Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp tập trung vào lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên, một chuyên ngành có vai trò quan trọng trong việc tìm kiếm các hoạt chất sinh học ứng dụng cho y dược từ nguồn tài nguyên thực vật phong phú của Việt Nam.

  • Lý do chọn đề tài và bối cảnh thực tiễn: Chi Đinh lăng (Polyscias) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian để bồi bổ cơ thể, tăng cường thể lực, chống lão hóa và hỗ trợ điều trị nhiều chứng bệnh (nhức đầu, đau tức ngực, ức chế tế bào ung thư buồng trứng). Mặc dù một số loài trong chi như Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa) hay Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana) đã được nghiên cứu nhiều, loài Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) tại thời điểm thực hiện đề tài mới chỉ được khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học trên lá tươi mà chưa có nghiên cứu sâu trên vỏ thân. Do đó, tác giả lựa chọn vỏ thân cây Đinh lăng trổ để tiếp tục khảo sát thành phần hóa học.
  • Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu:
    1. Thu hái, xử lý mẫu và khảo sát độ ẩm của vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.).
    2. Điều chế cao chiết tổng etanol từ bột vỏ thân và thực hiện phân bố lỏng - lỏng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, etyl acetat, n-butanol).
    3. Sử dụng sắc ký cột cổ điển và sắc ký bản mỏng để phân lập, tinh chế các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn cao chiết.
    4. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (NMR 1D, 2D và LC/MS).
  • Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
    • Đối tượng nghiên cứu: Vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.), thuộc chi Polyscias, họ Nhân sâm (Araliaceae). Mẫu thực vật được Th.S Liêu Hồ Mỹ Trang (Bộ môn Hóa Thực vật – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh) giám định tên khoa học.
    • Phạm vi không gian và thời gian: Mẫu vỏ thân cây tươi được thu hái tại tỉnh Khánh Hòa vào tháng 7 năm 2011.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên cơ sở lý thuyết về hóa thực vật học, cụ thể là cấu trúc và tính chất của các nhóm hợp chất thứ cấp phổ biến trong chi Polyscias như saponin triterpenoid khung oleanan, steroid, dẫn xuất acid béo và flavonoid.

  • Phương pháp chiết tách và cô lập:
    • Chiết xuất: Dùng phương pháp ngâm dầm bột vỏ thân khô ở nhiệt độ phòng với dung môi etanol $96^\circ$ trong thời gian 24 giờ, lặp lại nhiều lần để thu dịch chiết toàn phần, sau đó cô quay thu hồi dung môi thu được cao tổng.
    • Chiết phân bố lỏng - lỏng: Phân tách cao tổng etanol lần lượt qua các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl acetat và n-butanol.
    • Sắc ký: Áp dụng sắc ký cột silica gel (kích thước hạt 0,06 mm, Merck) pha thuận kết hợp kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 $F_{254}$ (Merck) và bản mỏng pha đảo RP-18 (Merck). Thuốc thử hiện hình sử dụng dung dịch $H_2SO_4$ đặc.
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D: Phổ $^1H\text{-NMR}$ (ghi trên máy Bruker AC.20, tần số 500 MHz) và $^{13}C\text{-NMR}$ kết hợp kỹ thuật DEPT (ghi trên máy Bruker AC.200, tần số 500 MHz).
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D: Phổ tương quan proton - proton ($^1H\text{-}^1H\text{ COSY}$), phổ tương quan dị hạt qua 1 liên kết (HSQC) và phổ tương quan dị hạt tầm xa qua 2, 3 liên kết (HMBC). Các phổ NMR được đo tại Phòng Phân tích Cấu trúc, Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Hà Nội).
    • Phổ khối lượng: Phổ khối lượng sắc ký lỏng ion hóa phun mù điện tử (LC/MS-ESI, ghi ở chế độ ion âm).
  • Nguồn dữ liệu thực nghiệm: Dữ liệu thực nghiệm thu được từ quá trình thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa học – Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh và số liệu phổ nghiệm từ Viện Hóa học, kết hợp dữ liệu đối chiếu từ các công trình nghiên cứu về chi Polyscias của các tác giả trong và ngoài nước.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học về thực vật học, thành phần hóa thực vật và dược tính sinh học của chi Polyscias:

  • Mô tả thực vật: Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) là cây bụi cao 3–4 m, thân ít phân nhánh; lá dạng kép lông chim đều đặn, màu lục sáng viền trắng đặc trưng, cuống lá to có sọc hoặc đốm, lá chét thuôn mép có răng cưa không đều.
  • Thành phần hóa học: Tác giả tổng hợp dữ liệu hóa thực vật của các loài thuộc chi Polyscias. Đối với loài Polyscias guilfoylei, nghiên cứu năm 2010 của Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã phân lập được 8 hợp chất từ lá, chủ yếu là isophytol, acid oleanolic và các saponin chứa aglycon là acid oleanolic liên kết với các gốc đường glucuronic acid và glucose. Bên cạnh đó, các nghiên cứu trên các loài cùng chi (P. amplifolia, P. dichroostachya, P. filicifolia, P. fulva, P. fruticosa, P. balfouriana, P. scutellaria, P. nodosa, P. murrayi) cho thấy sự hiện diện phong phú của saponin triterpenoid khung oleanan, hederagenin, steroid (stigmasterol, spinasterol), flavonoid, polyacetylen và tinh dầu.
  • Dược tính và hoạt tính sinh học: Tổng quan ghi nhận các tác dụng dược lý thực nghiệm của chi Đinh lăng: tăng lực, kéo dài sức chịu đựng, chống stress và trầm cảm (ở liều 45–180 mg/kg thể trọng trên chuột nhắt trắng), lợi tiểu, kháng khuẩn (Staphylococcus aureus), kháng đột biến gen, chống loét dạ dày và ức chế tế bào ung thư buồng trứng dòng A2780. Dịch trích nước và diclorometan từ lá tươi P. guilfoylei được ghi nhận có khả năng quyến rũ ruồi đục trái.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 trình bày chi tiết quy trình chuẩn bị mẫu, thiết bị phân tích, điều chế phân đoạn và quá trình sắc ký cô lập các hợp chất:

  • Xử lý nguyên liệu: Vỏ thân tươi được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60–65°C đến khối lượng không đổi để xác định độ ẩm trung bình trước khi xay thành bột khô.
  • Điều chế các loại cao: Bột vỏ thân khô được chiết ngâm dầm với etanol $96^\circ$ ở nhiệt độ phòng, thu hồi dung môi thu được 111,730 g cao etanol tổng. Cao tổng được phân bố lỏng - lỏng thu được 5,000 g cao n-hexan; 16,420 g cao etyl acetat và 20,100 g cao n-butanol.
Loại cao chiết Khối lượng thu được (g) Định hướng xử lý tiếp theo
Cao tổng Etanol 111,730 Phân bố lỏng - lỏng
Cao n-Hexan 5,000 Chọn sắc ký cô lập hợp chất kém phân cực
Cao Etyl acetat 16,420 Lưu trữ, chưa tiến hành sắc ký
Cao n-Butanol 20,100 Chọn sắc ký cô lập saponin phân cực
  • Quy trình cô lập hợp chất ED-1 từ cao hexan: 5,000 g cao hexan được sắc ký cột silica gel pha thuận với hệ dung môi eter dầu hỏa : clorofom (Ed:C) có độ phân cực tăng dần, thu được 4 phân đoạn (H.1 – H.4). Tiếp tục sắc ký cột lặp lại trên phân đoạn H.3 (1,080 g) thu được 3 phân đoạn phụ (H.3.1 – H.3.3). Phân đoạn H.3.2 (0,640 g) sau khi qua cột sắc ký tiếp theo tạo ra kết tủa trắng ở đáy bình chứa phân đoạn H.3.2.2. Lọc kết tủa, rửa nhiều lần bằng clorofom và tinh chế qua cột silica gel thu được 20 mg chất bột màu trắng, ký hiệu ED-1 ($R_f = 0,3$ trên bản mỏng TLC giải ly bằng clorofom 100%).
  • Quy trình cô lập hợp chất BU-1 từ cao butanol: 20,100 g cao butanol được đưa lên cột sắc ký silica gel, giải ly bằng hệ clorofom : metanol (C:M) và clorofom : metanol : nước ($C:M:H_2O$) với độ phân cực tăng dần, thu được 6 phân đoạn (B.1 – B.6). Phân đoạn B.4 (5,280 g) tiếp tục được sắc ký cột phân đoạn thành 4 phần (B.4.1 – B.4.4). Phân đoạn B.4.3 (1,080 g) sắc ký cột thu được 3 phân đoạn nhỏ, trong đó phân đoạn B.4.3.2 (67 mg) được rửa nhiều lần bằng metanol và tinh chế qua cột sắc ký giải ly bằng hệ $C:M:H_2O$ (40:10:1). Kết quả thu được 9,2 mg chất bột màu trắng, ký hiệu BU-1 ($R_f = 0,5$ trên bản mỏng TLC pha thuận với hệ giải ly $C:M:H_2O = 14:6:1$, hiện vết tròn màu tím khi sấy với $H_2SO_4$ đặc).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các lập luận phổ nghiệm chi tiết để giải mã cấu trúc của hai hợp chất tinh sạch:

  • Biện luận cấu trúc hợp chất BU-1:
    • Phổ $^1H\text{-NMR}$ (đo trong dung môi $\text{pyridin-}d_5$) cho thấy 1 proton olefin tại $\delta_H 5,38\text{ ppm}$ (1H, br s, $=\text{CH}-$), 7 mũi đơn đặc trưng của 7 nhóm $-\text{CH}_3$ liên kết trên carbon bậc bốn tại vùng trường cao ($\delta_H 0,88 - 1,68\text{ ppm}$) và tín hiệu proton H-18 tại $\delta_H 3,27\text{ ppm}$ (dd, $J = 4,0\text{ và }14,0\text{ Hz}$), khẳng định khung aglycon là acid oleanolic.
    • Sự xuất hiện của 2 tín hiệu proton anomer tại $\delta_H 4,85\text{ ppm}$ (1H, d, $J = 7,5\text{ Hz}$) và $\delta_H 5,12\text{ ppm}$ (1H, d, $J = 8,0\text{ Hz}$) chỉ ra hợp chất có 2 phân tử đường với liên kết glycosid dạng cấu hình $\beta$.
    • Phổ $^{13}C\text{-NMR}$ và DEPT hiển thị 42 tín hiệu carbon, bao gồm: 7 nhóm $-\text{CH}_3$, 10 nhóm $-\text{CH}_2-$, 3 nhóm $>\text{CH}-$, 1 nhóm $=\text{CH}-$ ($\delta_C 122,5\text{ ppm}$, C-12), 6 carbon bậc bốn $>\text{C}<$, 1 carbon olefin bậc bốn $=\text{C}<$ ($\delta_C 144,2\text{ ppm}$, C-13), 1 nhóm $-\text{CH}_2\text{OH}$, 11 nhóm $>\text{CH}-\text{O}$, 2 nhóm carbonyl $>\text{C}=\text{O}$ ($\delta_C 176,1\text{ ppm}$ của acid glucuronic và $\delta_C 180,1\text{ ppm}$ của C-28 aglycon) và 2 carbon anomer tại $\delta_C 105,9\text{ ppm}$ và $106,0\text{ ppm}$.
    • Phổ HMBC xác định tương quan giữa proton anomer $H-1'$ ($\delta_H 4,85\text{ ppm}$) với carbon C-3 ($\delta_C 89,1\text{ ppm}$) của phần aglycon, chứng minh phân tử acid glucuronic gắn vào vị trí C-3 của acid oleanolic. Tương quan HMBC giữa proton anomer $H-1''$ ($\delta_H 5,12\text{ ppm}$) với carbon $C-3'$ ($\delta_C 86,5\text{ ppm}$) của đường thứ nhất chứng minh phân tử glucose thứ hai liên kết vào vị trí $C-3'$ của phân tử acid glucuronic.
    • Phổ khối lượng LC/MS-ESI (chế độ ion âm) xuất hiện mũi ion giả tựa phân tử $[M-H]^-$ tại $m/z = 793,36$, phù hợp với công thức phân tử $C_{42}H_{66}O_{14}$ ($M = 794\text{ đvC}$).
    • Đối chiếu số liệu phổ NMR với tài liệu của Nguyễn Thị Ánh Tuyết (2010), tác giả xác định cấu trúc BU-1 là: Acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic.
  • Biện luận cấu trúc hợp chất ED-1:
    • Phổ $^1H\text{-NMR}$ (đo trong $\text{CDCl}_3$) xuất hiện mũi ba tại $\delta_H 2,34\text{ ppm}$ (2H, t, $J = 7,5\text{ Hz}$, $-\text{CH}_2-$ kề nhóm $-\text{COOH}$), mũi đa tại $\delta_H 1,60\text{ ppm}$ (2H, m, nhóm $-\text{CH}_2-$ ở vị trí $\beta$ so với nhóm carboxyl) và mũi ba ở trường cao $\delta_H 0,88\text{ ppm}$ (3H, t, $-\text{CH}_3$ cuối mạch).
    • Tác giả đề nghị ED-1 là một acid béo mạch dài có công thức chung: $\text{CH}_3-(\text{CH}_2)_n-\text{COOH}$ ($n \ge 3$).

Chương 4: Kết luận và đề xuất

Chương 4 đúc kết các kết quả cô lập thực nghiệm và định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo:

  • Kết luận: Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 01 saponin triterpenoid (BU-1, 9,2 mg) từ cao butanol và 01 dẫn xuất acid béo (ED-1, 20 mg) từ cao hexan của vỏ thân cây Đinh lăng trổ.
  • Đề xuất: Do giới hạn về thời gian và lượng mẫu thu được còn ít, tác giả đề xuất mở rộng nghiên cứu với lượng mẫu nguyên liệu lớn hơn, tiếp tục khảo sát thành phần hóa học của phần rễ cây Polyscias guilfoylei Bail. và tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học đối với các loại cao chiết và các hợp chất tinh khiết đã phân lập.

Kết quả và đóng góp

  • Kết quả thực nghiệm chính:
    • Khảo sát quá trình chiết tách từ 111,730 g cao etanol tổng của vỏ thân cây Đinh lăng trổ, tách thành 3 phân đoạn phân cực khác nhau.
    • Phân lập thành công 2 hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn chiết xuất:
Ký hiệu hợp chất Khối lượng (mg) Nguồn phân đoạn Cấu trúc hóa học xác định Công thức phân tử / Khối lượng phân tử
BU-1 9,2 Cao n-Butanol (B.4.3.2) Acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic $C_{42}H_{66}O_{14}$ ($M = 794\text{ g/mol}$)
ED-1 20,0 Cao n-Hexan (H.3.2.2) Acid béo no mạch thẳng $\text{CH}_3-(\text{CH}_2)_n-\text{COOH}$ ($n \ge 3$) Chưa xác định chính xác số lượng $n$
  • Đóng góp khoa học tự nêu:
    • Bổ sung dữ liệu khoa học về thành phần hóa học của bộ phận vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.), một bộ phận chưa từng được công bố chi tiết trước đó (các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung vào lá tươi).
    • Cung cấp bộ thông số phổ nghiệm phân tích cấu trúc chi tiết (1D-NMR, 2D-NMR, LC/MS) của hợp chất saponin khung oleanane có hai mạch đường liên kết $\beta$ phân lập từ loài này.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của đề tài:
    • Nghiên cứu chỉ mới thực hiện trên bộ phận vỏ thân cây với khối lượng nguyên liệu ban đầu còn hạn chế, dẫn đến lượng hợp chất tinh sạch thu được khá nhỏ (BU-1 đạt 9,2 mg; ED-1 đạt 20 mg).
    • Hợp chất ED-1 mới chỉ xác định được công thức khung tổng quát của acid béo qua phổ $^1H\text{-NMR}$ mà chưa xác định được chiều dài mạch carbon cụ thể ($n$).
    • Chưa thực hiện được các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, độc tế bào, chống oxy hóa) trên các cao phân đoạn và các chất đã cô lập do hạn chế về mặt thời gian.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Thu thập khối lượng mẫu lớn hơn để tách chiết thêm các hợp chất thứ cấp khác ở các phân đoạn chưa khảo sát (như cao etyl acetat và các phân đoạn phụ còn lại của cao butanol, hexan).
    • Mở rộng khảo sát thành phần hóa thực vật trên bộ phận rễ của cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.).
    • Tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các cao chiết và hợp chất tinh khiết đã cô lập.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo dành cho:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa học (Hóa hữu cơ, Hóa hợp chất thiên nhiên), Dược học và Hóa thực vật.
  • Những người nghiên cứu muốn tham khảo quy trình phân lập saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển từng bước (từ xử lý cao chiết phân bố lỏng - lỏng đến tinh chế phân đoạn nhỏ).
  • Tài liệu tra cứu phương pháp luận giải mã phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D (HMBC, HSQC, COSY) trong việc xác định vị trí liên kết giữa các gốc đường và khung aglycon oleanane.

Câu hỏi thường gặp

1. Hợp chất BU-1 được phân lập từ phân đoạn cao nào và có cấu trúc hóa học là gì?
Hợp chất BU-1 (khối lượng 9,2 mg) được phân lập từ phân đoạn B.4.3.2 của cao n-butanol vỏ thân cây Đinh lăng trổ. Cấu trúc hóa học của BU-1 được xác định là Acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic, có công thức phân tử $C_{42}H_{66}O_{14}$ với khối lượng phân tử là 794 đvC.

2. Tác giả đã sử dụng những kỹ thuật phổ nào để chứng minh vị trí liên kết đường của hợp chất BU-1?
Tác giả sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HMBC và HSQC kết hợp $^1H\text{-}^1H\text{ COSY}$. Tương quan HMBC giữa proton anomer $H-1'$ ($\delta_H 4,85\text{ ppm}$) với carbon C-3 ($\delta_C 89,1\text{ ppm}$) chứng minh gốc acid glucuronic gắn vào vị trí C-3 của aglycon acid oleanolic; tương quan giữa proton anomer $H-1''$ ($\delta_H 5,12\text{ ppm}$) với carbon $C-3'$ ($\delta_C 86,5\text{ ppm}$) chứng minh gốc glucose thứ hai gắn vào vị trí $C-3'$ của gốc đường thứ nhất.

3. Mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu được thu hái ở đâu và định danh bởi ai?
Mẫu vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) được thu hái tại tỉnh Khánh Hòa vào tháng 7 năm 2011 và được giám định tên khoa học bởi Th.S Liêu Hồ Mỹ Trang thuộc Bộ môn Hóa Thực vật – Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.

4. Khối lượng các loại cao chiết thu được từ 111,730 g cao etanol tổng là bao nhiêu?
Sau khi chiết phân bố lỏng - lỏng, tác giả thu được 5,000 g cao n-hexan, 16,420 g cao etyl acetat và 20,100 g cao n-butanol.

5. Hợp chất ED-1 cô lập từ cao hexan có những đặc điểm nhận diện nào trên phổ 1H-NMR?
Trên phổ $^1H\text{-NMR}$ đo trong $\text{CDCl}_3$, ED-1 thể hiện tín hiệu mũi ba tại $\delta_H 2,34\text{ ppm}$ ($J = 7,5\text{ Hz}$) ứng với nhóm $-\text{CH}_2-$ kế cận nhóm carboxyl, mũi đa tại $\delta_H 1,60\text{ ppm}$ của nhóm $-\text{CH}_2-$ ở vị trí $\beta$, và mũi ba tại $\delta_H 0,88\text{ ppm}$ của nhóm $-\text{CH}_3$ cuối mạch, đặc trưng cho một acid béo no $\text{CH}_3-(\text{CH}_2)_n-\text{COOH}$ ($n \ge 3$).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã hoàn thành việc khảo sát thành phần hóa học trên bộ phận vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) thu hái tại Khánh Hòa. Bằng các kỹ thuật sắc ký cột pha thuận kết hợp phân tích phổ nghiệm hiện đại ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC và LC/MS-ESI), tác giả đã cô lập và xác định cấu trúc của 01 saponin triterpenoid là Acid 3-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$3)-$\beta$-D-glucuronopyranosyloleanolic (BU-1, 9,2 mg) và 01 acid béo (ED-1, 20 mg). Công trình cung cấp bổ sung dữ liệu hóa thực vật thực nghiệm cho loài Polyscias guilfoylei và tạo tiền đề định hướng cho các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo trên bộ phận rễ và thử nghiệm hoạt tính sinh học.