Các Phương Pháp Dự Đoán Khả Năng Ức Chế Bệnh Dựa Trên RNA

Luận văn thạc sĩ phân tích các phương pháp dự đoán khả năng ức chế bệnh dựa trên các biểu diễn khác nhau của rna và ứng dụng, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Phạm Thị Mai Hoa
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Ngọc Thăng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ thông tin
• Đề tài: Dự Đoán Khả Năng Ức Chế Bệnh Dựa Trên RNA
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về khả năng ức chế bệnh của RNA và RNAi

Khả năng ức chế bệnh của RNA đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học hiện đại. RNA can thiệp (RNAi) là một cơ chế sinh học cho phép điều chỉnh biểu hiện gen thông qua các phân tử RNA. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh. RNAi có khả năng ức chế sự biểu hiện của các gen gây bệnh, từ đó giúp kiểm soát các bệnh lý nghiêm trọng như ung thư và bệnh truyền nhiễm.

1.1. Tổng quan về RNA và vai trò của RNAi

RNA (axit ribonucleic) là một thành phần thiết yếu trong quá trình phiên mã và dịch mã thông tin di truyền. RNAi là cơ chế điều hòa biểu hiện gen, giúp ức chế sự tổng hợp protein từ mRNA. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm soát các bệnh lý.

1.2. Lịch sử nghiên cứu RNAi và những phát hiện quan trọng

Nghiên cứu RNAi bắt đầu từ những năm 1980 với các thí nghiệm trên vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên, những phát hiện quan trọng nhất về RNAi được thực hiện bởi Andrew Fire và Craig Mello vào năm 1998, mở ra một kỷ nguyên mới trong nghiên cứu gen.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu RNAi

Mặc dù RNAi mang lại nhiều hứa hẹn trong điều trị bệnh, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc ứng dụng thực tiễn. Một trong những vấn đề lớn nhất là khả năng chuyển nạp siRNA vào tế bào. Ngoài ra, hiệu quả của RNAi có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như cấu trúc của siRNA và môi trường tế bào.

2.1. Khó khăn trong việc chuyển nạp siRNA vào tế bào

Việc chuyển nạp siRNA vào tế bào là một thách thức lớn, đặc biệt là trong các loại tế bào khó chuyển nạp. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của RNAi trong việc ức chế gen.

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của RNAi

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của RNAi, bao gồm cấu trúc của siRNA, độ ổn định của mRNA và sự hiện diện của các protein điều hòa. Việc hiểu rõ các yếu tố này là cần thiết để tối ưu hóa ứng dụng RNAi.

III. Phương pháp dự đoán khả năng ức chế bệnh dựa trên RNA

Các phương pháp dự đoán khả năng ức chế bệnh dựa trên RNA đang được phát triển mạnh mẽ. Những phương pháp này sử dụng các mô hình học máy để phân tích dữ liệu RNA và dự đoán hiệu quả của siRNA trong việc ức chế gen. Việc áp dụng các phương pháp này có thể giúp tối ưu hóa thiết kế siRNA cho các liệu pháp điều trị.

3.1. Các mô hình học máy trong dự đoán RNA

Các mô hình học máy như hồi quy tuyến tính và rừng ngẫu nhiên đang được sử dụng để dự đoán khả năng ức chế bệnh của siRNA. Những mô hình này giúp phân tích các đặc tính của siRNA và đưa ra dự đoán chính xác hơn.

3.2. Đánh giá hiệu quả của các mô hình dự đoán

Đánh giá hiệu quả của các mô hình dự đoán là rất quan trọng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các phương pháp biểu diễn dữ liệu khác nhau có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của dự đoán.

IV. Ứng dụng thực tiễn của RNAi trong y học

RNAi đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực y học, từ điều trị bệnh truyền nhiễm đến ung thư. Các nghiên cứu cho thấy RNAi có thể giúp kiểm soát sự phát triển của tế bào ung thư và ngăn chặn sự lây lan của virus. Điều này mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả.

4.1. RNAi trong điều trị ung thư

RNAi có thể được sử dụng để ức chế các gen gây ung thư, từ đó làm giảm sự phát triển của khối u. Nhiều nghiên cứu đang được thực hiện để phát triển các liệu pháp RNAi cho bệnh nhân ung thư.

4.2. Ứng dụng RNAi trong điều trị bệnh truyền nhiễm

RNAi đã cho thấy hiệu quả trong việc ngăn chặn sự lây lan của virus. Các nghiên cứu đang tìm cách phát triển các liệu pháp RNAi để điều trị các bệnh truyền nhiễm như HIV và viêm gan.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu RNAi

Nghiên cứu RNAi đang mở ra nhiều cơ hội mới trong y học và sinh học phân tử. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng tiềm năng của RNAi trong việc điều trị bệnh là rất lớn. Tương lai của nghiên cứu RNAi hứa hẹn sẽ mang lại nhiều đột phá trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả.

5.1. Tóm tắt những thành tựu đạt được

Nghiên cứu RNAi đã đạt được nhiều thành tựu quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế di truyền và phát triển các liệu pháp điều trị mới. Những thành tựu này mở ra hướng đi mới cho y học.

5.2. Hướng nghiên cứu tương lai trong RNAi

Hướng nghiên cứu tương lai sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa các phương pháp RNAi và phát triển các liệu pháp điều trị mới. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của RNAi sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: Giới thiệu về khả năng ức chế bệnh của RNA. Chương này giới thiệu tổng quan về RNA, RNAi và đi sâu vào siRNA, ý nghĩa của chúng trong nghiên cứu và thực tiễn. Chương 2: Các hướng nghiên cứu khả năng ức chế bệnh của RNA. Chương này sẽ trình bày một số nghiên cứu tiếp cận theo hướng sinh học và tin sinh học.

11 Chương 3: Các cách thức biểu diễn RNA. Trình bày các cách thức biểu diễn chuỗi RNA Chương 4: Đánh giá thực nghiệm các mô hình dự đoán khả năng ức chế bệnh của siRNA theo các biểu diễn dữ liệu khác nhau. Chương này trình bày các áp dụng cụ thể một số phương pháp dự đoán như Hồi quy tuyến tính và Luật kết hợp trên các biểu diễn khác nhau của chuỗi siRNA và đánh giá kết quả Phần Kết luận sẽ tổng kết lại nội dung đã nghiên cứu, đưa ra khả năng áp dụng thực tế và hướng đi tiếp theo. Phần còn lại là các nội dung bổ sung cho luận văn và các tài liệu tham khảo đã được sử dụng cho nghiên cứu.

GIỚI THIỆU VỀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BỆNH CỦA RNA 1. Tổng quan RNA can thiệp (RNAi) 1. Tổng quan RNAi RNA (Hoặc ARN) là axit ribonucleic – một trong hai loại axit nucleic (ADN, ARN) và là cơ sở di truyền cấp độ phân tử. Ở những loài không có ADN ví dụ một số loại virut thì ARN đóng vai trò là vật chất di truyền [1].

RNA tham gia vào quá trình phiên mã và dịch mã thông tin di truyền với nhiều vai trò khác nhau được đảm nhận bởi ba loại RNA (mRNA – RNA thông tin, tRNA – RNA vận chuyển, rRNA – RNA riboxom). Ngoài ra RNA còn có các chức năng điều hòa biểu hiện gen hoặc có chức năng tham gia các quá trình phát triển, biệt hoá tế bào như RNAi (interfering RNA). RNA can thiệp (RNA interference, RNAi) là một cơ chế điều hòa biểu hiện gen được hướng dẫn (guiding) bởi RNA mà bằng cách này RNA mạch kép ức chế biểu hiện của các gen bằng các trình tự nucleotide bổ sung. Đó là trình tự đặc biệt và liên quan đến sự suy thoái của cả hai loại phân tử RNA: RNA sợi kép (dsRNA) và RNA sợi đơn thường mRNA là những sợi tương đồng trong trình tự dsRNA làm kích hoạt phản ứng trả lời [1].

Khả năng ức chế của RNAi có thể gây nên các hiệu ứng: Ức chế dịch mã đơn vị mRNA, ức chế sự phiên mã của gen ở trong nhân, phân giải mRNA. Các hiệu ứng này gây nên sự ức chế biểu hiện của gen (ức chế gen), cụ thể sự tổng hợp protein sẽ bị giảm (knockdown) hoặc ngừng hoàn toàn (knock out) dẫn đến các tính trạng được quy định bởi gen đó bị suy giảm hoặc không xuất hiện. Lịch sử nghiên cứu RNAi Hình 1: Lịch sử nghiên cứu RNAi [2] Trong lịch sử, sự can thiệp RNA được biết đến với những tên gọi khác như: RNA silencing, quelling, cosuppresion, RNA inteference - Năm 1984, Pesthea và các cộng sự đã nghiên cứu kỹ thuật Antisense-RNA trên vi khuẩn Escherichia Coli được đăng trên tạp chí PNAS số 81. Tuy nhiên ở giai đoạn này vẫn chưa hình dung được cơ chế gây ra sự ức chế gen.

- Đến những năm đầu thập niên 1990, một số kết quả nghiên cứu được công bố trên các tạp chí quốc tế (Napoli và cộng sự, Vander Krol và cộng sự đều vào năm 1990) dựa trên quan sát hiện tượng của hoa dạ yến thảo (pentunia) khi cố gắng tạo cánh hoa màu tím bằng cách chuyển gen quy định màu tím Chalcone synthase (CHS) dưới tác động của promoter 35S. Tuy nhiên cánh hoa lại bị đốm màu, có chỗ còn màu trắng, hiện tượng này được gọi là “đồng ức chế” - Năm 1992, phát hiện “quelling” ở Neurospora (Neurospora crassa - vi khuẩn mốc bánh mì màu đỏ (red bread mold)). Năm 1994, Cogoni và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm tăng màu cam của nấm Neurospora crassa, và kết quả hầu như nấm không thể hiện và hiện tượng này được gọi là “quelling”. - Năm 1995, trên tạp chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng: Phân 14 tử RNA chiều thuận (sense RNA) cũng gây ra sự ức chế gen tương đương với với phân tử RNA chiều ngược.

Điều này gây ra sự lúng túng do kết quả khác với điều các nhà khoa học mong đợi. - Đóng góp quan trọng nhất là việc phát hiện cơ chế RNAi từ việc nghiên cứu và thí nghiệm của Andrew Fire và C. Năm 1998, nhóm nghiên cứu Fire đã giải thích được điều nghịch lý này bằng những thí nghiệm trên tuyến trùng C. Mục đích của các thí nghiệm này là nhằm kiểm tra sự hỗ trợ lẫn nhau giữa các phân tử RNA theo cả hai chiều trong quá trình ức chế sự biểu hiện của gen.

Kết quả là dsRNA ức chế sự biểu hiện của gen gấp 10 lần so với việc dùng phân tử RNA đơn lẻ theo chiều thuận hay chiều nghịch khi dùng phân tử RNA đơn lẻ còn dần dần mất tác dụng ức chế gen. Như vậy nhóm nghiên cứu của giáo sư Fire đã xác định được ngyên nhân chủ yếu của hiện tượng RNA silencing chính là do phân tử dsRNA gây nên. Hiện tượng này được các nhà khoa học đặt cho một thuật ngữ là RNA interference (RNAi). Việc tiêm mRNA mã hóa protein cơ không gây ra sự thay đổi nào ở giun.

Mã di truyền của mRNA được mô tả như là một trình tự sense. Việc tiêm RNA antisense, một trình tự bổ sung với mRNA, cũng không mang lại tác động nào. Nhưng khi Fire và Mello tiêm RNA sence và antisense cùng với nhau thì họ quan sát thấy giun có những biểu hiện co giật đặc trưng. Những biểu hiện tương tự cũng được ghi nhận ở các giun bị khuyết hoàn toàn gen chức năng mã hóa protein cơ.

Hình 2: Biểu hiện của giun khi tiêm RNA liên quan đến mã hóa protein cơ [3] 15 - Năm 2000, trên tạp chí Nature cũng công bố việc phát hiện hiện tượng RNAi trên loài ruồi giấm ProSophila do nhóm nghiên cứu của Richard Cathew tiến hành. - Năm 2001, lần đầu tiên RNAi được mô tả trong các tế bào động vật có vú (Tuschl và cộng sự). - 2002, Tạo ra tái tổ hợp dicer để tạo siRNA, công nghệ RNAi trở thành công nghệ của năm. - 2003-2005, khoảng thời gian cải tiến và tìm hiểu rõ hơn về công nghệ RNAi.

- Năm 2006, giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho phát hiện cơ chế RNAi của hai nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (ĐH Stanford) và Craig C. Ý nghĩa của việc phát hiện ra RNAi - Can thiệp RNA chống lại sự nhiễm virus - Can thiệp RNA bảo đảm ổn định hệ gen - Can thiệp RNA như cơ chế kiểm soát quá trình tổng hợp protein và điều khiển sự phát triển - Can thiệp RNA như cơ chế bảo vệ nhiễm sắc tử cô đặc và tăng cường phiên mã - Can thiệp RNA cống hiến một phương pháp mới để kiềm chế gen chuyên biệt - Can thiệp RNA đã đề xuất một giải pháp hiệu quả trong điều trị bệnh di truyền trong tương lai 2. Cơ chế can thiệp RNAi 2. Các loại RNAi Trung tâm của quá trình can thiệp RNAi gồm 2 thành phần siRNA và miRNA và những RNA này có thể liên kết với các mRNA khác, tăng hoặc giảm hoạt động của chúng hoặc là ngăn không cho mRNA tổng hợp protein.

siRNA (small interfeing RNA, short interfering RNA) là các RNA ngắn có kích thước khoảng 19 đến 25 nucleotit, được hình thành từ các RNA sợi đôi, tham gia vào quá trình tổng hợp protein, siRNA có khả năng điều khiển protein họ Argomaute tới đích điều hòa. siRNA tổng hợp hóa học là dạng đơn giản nhất của RNAi. Một trong những rào cản lớn nhất để đạt được hiệu quả RNAi với siRNA là nhiều tế bào khó để chuyển nạp. Thử nghiệm RNAi thường được coi là thành 16 công khi biểu hiện của gen mục tiêu giảm đến hơn 70%, khó có thể đạt được ở nhiều loại tế bào do hiệu quả của việc truyền thấp.

Một nhược điểm nữa của việc sử dụng siRNA tổng hợp là thời gian hạn chế của các hiệu ứng sau khi truyền, điển hình là các hoạt động im lặng gen trong 24 giờ và giảm trong 48 giờ. Tổng hợp hóa học của siRNA tốn kém trong việc chuyển nạp cơ sở liên quan tới các thuốc thử nghiệm dựa trên vector DNA. miRNA (micro RNA) là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 đến 25 nucleotit, không tham gia vào quá trình tổng hợp protein. Tiền thân miRNA (Pre- miRNA) có cấu trúc dạng thân vòng (steen-loop) hay dạng kẹp tóc (hairpin).

Ngoài ra, một loại RNAi khác là shRNA có thể được đưa vào bởi DNA plasmid, mẫu tuyến tính hoặc vector virus hoặc vi khuẩn. Chính vì vậy loại RNAi này gây ra mối quan ngại về sự an toàn khi sử dụng. Cơ chế can thiệp RNA Khi các phần khác nhau của cơ chế RNAi đang được phát hiện, cơ chế RNAi đang trở nên ngày càng rõ ràng hơn. Trong vài năm gần đây, các nhà khoa học đã thu được những hiểu biết quan trọng trong việc làm sáng tỏ cơ chế RNAi.

Sự kết hợp của các kết quả thu được từ một số thí nghiệm trên cơ thể sống (vivo) và trong ống nghiệm (vitro) đã tạo thành mô hình cơ học hai bước cho RNAi/PTGS (mô hình 2 bước được mô tả trong hình bên dưới). Bước đầu tiên, được gọi là bước khởi đầu RNAi, liên quan đến việc gắn các phân tử RNA vào một sợi kép dsRNA lớn và sự phân tách của nó thành các đoạn RNA rời rạc có kích thước xấp xỉ 21 đến 25 nucleotide (siRNA). Trong bước thứ hai, mỗi siRNA kép được tách thành 2 sợi đơn siRNA, sợi passenger và sợi guider. Sợi passenger bị suy thoái còn sợi guider sẽ kết hợp vào RNA gây ra sự im lặng phức tạp (RISC).

Các siRNA này tham gia một phức hợp đa nuclease (enzyme thủy phân), làm giảm các mRNA đơn mạch tương đồng. Khi các phân tử mRNA này biến mất thì gen tương ứng bị bất hoạt, không có protein nào do gen đó mã hóa được tạo thành. Ngoài ra trong bước 1 có thể xảy ra sự khuếch đại siRNA. Vì các đột biến gen mã hóa polymeraza RNA phu ̣ thuô ̣c RNA (RNA-dependent RNA polymerase - RdRP) ảnh hưởng đến RNAi nên loại polymerase này được đề xuất là có thể sao chép siRNA như các tác nhân biểu sinh, cho phép chúng lan truyền khắp cây trồng và giữa các thế hệ trong C.