ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH ĐỒNG THÁP TRƯỜNG CAO ĐẲNG NGHỀ ĐỒNG THÁP GIÁO TRÌNH MÔN HỌC: VI SINH VẬT THÚ Y NGÀNH, NGHỀ: THÚ Y TRÌNH ĐỘ: TRUNG CẤP/CAO ĐẲNG (Ban hành kèm theo Quyết định số 257/QĐ-TCĐNĐT-ĐT ngày 13 tháng 07 năm 2017 của Hiệu trưởng trường Cao đẳng Nghề Đồng Tháp) Đồng Tháp, năm 2017 LỜI GIỚI THIỆU Nhằm đáp ứng yêu cầu giảng dạy chương trình cao đẳng thú y, tôi đã tiến hành biên soạn giáo trình “Vi sinh vật học thú y”. Đây là tài liệu quan trọng giúp cho sinh viên nghiên cứu trước và sau khi học trên lớp. Giáo trình này không những phục vụ cho đào tạo nghề thú y trình độ cao đẳng mà còn dùng để biên soạn các chương trình dạy nghề trình độ trung cấp, sơ cấp hoặc tổ chức các lớp tập huấn theo từng chuyên mục. Vì thời gian có hạn, tuy đã có nhiều cố gắng nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong được các bạn góp ý để giáo trình hoàn thiện hơn.
1 CHƯƠNG TRÌNH MÔ ĐUN VI SINH VẬT HỌC THÚ Y Tên mô đun: Vi sinh vật học thú y Mã mô đun: MĐ 09 Thời gian mô đun: 60 giờ (Lý thuyết: 24 giờ ; Thực hành: 30 giờ; Kiểm tra: 6 giờ) I. Vị trí, tính chất của mô đun - Vị trí của mô đun: mô đun này là mô đun cơ sở chuyên ngành, được học xong môn giải phẫu - Tính chất của mô đun: Mô tả vi khuẩn, virus gây bệnh, thực hiện việc nuôi cấy nhuộm mẫu của vi khuẩn, nấm. - Ý nghĩa và vai trò của Mô Đun: là mô đun cơ sở cunng cấp kiế thức cơ bản về cấu trúc, hình thái, các cách chẩn đoán và phòng trị các loại vi sinh vật thường gây bệnh trên thú, đồng thời tạo cơ sở để học các môn chuyên ngành sau này. Mục tiêu của mô đun - Mô tả được các đặc tính: sinh vật học, tính gây bệnh của mầm bệnh để áp dụng trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm - Nuôi cấy, nhuộm mẫu, soi và nhận dạng được một số vi khuẩn, nấm gây bệnh cho vật nuôi - Cẩn thận trong từng thao tác, nghiêm túc trong suốt quá trình thực hiện.
Nội dung mô đun 1.Nội dung tổng quát và phân phối thời gian: Thời gian TT Tên các bài trong mô đun Tổng TH/TL/ LT K.tra số TN/BT 1 Bài 1: Các virus gây bệnh thường gặp 14 6 6 2 2 Bài 2: Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp 30 14 14 2 3 Bài 3: Các nấm gây bệnh thường gặp 16 4 10 2 Tổng cộng 60 24 30 6 2 BÀI 1 CÁC LOẠI VIRUS GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP MỤC TIÊU -Mô tả được các đặc tính sinh vật học và tính gây bệnh của một số loại virus - Thực hiện được một số phương pháp cơ bản trong chẩn đoán sự có mặt của virus gây bệnh theo đúng qui trình hướng dẫn - Cẩn thận, tỉ mỉ trong các thao tác trong từng phương pháp chẩn đoán 1. Virus gây bệnh dịch tả cho lợn (CSF – Classical Swine fever virus) 1. Đặc tính sinh vật học: Virus thuộc họ FLAVIVIRIDAE có hình cầu có áo ngoài đường kính 40-60nm, có vỏ nucleocapsid đường kính 25 - 30 nm bao bọc Bộ gene (genome): là virus ARN 1 sợi có kích thước 10,6 -10,9kb. Protein: trong cấu trúc có 3 loại glycoprotein ((gp 44/88; gp 33; gp 55~ E0; E 1; E 2 ( Envelope) và có 4 protein không cấu trúc là p125 (p 54, p80) ; p 10; p30; p133 (p58, p75) Đây là loại virus phát triển tốt/ tế bào sơ cấp, Nhân lên trong tế bào chất (tế bào pk 15; sk 6; dịch hoàn heo): không gây bệnh tích.
Chúng chỉ có một chủng nhưng độc lực thay đổi và nhiễm sang tế bào khác bằng cấu nối nguyên sinh chất hoặc phân chia tế bào. Sau đó, chúng giải phóng ra khỏi tế bào khoảng 5-6 giờ sau nhiễm. Các bước xâm nhập của virus như sau: 1. Virus bám vào màng tế bào của ký chủ 2.
Phóng thích RNA vào trong tế bào 3. Tổng hợp RNA và protein của virus mới 4. Kết hợp thành virus hòa chỉnh 5. Virus thoát khỏi tế bào 3 5 1 4 2 3 Đề kháng yếu (chất sát trùng), Virus trong dịch tế bào (600 C/ 10 phút), bền pH 5-10, khi làm thịt xông khói có thể tồn tại 168 ngày, trong phân (10tuần/ 4-170 C), thịt đông lạnh (27ngày)và tại ủy xương (73 ngày).
Chẩn đoán virus: Để chẩn đoán bệnh này người ta có thể gây bệnh thí nghiệm trên lợn choai rồi quan sát triệu chứng lâm sàng và mổ khám kiểm tra bệnh tích điển hình (phương pháp sinh học) : Bệnh dịch tả heo mọi lứa tuổi (sốt, xuất huyết da cơ quan., tiêu chảy, sảy thai (nái ), bại liệt nửa thân sau, xuất huyết từ hạch lympho, lách và niêm mạc, sung - xuất huyết toàn thân (ban tím lấm tấm dạng đầu đinh ghim) 4 1. Chẩn đoán huyết thanh học Bao gồm : phản ứng trung hòa trên thỏ, phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch, các phản ứng miễn dịch kháng thể đánh dấu như kháng thể đánh dấu huỳnh quang, Elisa (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme – khi phát hiện kháng thể), RT-PCR (phản ứng khuếch đại DNA – khi phát hiện 1 đoạn gene của virus) Ngoài ra có thể sử dụng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA): Virus dịch tả lợn tuy không gây ngưng kết cũng như không hấp phụ lên bề mặt hồng cầu nhưng nếu hồng cầu được xử lý bằng acid tannic thì acid này một mặt (có nhóm chức) gắn lên hồng cầu còn mặt khác gắn với protein khác, kể cả virus dịch tả lợn. Như vậy, tổ hợp hồng cầu gắn virus trở thành kháng nguyên virus hữu hình và tham gia vào phản ứng ngưng kết như các kháng nguyên hữu hình khác. Xử lý hồng cầu: Máu lấy từ tĩnh mạch được trộn đều với dung dịch đệm Alssever (2,5g dextrose, 8 g citrate natri, 0,55 g acid citric, 4,2 g NaCl, nước cất q.
Đầu tiên rửa hồng cầu ba lần bằng dung dịch muối sinh lý đệm phosphate (PBS) 0,15 M, pH7 và ly tâm tốc độ thấp (1.500v/ph), lần cuối cùng 5 gạn bỏ bớt nước trong ở trên rồi pha vào PBS pH 7,2 để tạo hỗn dịch hồng cầu 50%. Tiếp theo làm ổn định bề mặt hồng cầu bằng cách thêm vào hỗn dịch hồng cầu formalin 37 - 40% đã pha lượng tương đương với PBS pH 7,2. Đậy nắp ống nghiệm và lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 2 giờ có lắc nhẹ thường xuyên. Rửa lại ba lần bằng PBS (hồng cầu đã xử lý như vậy có thể giữ được 4 tháng ở 4 °C).
Tannin hóa (xử lý bằng tannin): pha huyền dịch hồng cầu 3% với một lượng tương đương dung dịch acid tannic 1:20. Sau 10 - 15 phút, hồng cầu lại được rửa 2 - 3 lần bằng PBS pH 7,2 rồi pha thành huyền dịch 50% trong PBS pH 6,4, chú ý rằng sau khi tannin hóa hồng cầu không được tiếp xúc với protein. Trộn huyền dịch 50% hồng cầu đã tannin hóa với lượng tương đương dịch virus (có thể dùng vaccine dịch tả lợn hoặc lứa cấy virus dịch tả lợn để phát hiện kháng thể, hoặc hạch, lách và nội quan khác của lợn nghi mắc bệnh nghiền với nước sinh lý nếu để phát hiện kháng nguyên), để ở 37°C trong 60 phút rồi rửa 2 - 3 lần lại bằng PBS pH 7,2 và pha trong PBS pH 7,2 có 1% huyết thanh thỏ bình thường thành dịch 1% hồng cầu ta có kháng nguyên ngưng kết hồng cầu gián tiếp. Ngoài formalin, hồng cầu còn có thể xử lý bằng glutaraldehyde hoặc acrolein.
Nếu dùng để phát hiện kháng thể trong máu động vật nhất thiết phải kiểm tra lại kháng nguyên IHI bằng huyết thanh dương tính chiết từ máu lợn tối miễn dịch. Huyết thanh đối chứng âm tính là huyết thanh lợn khỏe mạnh, huyết thanh đối chứng dương tính chiết từ máu lợn đã được tối miễn dịch kháng virus dịch tả lợn. Huyết thanh nghi ngờ lấy từ máu lợn có thể để nguyên hoặc pha 1:5. Phản ứng có thể tiến hành trên dãy ống nghiệm nhưng dùng khay nhựa vi chuẩn độ (microtiter) 96 lỗ đáy V hoặc U thuận lợi và tiết kiệm hơn nên rất được ưa dùng.
Để phát hiện kháng thể kháng virus dịch tả lợn trong máu lợn, trước hết pha huyết thanh nghi trong dung dịch muối sinh lý 0,8% NaCl (pH 7,2) theo cấp số 2 bằng cách cho sẵn vào các lỗ 1 đến 12 của một dãy một lượng không đổi 50 μl nước sinh lý rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl huyết thanh, trộn đều bằng cách hút nhả 3 - 4 lần rồi hút 50 μl sang lỗ thứ 2, trộn đều rồi lại hút 50 μl từ lỗ thứ 2 sang lỗ thứ 3, cứ thế tiếp tục đến hết lỗ thứ 11 thì hút bỏ 50 μl (vào dịch sát trùng). Thêm 50 μl nước sinh lý vào lỗ thứ 12 để làm đối chứng âm tính huyết thanh. Thêm vào tất cả các lỗ 50 μl kháng nguyên IHA 1% (luôn quấy cho đều) trừ lỗ thứ 11 làm đối chứng âm tính kháng nguyên bằng cách cho vào 50 μl huyền dịch hồng cầu formalin hóa 1%. Đậy 6 nắp kín, để ở nhiệt độ phòng 3 - 5 giờ thì đọc kết quả dựa vào kết quả ở hai lỗ âm tính, khi hồng cầu ở hai lỗ này đã đọng xuống tâm đáy lỗ khay hoàn toàn mà nếu nghiêng khay ta sẽ thấy chúng chảy (do trọng lực) thành dòng rõ rệt.
Trong phản ứng dương tính, do mối liên kết đa chiều qua cầu nối kháng thể, các hồng cầu không lắng đọng ở tâm đáy mà rải đều khắp mặt đáy lỗ. Để phát hiện kháng nguyên, ta pha dãy huyết thanh dương tính từ lợn đã tối miễn dịch từ nồng độ 1:10 đến 1:1.280 rồi cho kết hợp với kháng nguyên nghi ngờ đã hấp phụ như hồng cầu nêu ở trên. Bên cạnh phản ứng chính cần thiét lập phản ứng đối chứng huyết thanh âm tính và đối chứng hồng cầu dương tính. Kết quả phản ứng như mô tả ở trên.
Bên cạnh đó, có thể áp dụng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp. Cho bệnh phẩm vào kháng huyết thanh dịch tả lợn có hiệu giá đã biết và trộn cho tế bào vỡ và kháng nguyên tiếp xúc được với kháng thể. nếu có kháng nguyên thì hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn sẽ sụt giảm. Phòng trị Heo nái được tiêm phòng – kháng thể qua sữa đầu (36-48 giờ đầu) bảo hộ 5 tuần đầu (không ngăn virus nhân lên, thải ra ngoài).
Đồng thời kháng thể thụ động bảo hộ 80% heo (21 ngày) và 50% (42 ngày), tiến hành tiêm phòng cho heo con vào tuần thứ 6. Thời gian bán hủy kháng thể mẹ truyền là 14 ngày.