 amino acid) tham gia vào con đường truyền tín hiệu Wnt (con đường kinh điển), giúp duy trì ổn định các vi ống trong kì trung gian và quá trình nguyên phân, kiểm soát sự tăng sinh, biệt hóa, di cư và chu trình chết theo chương trình (Apoptosis) của tế bào (McCartney et al. Protein APC trực tiếp tham gia vào cơ chế điều hòa âm hoạt động của b-catein, liên quan giải phóng quá trình phiên mã Tcf/Lef (McCartney et al. Gen Death-Associated Protein Kinase (DAPK) Hình I.2 Vị trí gen DAPK trên nhiễm sắc thể số 9 (https://www.gov/gene/1612) Gen Death-Associated Protein Kinase (DAPK) thuộc nhóm gen điều hòa chu trình tế bào, định vị trên nhiễm sắc thể 9q21.33 (Truong et al.
DAPK là một protein kinase đa chức năng liên quan đến quá 1 trình điều hòa apoptosis, autophagy, membrane blebbing và phản ứng viêm (Huang et al., 2018), đóng vai trò trong việc điều khiển tế bào chất theo chương trình (Truong et al. Epigenetics và sự methyl hóa vượt mức trên DNA Epigenetics Epigenetics là những thay đổi ở mức độ biểu hiện kiểu gen mà không làm thay đổi trình tự DNA (Chen et al. Epigenetics bao gồm sự methyl hóa DNA, biến đổi histone (H3, H4, H2A và H2B) và microRNAs (miRNAs) (Chen et al. Trong tế bào thường, các cơ chế epigenetics đóng vai trò ổn định cấu trúc nhiễm sắc thể và điều hòa quá trình sao chép DNA, sửa chữa sai hỏng cấp độ DNA, phiên mã và biểu hiện gen (Crider et al.
Một số tác nhân dẫn đến biến đổi bất thường trong cơ chế Epigenetics: yếu tố môi trường: kim loại nặng, thuốc trừ sâu, khí thải động cơ điezen, khói thuốc lá, hydrocarbon dạng vòng thơm; yếu tố nội sinh: nội tiết tố, chất phóng xạ, vi rút và vi khuẩn … (Weinhold et al. Methyl hóa DNA và đảo CpG Sự methyl hóa DNA là phản ứng hóa học xúc tác bởi enzyme DNA methyltransferases DNMTs tạo thành 5-methlcytosine, gắn nhóm methyl (CH3) vào phân tử cacbon số 5 của cytosine thuộc các cặp dinucleotide CpG (Moore, 2013). Sự methyl hóa là biến đổi Epigenetics, xảy ra ở động vật có vú (Kulis et al. Sự methyl hóa DNA đóng vai trò bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen và hình thành khối u (AKM, Maruf Raza, 2016).
Sự methyl hóa DNA bất thường dẫn đến sự hình thành và diễn tiến của cơ chế sinh ung thư (Crider et al., 2012; MKA et al. Sự methyl hóa DNA vượt mức tại vùng khởi đầu của gen ức chế khối u, làm ức chế quá trình phiên mã và giảm tăng sinh tế bào (Wajed et al. Sự methyl hóa DNA dưới mức làm ức chế im lặng trong phiên mã, kiểm soát hoạt động của protooncogenes và tăng khả năng tăng sinh tế bào (Wajed et al. Do đó, sự methy hóa DNA ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển và hoạt động của tế bào (Kulis et al.
2 Đảo CpG hiện diện trên vùng trình tự promoter thuộc các gen chức năng (gen giữ nhà: “housekeeping gene”), có kích thước khoảng 100-1000bp với tỷ lệ GC lớn hơn 50% (Goldman et al., 2001; Virani et al. Cơ chế methyl hóa DNA diễn ra trên các đảo CpG liên quan đến sự điều hòa biểu hiện gen, im lặng gen, in dấu gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X và sự hình thành khối u (Takai et al, 2002). Tính chất methyl hóa vượt mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen kiểm soát cơ chế sinh ung (tumour suppresor gen) là dấu chứng sinh học đối với các bệnh lý ung thư. Dấu chứng sinh học Dấu chứng sinh học là các phân tử sinh học: protein, acid nucleic (DNA hoặc RNA), polysaccharide hiện diện trong máu, các chất dịch, hoặc các mô, biểu thị đặc trưng tình trạng bình thường hay bất bình thường của cơ thể con người (National Cencar Institute, 2016).
Một số dấu chứng sinh học tiềm năng được ứng dụng trong tiên lượng, chẩn đoán và khảo sát đáp ứng điều trị đối với một số bệnh lý ở người: CA- 125 (Cancer Antigen-125) đối với ung thư buồng trứng; CEA (Carcinoembryonic antigen) trong ung thư đại trực tràng và CA 15-3 (Cancer Antigen 15-3) trong ung thư vú (Paczesny et al, 2015; MJ et al. Ung thư vú Theo Tổ chức y tế thế giới, ung thư vú là loại bệnh lý đứng hàng thứ hai trong những dạng ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ (WHO, 2018; Nguyen et al, 2018). Trên thế giới, hàng năm có khoảng 2.1 triệu trường hợp ung thư vú mới được chẩn đoán và trong năm 2018 có 670.000 trường hợp tử vong do mắc ung thư vú (Ghoncheh et al. WHO ghi nhận ở Việt Nam vào năm 2018, có khoảng 15.229 trường hợp ung thư vú mới được phát hiện (WHO, 2018).
Ung thư vú là dạng ung thư biểu mô, chủ yếu liên quan đến vùng nội mô của tuyến sữa hoặc tiểu thùy và ống dẫn sữa (Ataollahi et al. Ung thư vú là một bệnh đa giai đoạn: I, IIA, IIB, III, và IV (Ataollahi et al., 2015), xảy ra ở phần lớn phụ nữ mãn kinh biểu hiện cao trên thụ thể estrogen (ER). Thụ thể estrogen âm tính với ung thư biểu mô tuyến vú, đóng vai chính trong phát triển ung thư vú theo hướng (1) các chất chuyển hóa ER có thể làm biến đổi hoặc tạo ra các gốc tự do gây đột biến DNA, (2) 3 và ER có thể tăng sinh trong tế bào tiền ung thư và ung thư (Ataollahi et al. Các yếu tố dẫn đến ung thư vú: mức độ hormone cao, chế độ ăn uống mất cân bằng dinh dưỡng,… (Ataollahi et al.
Tình hình nghiên cứu tính chất methyl hóa trên gen APC và DAPK đối với bệnh ung thư vú Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp MSP (Methylation-specific PCR) phân tích tính chất methyl hóa trên gen APC hoặc DAPK trên bộ mẫu ung thư vú. Các kết quả nghiên cứu này bộc lộ tần số methyl hóa trên gen APC hoặc DAPK dao động, biến thiên đối với bộ mẫu ung thư vú thuộc quần thể người bệnh khác nhau. Tiêu biểu là công trình nghiên cứu của Swellam và cộng sự (2015) dựa vào phương pháp MSP, xác định tần số methyl hóa gen APC là 93,38% trên tổng số 121 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 0% trên tổng số 66 mẫu lành ở Ai Cập. Theo công trình nghiên cứu của Begam và cộng sự (2018) sử dụng phương pháp MSP (Methylation-specific PCR) xác định tần số methyl hóa gen APC là 38% trên tổng số 50 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 0% trên tổng số 45 mẫu lành ở Ấn Độ.