Thực trạng và di truyền của giảm bạch cầu hạt trung tính ở trẻ em

Tài liệu chuyên sâu Giảm bạch cầu hạt trung tính ở trẻ em: Thực trạng và yếu tố di truyền, phân tích đa chiều, cung cấp kiến thức nền tảng vững chắc

• Tác giả: Trần Thị Thắm
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Thị Minh Hương
• Trường học: Trường Đại Học Y Dược Hải Phòng
• Chuyên ngành: Nhi
• Đề tài: Giảm Bạch Cầu Hạt Trung Tính Ở Trẻ Em: Thực Trạng Và Yếu Tố Di Truyền
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hải Phòng

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sinh lý bạch cầu hạt trung tính
• 1.2. Vai trò của bạch cầu hạt trung tính trong hệ thống miễn dịch
• 1.3. Nguyên nhân gây giảm bạch cầu hạt trung tính
• 1.4. Phân loại giảm bạch cầu hạt trung tính
• 1.5. Giảm bạch cầu hạt trung tính di truyền
• 1.6. Tình hình nghiên cứu giảm bạch cầu hạt trung tính
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Các chỉ số và biến số nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp và kỹ thuật thu thập số liệu
• 2.5. Quản lý, xử lý và phân tích số liệu. Phương pháp khống chế sai số. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Tỷ lệ và phân loại giảm bạch cầu hạt trung tính ở trẻ em
• 3.2. Đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm thông thường và kết quả phân tích gen của 5 bệnh nhân giảm bạch cầu hạt trung tính di truyền
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về tỷ lệ và phân loại giảm bạch cầu hạt trung tính tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng và Bệnh viện Nhi Trung Ương
• 4.2. Về đặc điểm lâm sàng, các xét nghiệm thông thường và đột biến gen của các trường hợp giảm bạch cầu hạt trung tính di truyền
• DANH MỤC CÁC BÀI BÁO TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC SƠ ĐỒ

Tóm tắt

I. Giới thiệu về giảm bạch cầu hạt trung tính ở trẻ em

Giảm bạch cầu hạt trung tính (BCHTT) ở trẻ em là một tình trạng y tế nghiêm trọng, có thể dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng cao. Tình trạng này được xác định khi số lượng BCHTT trong máu ngoại vi giảm xuống dưới mức bình thường. Theo tiêu chuẩn, trẻ dưới 1 tuổi có số lượng BCHTT ≤ 1000BC/mm3 và trẻ từ 1 tuổi trở lên có số lượng BCHTT ≤ 1500BC/mm3 được coi là giảm. Việc phân loại giảm BCHTT có thể dựa trên mức độ nặng của bệnh, từ nhẹ đến rất nặng. Nguyên nhân gây giảm BCHTT có thể là do bẩm sinh hoặc mắc phải, với các yếu tố như nhiễm trùng, thuốc, và bệnh lý về máu. Đặc biệt, giảm BCHTT di truyền là một nguyên nhân hiếm gặp nhưng nghiêm trọng, thường liên quan đến các đột biến gen như ELANE và HAX1. Việc hiểu rõ về tình trạng này là cần thiết để có phương pháp điều trị hiệu quả.

1.1. Nguyên nhân và phân loại giảm bạch cầu hạt trung tính

Giảm bạch cầu hạt trung tính có thể được phân loại thành hai nhóm chính: giảm bẩm sinh và giảm mắc phải. Giảm bẩm sinh thường liên quan đến các đột biến gen, trong khi giảm mắc phải có thể do các yếu tố bên ngoài như nhiễm trùng hoặc tác dụng phụ của thuốc. Các nguyên nhân cụ thể bao gồm nhiễm trùng, hóa trị liệu, và các bệnh lý về máu. Việc phân loại này giúp xác định phương pháp điều trị phù hợp và theo dõi tình trạng sức khỏe của trẻ. Đặc biệt, trẻ em có giảm BCHTT di truyền thường có triệu chứng nhiễm trùng tái diễn, đe dọa tính mạng, do đó cần được theo dõi và điều trị kịp thời.

II. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

Đặc điểm lâm sàng của trẻ em bị giảm bạch cầu hạt trung tính rất đa dạng, từ các triệu chứng nhẹ đến nặng. Trẻ có thể gặp phải các nhiễm trùng tái diễn, nhiễm nấm, và thậm chí là nhiễm trùng máu. Các triệu chứng này thường xuất hiện sớm và có thể đe dọa tính mạng. Các xét nghiệm cận lâm sàng như xét nghiệm máu và phân tích gen là cần thiết để xác định nguyên nhân và mức độ giảm BCHTT. Việc phân tích gen giúp xác định các đột biến liên quan đến giảm BCHTT di truyền, từ đó có thể đưa ra phương pháp điều trị hiệu quả. Các nghiên cứu cho thấy rằng việc chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời có thể cải thiện đáng kể tình trạng sức khỏe của trẻ.

2.1. Các xét nghiệm và phương pháp chẩn đoán

Để chẩn đoán giảm bạch cầu hạt trung tính, các bác sĩ thường sử dụng các xét nghiệm máu để xác định số lượng BCHTT. Ngoài ra, phân tích gen cũng rất quan trọng trong việc xác định các đột biến gen có thể gây ra tình trạng này. Việc chẩn đoán chính xác giúp xác định nguyên nhân và phân loại giảm BCHTT, từ đó đưa ra phương pháp điều trị phù hợp. Các xét nghiệm này cần được thực hiện định kỳ để theo dõi tình trạng sức khỏe của trẻ và phát hiện sớm các biến chứng có thể xảy ra.

III. Phương pháp điều trị và quản lý

Phương pháp điều trị cho trẻ em bị giảm bạch cầu hạt trung tính phụ thuộc vào nguyên nhân và mức độ nặng của tình trạng. Đối với các trường hợp giảm BCHTT do di truyền, việc điều trị có thể bao gồm việc sử dụng thuốc kích thích sản xuất BCHTT hoặc điều trị triệu chứng nhiễm trùng. Ngoài ra, việc theo dõi sức khỏe định kỳ và chăm sóc y tế kịp thời là rất quan trọng để ngăn ngừa các biến chứng. Các bác sĩ cũng cần tư vấn cho gia đình về cách chăm sóc trẻ, bao gồm việc phòng ngừa nhiễm trùng và theo dõi các triệu chứng bất thường.

3.1. Tầm quan trọng của việc theo dõi và chăm sóc

Việc theo dõi và chăm sóc trẻ em bị giảm bạch cầu hạt trung tính là rất quan trọng để đảm bảo sức khỏe của trẻ. Các bậc phụ huynh cần chú ý đến các triệu chứng nhiễm trùng và đưa trẻ đến cơ sở y tế kịp thời khi có dấu hiệu bất thường. Ngoài ra, việc giáo dục gia đình về tình trạng bệnh và cách phòng ngừa nhiễm trùng cũng rất cần thiết. Sự phối hợp giữa bác sĩ và gia đình trong việc chăm sóc trẻ sẽ giúp cải thiện chất lượng cuộc sống và giảm thiểu nguy cơ biến chứng.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Giảm bạch cầu hạt trung tính (BCHTT - Neutropenia) ở trẻ em là một hội chứng huyết học - miễn dịch phức tạp, đặc trưng bởi sự suy giảm số lượng tuyệt đối của bạch cầu hạt trung tính (Absolute Neutrophil Count - ANC) trong máu ngoại vi, làm suy giảm nghiêm trọng hàng rào phòng ngự miễn dịch bẩm sinh và dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng tái diễn đe dọa tính mạng. Về mặt sinh lý bệnh học miễn dịch bẩm sinh, bạch cầu hạt trung tính đóng vai trò là "tuyến phòng thủ đầu tiên" thông qua các cơ chế thực bào (phagocytosis), phóng thích bẫy ngoại bào (Neutrophil Extracellular Traps - NETs), giải phóng các hạt độc tế bào (azurophilic granules chứa elastase, proteinase 3, myeloperoxidase) và sản sinh các gốc oxy hóa hoạt tính (Reactive Oxygen Species - ROS). Khi số lượng BCHTT sụt giảm dưới ngưỡng an toàn, trẻ đối mặt với nguy cơ cao mắc các nhiễm trùng sinh mủ sâu, viêm phổi hoại tử, loét niêm mạc miệng hoại tử và nhiễm khuẩn huyết.

Về mặt dịch tễ học và chẩn đoán lâm sàng, y văn thế giới phân định rõ ràng các tiêu chuẩn giảm BCHTT theo lứa tuổi: đối với trẻ dưới 1 tuổi, giảm BCHTT được xác định khi ANC $\le 1{,}0 \text{ G/L}$ ($1000/\text{mm}^3$); đối với trẻ từ 1 tuổi trở lên, ngưỡng chẩn đoán là ANC $\le 1{,}5 \text{ G/L}$ ($1500/\text{mm}^3$). Về độ trầm trọng, bệnh được phân tầng thành 4 mức độ: nhẹ ($1{,}0 - 1{,}5 \text{ G/L}$), vừa ($0{,}5 - 1{,}0 \text{ G/L}$), nặng ($0{,}2 - 0{,}5 \text{ G/L}$) và rất nặng ($\le 0{,}2 \text{ G/L}$). Về diễn tiến thời gian, giảm BCHTT cấp tính kéo dài dưới 3 tháng (thường thứ phát sau nhiễm virus, vi khuẩn hoặc do thuốc), trong khi thể mạn tính kéo dài trên 3 tháng, bao gồm giảm BCHTT tự miễn (Autoimmune Neutropenia - AIN) và giảm bạch cầu hạt trung tính bẩm sinh/di truyền (Severe Congenital Neutropenia - SCN, tỷ lệ mắc ước tính $1/200.000$ trẻ sơ sinh sống).

Khoảng trống nghiên cứu (Research Gap) tại Việt Nam trước công trình này là rất lớn: hầu hết các nghiên cứu nội địa trước đây (như Bùi Văn Viên, Trần Việt Hà, Trần Bảo Châu, Nghiêm Thị Minh Châu) chủ yếu khảo sát trên đối tượng người lớn mắc bệnh lý huyết học ác tính hoặc sốt giảm bạch cầu hạt sau hóa trị liệu; các khảo sát nhi khoa mới dừng lại ở quy mô mô tả lâm sàng đơn lẻ (Ngô Ngọc Đức). Hoàn toàn thiếu vắng các nghiên cứu dịch tễ học quy mô lớn đánh giá toàn diện bức tranh lâm sàng - căn nguyên ở trẻ em ngoài giai đoạn sơ sinh, và đặc biệt là chưa từng có công trình nào giải mã căn nguyên di truyền phân tử ở mức độ đột biến gen gây giảm BCHTT bẩm sinh tại Việt Nam. Điều này dẫn đến thực trạng nhiều bệnh nhi bị bỏ sót chẩn đoán, chẩn đoán muộn khi đã xuất hiện các biến chứng nhiễm trùng hoại tử không hồi phục hoặc tử vong.

Luận án của nghiên cứu sinh Trần Thị Thắm, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Lê Thị Minh Hương và PGS. Vũ Văn Quang tại Trường Đại học Y Dược Hải Phòng, phối hợp chuyên môn chặt chẽ với Giáo sư Taizo Wada (Trưởng khoa Nhi, Đại học Kanazawa, Nhật Bản), đã giải quyết triệt để khoảng trống khoa học này thông qua hai câu hỏi nghiên cứu cốt lõi:

1. Tần suất hiện mắc, đặc điểm phân loại theo mức độ, thời gian và căn nguyên của giảm BCHTT ở trẻ em ngoài giai đoạn sơ sinh tại các trung tâm nhi khoa tuyến cuối là gì?
2. Phổ đột biến gen di truyền (mutational spectrum), đặc điểm huyết học tủy xương và kiểu hình lâm sàng của các bệnh nhi giảm BCHTT di truyền tại Việt Nam có những đặc trưng phân tử nào?

Nghiên cứu đặt ra hai giả thuyết khoa học: (H1) Đa số các ca giảm BCHTT ở trẻ em nội trú là mắc phải thoáng qua do nhiễm trùng cấp tính (virus/vi khuẩn) và phục hồi khi giải quyết căn nguyên; (H2) Một phân nhóm nhỏ bệnh nhi giảm BCHTT nặng mạn tính mang các đột biến gen đơn dòng kinh điển ($ELANE$, $HAX1$,...) gây ngừng biệt hóa tủy xương ở giai đoạn tiền tủy bào, cần được xác lập phác đồ chẩn đoán phân tử và điều trị đích sớm bằng G-CSF hoặc ghép tế bào gốc tạo máu.

Khung lý thuyết của luận án tích hợp chặt chẽ giữa học thuyết tạo máu (Hematopoiesis Theory của Abul K. Abbas), cơ chế chết theo chu trình của tế bào tiền thân tủy (Apoptosis & Unfolded Protein Response) và mô hình phân loại rối loạn sinh tủy bẩm sinh của Hiệp hội Huyết học Hoa Kỳ (Laurence A. Boxer). Luận án được thực hiện trên cỡ mẫu quy mô $N = 1846$ bệnh nhi tại hai trung tâm điều trị nhi khoa hàng đầu miền Bắc (Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng: $n = 416$; Bệnh viện Nhi Trung ương: $n = 1430$), đồng thời giải trình tự gen xác định thành công các trường hợp đột biến gen bẩm sinh hiếm gặp, tạo bước đột phá nền tảng cho chuyên ngành Miễn dịch - Dị ứng và Huyết học Nhi khoa Việt Nam.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu giảm BCHTT khởi đầu từ năm 1922 khi nhà huyết học người Đức Werner Schultz mô tả 5 ca bệnh hoại thư hầu họng và mất hoàn toàn bạch cầu hạt trong máu ngoại vi dẫn đến tử vong nhanh chóng ("Agranulocytosis" hay "Hội chứng Schultz"). Năm 1950, Rolf Kostmann phát hiện dạng di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường gây giảm BCHTT bẩm sinh nặng tại Thụy Điển (Hội chứng Kostmann). Tiếp đó, Walter Hitzig (1959) ghi nhận dạng di truyền trội. Đến cuối thế kỷ XX, các công trình đột phá của David Dale, Marshall Horwitz (1999-2000) đã chứng minh đột biến gen mã hóa enzym neutrophil elastase ($ELANE/ELA2$) trên nhiễm sắc thể 19p13 là nguyên nhân chính gây giảm BCHTT bẩm sinh nặng và giảm BCHTT chu kỳ (Cyclic Neutropenia). Năm 2007, Christoph Klein và cộng sự tiếp tục phát hiện đột biến gen $HAX1$ trên nhiễm sắc thể 1q21 giải thích cơ chế di truyền lặn của hội chứng Kostmann nguyên bản.

Trong y văn quốc tế, tồn tại hai cuộc tranh luận học thuật lớn:

1. Tranh luận về nguy cơ chuyển dạng ác tính thành Hội chứng rối loạn sinh tủy / Bạch cầu cấp dòng tủy (MDS/AML) ở bệnh nhân SCN điều trị bằng yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt (G-CSF): Nghiên cứu của Vahagn Makaryan và cộng sự chỉ ra rằng có tới 16% bệnh nhân SCN mang đột biến $ELANE$ tiến triển thành MDS/AML khi điều trị G-CSF liều cao kéo dài, làm dấy lên giả thuyết liệu G-CSF trực tiếp gây đột biến hay chỉ đóng vai trò chọn lọc dòng tế bào bất thường sống sót.
2. Cơ chế bệnh sinh của các thể bệnh đơn gen so với hiện tượng đa đột biến/gen biến đổi (Modifier genes): Mặc dù SCN được định nghĩa là bệnh đơn gen, các nghiên cứu gần đây ghi nhận hiện tượng đồng đột biến (như đột biến dị hợp tử $ELANE$ kết hợp đột biến đồng hợp tử $HAX1$ hoặc $G6PC3$), tạo nên sự biến thiên kiểu hình lâm sàng rất phức tạp giữa các cá thể trong cùng một gia hệ.

Về mặt dịch tễ học quốc tế, dữ liệu từ Sổ bộ Suy giảm Miễn dịch Tiên phát Quốc gia Pháp báo cáo tỷ lệ mắc SCN là $6{,}2/10^6$ dân số (với 30% do gen $ELANE$, 30% hội chứng Shwachman-Diamond do đột biến gen $SBDS$, 5% rối loạn chuyển hóa glycogen GSD1b do gen $G6PT$, 35% do các nguyên nhân khác). Trong khi đó, dữ liệu của Sổ bộ Quốc tế (SCNIR) bao gồm Hoa Kỳ, Canada, Úc và Tây Âu ghi nhận tỷ lệ $0{,}7/10^6$ trên quần thể 700 triệu dân; khảo sát của Trung tâm Dinh dưỡng và Sức khỏe Hoa Kỳ (NHANES) chỉ ra sự khác biệt chủng tộc rõ rệt với tỷ lệ giảm BCHTT là 4,5% ở người da đen, 0,79% ở người da trắng và 0,38% ở người Mỹ gốc Mexico. Tại Iran (2006), tỷ lệ ghi nhận là $0{,}77/10^6$.

Tại Việt Nam, các công trình của Bùi Văn Viên (2003) trên bệnh nhân lơ-xê-mi cấp dòng lympho cho thấy tỷ lệ giảm BCHTT trước hóa trị là 58,2% và tăng lên 100% sau hóa trị. Trần Việt Hà và Trần Bảo Châu ghi nhận tỷ lệ nhiễm trùng ở bệnh nhân bệnh máu có giảm BCHTT dao động từ 71,8% đến 72,8%, trong đó nhóm có $\text{ANC} \le 0{,}1 \text{ G/L}$ có tỷ lệ nhiễm khuẩn lên tới 96,6%. Nghiêm Thị Minh Châu và Nguyễn Hoàng Thanh xác định sốt giảm bạch cầu hạt gặp chủ yếu ở bạch cầu cấp (95%) và suy tủy (28,7%). Tuy nhiên, toàn bộ các nghiên cứu này đều tiến hành trên người lớn và tập trung vào nhóm giảm bạch cầu mắc phải. Luận án của Trần Thị Thắm đã định vị tiên phong bằng cách thiết lập nghiên cứu dịch tễ - lâm sàng - di truyền học phân tử đầu tiên tại Việt Nam trên quần thể bệnh nhi quy mô lớn, kết nối dữ liệu lâm sàng trong nước với mạng lưới nghiên cứu di truyền nhi khoa quốc tế (Đại học Kanazawa, Nhật Bản).

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm học thuyết sinh lý bệnh học tế bào tủy (Myelopoiesis & Apoptosis Theory) trong bối cảnh phân tử của trẻ em Việt Nam:

1. Làm sáng tỏ cơ chế ức chế trưởng thành tế bào tủy (Promyelocytic Maturation Arrest): Đột biến gen $ELANE$ làm sai lệch cấu trúc không gian của enzym neutrophil elastase, gây tích tụ protein cuộn gập sai (misfolded protein) trong lưới nội chất (Endoplasmic Reticulum Stress), kích hoạt phản ứng UPR (Unfolded Protein Response) và thúc đẩy tế bào chết theo chu trình (apoptosis) ngay tại giai đoạn tiền tủy bào, làm triệt tiêu khả năng tạo thành tủy bào và BCHTT trưởng thành ở máu ngoại vi.
2. Củng cố mô hình suy thoái màng ty thể do đột biến gen $HAX1$: Thiếu hụt protein HAX1 định vị tại màng trong ty thể làm mất điện thế màng, kích hoạt dòng thác caspase và gia tăng apoptosis bất thường của các tiền thân dòng bạch cầu hạt.
3. Xác lập mô hình tương tác đa tầng Kiểu gen - Tủy đồ - Kiểu hình lâm sàng (Genotype - Bone Marrow Cytology - Clinical Phenotype Matrix): Đột biến gen quyết định hiện tượng "dừng phát triển tủy" đặc hiệu, biểu hiện ra ngoài bằng tình trạng giảm BCHTT mạn tính mức độ rất nặng ($\text{ANC} \le 0{,}2 \text{ G/L}$), đi kèm các đợt nhiễm trùng tái diễn nghiêm trọng ngay từ thời kỳ sơ sinh (nhiễm trùng rốn rụng muộn, áp xe da - mô mềm tái phát, viêm phổi hoại tử, loét áp-tơ miệng tái diễn và viêm quanh răng phá hủy xương ổ răng).

Khung phân tích độc đáo

Luận án thiết lập một khung phân tích chẩn đoán 3 cấp độ (Three-Tier Diagnostic Framework) có tính ứng dụng cao:

• Cấp độ 1 (Động học máu ngoại vi & Phân tầng nguy cơ): Đánh giá trị số tuyệt đối ANC theo lứa tuổi, phân loại 4 mức độ nặng/nhẹ và theo dõi động học thời gian (cấp tính $< 3$ tháng vs. mạn tính $> 3$ tháng; dao động chu kỳ 21 ngày vs. suy giảm liên tục).
• Cấp độ 2 (Tế bào học tủy xương & Khảo sát miễn dịch loại trừ): Sử dụng tủy đồ để đánh giá tỷ lệ các lứa tuổi dòng hạt, xác định hiện tượng ngừng trưởng thành ở giai đoạn tiền tủy bào/tủy bào; đồng thời thực hiện xét nghiệm kháng thể kháng bạch cầu (kháng nguyên HNA-1 đến HNA-5, thụ thể FcγRIIIb/CD16b) để phân biệt giảm BCHTT tự miễn (AIN) và các xét nghiệm loại trừ suy tủy, bạch cầu cấp.
• Cấp độ 3 (Giải mã di truyền phân tử định hướng): Tiếp cận phân tích đột biến gen theo cây quyết định lâm sàng: ưu tiên giải trình tự gen $ELANE$ (chiếm 50-60% các ca bẩm sinh), tiếp đến là $HAX1$ (khi có biểu hiện thần kinh/chậm phát triển), $G6PC3$ (khi kèm dị tật tiết niệu/tim mạch), $SBDS$ (khi kèm suy tụy ngoại tiết, tiêu chảy mỡ, lùn) và $TAZ$ (hội chứng Barth).

Khung phân tích này thiết lập điều kiện biên rõ ràng: áp dụng cho trẻ em từ 1 tháng đến 15 tuổi, loại trừ giảm bạch cầu hạt thoáng qua ở trẻ sơ sinh do bất đồng miễn dịch mẹ - con hoặc bệnh lý của mẹ.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ thế giới quan thực chứng (Positivism Paradigm) với thiết kế kết hợp hai giai đoạn mang tính hệ thống cao:

• Giai đoạn 1 (Dịch tễ học mô tả tiến cứu loạt ca bệnh): Khảo sát cắt ngang tiến cứu trên toàn bộ bệnh nhi nhập viện có giảm BCHTT tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng (01/01/2017 đến 31/12/2017) và Bệnh viện Nhi Trung ương (01/01/2018 đến 30/06/2018) nhằm lượng hóa tỷ lệ hiện mắc, phân loại lâm sàng, mức độ và căn nguyên mắc phải.
• Giai đoạn 2 (Nghiên cứu sàng tuyển di truyền phân tử chuyên sâu): Lựa chọn các bệnh nhi giảm BCHTT thỏa mãn tiêu chuẩn sàng lọc nghiêm ngặt để tiến hành tách chiết DNA và giải trình tự gen đột biến tại phòng xét nghiệm di truyền phân tử Khoa Nhi, Đại học Kanazawa, Nhật Bản.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân cho nhánh di truyền phân tử bao gồm:

1. Giảm nặng BCHTT ($\text{ANC} \le 0{,}5 \text{ G/L}$), kéo dài liên tục trên 3 tháng.
2. Tiền sử nhiễm trùng nặng đe dọa tính mạng (nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn) hoặc nhiễm trùng tái diễn nhiều đợt từ giai đoạn sơ sinh/nhũ nhi.
3. Loại trừ hoàn toàn các nguyên nhân mắc phải: suy tủy toàn bộ, bạch cầu cấp, hội chứng rối loạn sinh tủy, bệnh tự miễn hệ thống (Lupus ban đỏ hệ thống, hội chứng Evans), và suy dinh dưỡng nặng do thiếu hụt vi chất (Vitamin B12, Acid Folic, Đồng).

Quy trình thu thập và bảo quản mẫu sinh học tuân thủ tiêu chuẩn quốc tế: Máu ngoại vi được lấy trong điều kiện vô khuẩn, chống đông bằng EDTA, tiến hành tách chiết DNA bộ gen (Genomic DNA Extraction) và bảo quản ở $-80^\circ\text{C}$ trước khi vận chuyển theo quy chuẩn sinh học quốc tế đến Đại học Kanazawa. Quy trình chẩn đoán được hội chẩn đa quốc gia trực tiếp với Giáo sư Taizo Wada nhằm đảm bảo tính chuẩn xác và độ tin cậy tuyệt đối của kết luận di truyền. Nghiên cứu đạt chứng nhận chấp thuận đạo đức y sinh học của Hội đồng Đạo đức Trường Đại học Y Dược Hải Phòng và hai bệnh viện tham gia.

Data và phân tích

• Tổng cỡ mẫu: $N = 1846$ bệnh nhân (Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng: $n = 416$; Bệnh viện Nhi Trung ương: $n = 1430$).
• Kỹ thuật xét nghiệm: Công thức máu tự động bằng hệ thống laser flow cytometry; tủy đồ nhuộm Giemsa đánh giá hình thái tế bào học dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại $\times 400$ và $\times 1000$; kỹ thuật sinh học phân tử bao gồm phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khuếch đại các exon mục tiêu và giải trình tự gen Sanger trực tiếp (Direct Sanger Sequencing) / giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM.
• Phân tích thống kê: Quản lý và xử trị số liệu bằng phần mềm SPSS và EpiData. Phân tích biến định tính bằng tần số, tỷ lệ phần trăm; kiểm định giả thuyết bằng Chi-square ($\chi^2$) hoặc Fisher's Exact Test; các biến định lượng trình bày dưới dạng Trung bình $\pm$ Độ lệch chuẩn ($\text{Mean} \pm \text{SD}$); khoảng tin cậy 95% (95% CI) được áp dụng cho các ước lượng tỷ lệ.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Bức tranh dịch tễ học giảm BCHTT mắc phải: Đa số các trường hợp giảm BCHTT ở trẻ em nội trú là thể cấp tính mắc phải do các bệnh lý nhiễm trùng phổ biến tại Việt Nam. Virus là nhóm nguyên nhân hàng đầu (Cúm, Sốt xuất huyết Dengue, Tay chân miệng, Cytomegalovirus, Epstein-Barr virus), tiếp theo là nhiễm vi khuẩn nặng (viêm phổi thùy, viêm tai giữa sinh mủ, nhiễm khuẩn huyết do Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa), các bệnh lý huyết học ác tính (Bạch cầu cấp dòng lympho/dòng tủy) và hệ quả của hóa trị liệu ức chế tủy.
2. Đặc trưng phân bố theo tuổi và giới: Tỷ lệ giảm BCHTT tập trung cao nhất ở nhóm trẻ dưới 1 tuổi và nhóm 1-3 tuổi; không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về phân bố mức độ giảm bạch cầu giữa hai giới nam và nữ ($p > 0{,}05$), khẳng định tính đồng nhất về mặt nguy cơ phơi nhiễm mắc phải.
3. Đột phá chẩn đoán di truyền phân tử đầu tiên tại Việt Nam: Phát hiện và giải mã thành công 5 trường hợp bệnh nhi giảm BCHTT di truyền mang các đột biến gen kinh điển, bao gồm đột biến gen $ELANE$ (ở bệnh nhân giảm BCHTT bẩm sinh nặng và bệnh nhân giảm BCHTT chu kỳ) và đột biến gen $HAX1$ (thể đồng hợp tử lặn trên nhiễm sắc thể thường). Kết quả phân tích phả hệ 3 đời ghi nhận tính chất di truyền gia đình ở một số ca bệnh, đồng thời xác định các trường hợp đột biến mới (de novo mutation).
4. Đồng nhất hình thái tế bào học tủy xương: 100% các ca giảm BCHTT bẩm sinh mang đột biến gen $ELANE$ và $HAX1$ đều biểu hiện hình ảnh tủy đồ điển hình với hiện tượng ức chế tăng sinh và ngừng trưởng thành chọn lọc tại giai đoạn tiền tủy bào (Promyelocyte), số lượng tủy bào và BCHTT đoạn trung tính trưởng thành giảm sút nghiêm trọng hoặc vắng bóng hoàn toàn.
5. Kiểu hình lâm sàng nhiễm trùng nặng khởi phát sớm: 100% bệnh nhi giảm BCHTT di truyền có tiền sử nhiễm trùng xuất hiện từ giai đoạn sơ sinh hoặc những tháng đầu đời, với các cơ quan tổn thương đặc trưng: áp xe dưới da và mô mềm tái diễn nhiều lần cần can thiệp rạch tháo mủ, viêm phổi tái phát $\ge 2$ lần/tháng dẫn đến xẹp phổi, viêm da mủ hoại tử toàn thân, viêm loét miệng hoại tử nặng, viêm nha chu tụt lợi sớm, và các đợt nhiễm khuẩn huyết đe dọa tử vong.

Implications đa chiều

• Đóng góp lý thuyết: Bổ sung dữ liệu kiểu gen và kiểu hình của quần thể bệnh nhân Việt Nam vào bản đồ dịch tễ di truyền học bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh toàn cầu; chứng minh sự tương thích cao giữa biểu hiện phân tử của đột biến $ELANE$, $HAX1$ với các mô hình bệnh sinh đã được mô tả tại Âu - Mỹ và Nhật Bản.
• Đổi mới phương pháp luận: Thiết lập lưu đồ chẩn đoán phân tầng (Tiered Diagnostic Algorithm) thực hành lâm sàng cho các bệnh viện tuyến tỉnh và tuyến trung ương tại Việt Nam, giúp tối ưu hóa chỉ định xét nghiệm từ công thức máu, tủy đồ đến giải trình tự gen đích nhằm tiết kiệm chi phí y tế.
• Khuyến nghị ứng dụng lâm sàng:
  • Xác lập chỉ định điều trị sớm bằng G-CSF (liều khởi đầu $1 - 5 \ \mu\text{g/kg/ngày}$, điều chỉnh để duy trì $\text{ANC} \ge 1{,}0 \text{ G/L}$) nhằm cắt cơn nhiễm trùng, giảm tỷ lệ tử vong hàng năm từ 90% xuống dưới 1%.
  • Cảnh báo theo dõi định kỳ tủy đồ tối thiểu 1 lần/năm cho bệnh nhân dùng G-CSF liều cao kéo dài nhằm tầm soát sớm biến chứng chuyển dạng ác tính sang MDS/AML.
  • Chỉ định ghép tế bào gốc tạo máu đồng loại (Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation) kịp thời cho các trường hợp kháng G-CSF hoặc xuất hiện biến đổi dòng vô tính tủy xương.
• Định hướng chính sách y tế: Đề xuất đưa giảm BCHTT mạn tính nặng vào danh mục bệnh suy giảm miễn dịch tiên phát cần được hỗ trợ chi phí xét nghiệm di truyền phân tử và cấp phát thuốc G-CSF trong chương trình bảo hiểm y tế quốc gia.

Limitations và Future Research

Luận án thẳng thắn ghi nhận 4 giới hạn nghiên cứu cụ thể:

1. Giới hạn địa lý và kỹ thuật phân tích gen: Việc giải trình tự gen phải gửi mẫu thực hiện tại phòng lab Đại học Kanazawa (Nhật Bản) do năng lực xét nghiệm gen chuyên sâu trong nước tại thời điểm nghiên cứu còn hạn chế; cỡ mẫu di truyền ($n = 5$) phản ánh tính chất bệnh cực kỳ hiếm ($1/200.000$) nhưng cần được mở rộng liên trung tâm toàn quốc.
2. Tỷ lệ đột biến âm tính (Unidentified Genetic Variants): Vẫn tồn tại khoảng 4 - 6% trường hợp giảm BCHTT bẩm sinh không tìm thấy đột biến trên các gen kinh điển ($ELANE$, $HAX1$), đòi hỏi phải giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (Whole Exome Sequencing - WES) hoặc toàn bộ bộ gen (WGS) để phát hiện các gen mới ($JAGN1$, $CLPB$, $VPS45$).
3. Thiếu vắng bộ kít xét nghiệm kháng thể kháng bạch cầu hạt đặc hiệu (HNA-1a, 1b, 1c, 2a, 3a, 4a, 5a) trong nước, khiến việc chẩn đoán phân biệt thể giảm BCHTT tự miễn (AIN) chủ yếu dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng loại trừ và theo dõi diễn tiến tự lui bệnh.
4. Thời gian theo dõi dọc chưa đủ 10 năm để đánh giá tỷ lệ tích lũy biến chứng loãng xương, xẹp đốt sống, lách to và nguy cơ chuyển dạng bạch cầu cấp ở nhóm bệnh nhi dùng G-CSF duy trì.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối (Future Research Agenda):

• Thành lập Sổ bộ Quốc gia về Giảm bạch cầu hạt trung tính bẩm sinh và Suy giảm miễn dịch tiên phát tại Việt Nam (Vietnam National Congenital Neutropenia Registry).
• Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 và liệu pháp tế bào trên mô hình tiền lâm sàng điều trị đột biến gen $ELANE$.
• Nghiên cứu đa trung tâm đánh giá dược động học và tính an toàn dài hạn của G-CSF sinh học tương đương (Biosimilar G-CSF) trên sự phát triển thể chất và mật độ xương của trẻ em Việt Nam.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Công trình cung cấp hệ thống số liệu dịch tễ học và bằng chứng di truyền học phân tử có độ tin cậy cao, tạo tiền đề trích dẫn cho các nghiên cứu dịch tễ miễn dịch - huyết học nhi khoa trong nước và khu vực Đông Nam Á; thúc đẩy liên kết nghiên cứu quốc tế bền vững giữa các trường đại học y khoa Việt Nam và Nhật Bản.
• Tác động lâm sàng và chăm sóc sức khỏe: Giúp thay đổi căn bản thực hành lâm sàng tại các bệnh viện nhi; tỷ lệ bệnh nhân giảm BCHTT bẩm sinh được chẩn đoán xác định sớm tăng lên, giảm thiểu việc lạm dụng kháng sinh phổ rộng không hiệu quả, ngăn chặn biến chứng sốc nhiễm trùng và cắt giảm tỷ lệ tử vong do bỏ sót chẩn đoán.
• Tác động chính sách: Cung cấp bằng chứng thực tiễn xác thực giúp Bộ Y tế và Bảo hiểm Xã hội xây dựng quy chuẩn chẩn đoán, phác đồ điều trị chuẩn quốc gia và chính sách chi trả cho xét nghiệm gen di truyền phân tử và liệu pháp G-CSF ở trẻ em.
• Tác động xã hội: Nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhi và gia đình, giảm gánh nặng chi phí nằm viện hồi sức cấp cứu do các đợt nhiễm trùng huyết tái diễn, đồng thời tạo cơ sở cho việc tư vấn di truyền trước hôn nhân và chẩn đoán trước sinh cho các gia đình mang gen đột biến.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật Huyết học - Miễn dịch: Tiếp cận hệ thống cơ sở lý thuyết chuẩn hóa, phương pháp tiếp cận dịch tễ học kết hợp di truyền học phân tử chặt chẽ, mở ra các hướng nghiên cứu sinh học tế bào gốc tạo máu.
• Bác sĩ Lâm sàng Nhi khoa, Huyết học và Hồi sức cấp cứu: Sở hữu lưu đồ tiếp cận chẩn đoán phân tầng rõ ràng, tiêu chuẩn phân loại mức độ chính xác, từ đó đưa ra quyết định can thiệp sớm bằng G-CSF, kháng sinh dự phòng hoặc chỉ định ghép tủy kịp thời.
• Các nhà Hoạch định Chính sách Y tế: Cơ sở dữ liệu vững chắc để hoạch định danh mục thuốc thiết yếu, mở rộng danh mục chi trả bảo hiểm cho các bệnh hiếm và đầu tư trang thiết bị xét nghiệm di truyền phân tử tại các bệnh viện chuyên khoa tuyến tỉnh/trung ương.
• Bệnh nhi và Gia đình: Được chẩn đoán đúng căn nguyên bệnh ở mức độ phân tử, điều trị trúng đích, giảm thiểu biến chứng nhiễm trùng nặng, được quản lý theo dõi định kỳ và tư vấn di truyền cho các lần sinh tiếp theo.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Đó là việc mở rộng học thuyết ức chế trưởng thành tế bào tủy (Promyelocytic Arrest Theory) và giải mã thành công mối liên kết giữa đột biến gen đơn dòng ($ELANE$, $HAX1$) với kiểu hình ngừng biệt hóa tủy xương ở quần thể trẻ em Việt Nam, chứng minh tính đồng nhất sinh học phân tử giữa bệnh nhân bản địa và y văn quốc tế.

2. Điểm đổi mới phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây là gì? So với các nghiên cứu mô tả đơn thuần trước đây tại Việt Nam (chỉ khảo sát tế bào máu ngoại vi hoặc tủy đồ đơn lẻ trên người lớn), luận án đã tiên phong áp dụng thiết kế đa tầng tích hợp: kết hợp khảo sát dịch tễ học tiến cứu quy mô lớn ($N = 1846$) với quy trình sàng lọc lâm sàng nghiêm ngặt và công nghệ giải trình tự gen Sanger/NGS chuẩn quốc tế phối hợp với Đại học Kanazawa (Nhật Bản).

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong số liệu nghiên cứu là gì? Đó là việc phát hiện trường hợp giảm BCHTT chu kỳ mang đột biến gen $ELANE$ với chu kỳ dao động số lượng BCHTT điển hình 21 ngày nhưng biểu hiện lâm sàng ban đầu chỉ là các đợt sốt, loét miệng và viêm nha chu tái phát từng đợt, dễ bị nhầm lẫn với loét áp-tơ thông thường trong nhiều năm trước khi được giải mã di truyền.

4. Luận án có cung cấp quy trình nhân bản (Replication Protocol) không? Có. Luận án mô tả chi tiết quy trình thu thập mẫu máu, tiêu chuẩn sàng lọc 3 bước, quy trình tách chiết DNA, thiết kế mồi PCR cho các exon của gen $ELANE$, $HAX1$, và sơ đồ cây quyết định chẩn đoán lâm sàng cho phép các trung tâm huyết học - di truyền khác có thể tái lập hoàn toàn quy trình này.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được vạch ra như thế nào? Chương trình bao gồm: (1) Mở rộng giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (WES) để tìm kiếm các biến dị gen mới ở nhóm 4-6% âm tính; (2) Thiết lập mạng lưới Sổ bộ SCN Quốc gia theo dõi dọc nguy cơ chuyển dạng MDS/AML và biến chứng xương; (3) Triển khai kỹ thuật ghép tế bào gốc tạo máu chuẩn hóa cho bệnh nhân SCN kháng G-CSF tại Việt Nam.

Kết luận

1. Khảo sát toàn diện trên $N = 1846$ bệnh nhi tại hai trung tâm nhi khoa lớn (Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng và Bệnh viện Nhi Trung ương), xác lập bức tranh dịch tễ học chuẩn xác về tần suất, phân loại lứa tuổi và mức độ nặng của giảm BCHTT ở trẻ em ngoài giai đoạn sơ sinh tại miền Bắc Việt Nam.
2. Chứng minh đại đa số các trường hợp giảm BCHTT ở trẻ em nội trú là mắc phải cấp tính do nhiễm virus (Cúm, Sốt xuất huyết, Tay chân miệng), nhiễm khuẩn nặng và hóa trị liệu, mang tính chất thoáng qua và hồi phục khi điều trị căn nguyên.
3. Đột phá xác định và giải mã thành công đột biến gen $ELANE$ và $HAX1$ ở các bệnh nhi giảm BCHTT bẩm sinh nặng và giảm BCHTT chu kỳ tại Việt Nam, đặt dấu mốc lịch sử cho việc ứng dụng di truyền phân tử trong chẩn đoán suy giảm miễn dịch dòng tủy bẩm sinh trong nước.
4. Xác lập mối tương quan chặt chẽ giữa đột biến gen phân tử, hình ảnh ngừng biệt hóa tiền tủy bào trên tủy đồ và kiểu hình nhiễm trùng nặng khởi phát sớm (áp xe mô mềm tái diễn, viêm phổi hoại tử, loét miệng, viêm nha chu).
5. Xây dựng và chuẩn hóa lưu đồ chẩn đoán phân tầng 3 cấp độ (Lâm sàng - Tủy đồ - Giải trình tự gen) và phác đồ điều trị bằng G-CSF có hiệu quả cao, giảm thiểu biến chứng tử vong và nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh.
6. Mở ra 3 hướng nghiên cứu nền tảng mới cho y học Việt Nam: Dịch tễ học phân tử suy giảm miễn dịch tiên phát, Ứng dụng công nghệ NGS trong chẩn đoán bệnh hiếm, và Hoàn thiện quy trình ghép tế bào gốc tạo máu điều trị triệt căn các rối loạn sinh tủy di truyền.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN 1. Sinh lý bạch cầu hạt trung tính 1. Sự tạo thành bạch cầu hạt trung tính Tế bào gốc toàn năng (multipotential stem cell) có khả năng sinh ra tế bào gốc của mọi loại huyết bào khác [4]. Các tế bào này sinh ra hai tế bào gốc dưới nó gọi là các đơn vị tạo dòng (colony - forming unit: CFU).

CFU gồm hai loại tế bào gốc, mỗi loại là tiền bối của một số dòng huyết bào đơn năng: CFU-GEMM: là tế bào gốc để sinh ra gốc của các dòng bạch cầu hạt (G), hồng cầu (E); tiểu cầu (Meg) và mono bào (M). CFU-L: là tế bào gốc của các dòng lympho bào (B, T, NK). Khi biệt hóa đến tiền tủy bào, tủy bào, các hạt ở bào tương bắt đầu xuất hiện. Do đó, gọi là dòng bạch cầu hạt.

Các hạt này có vai trò quan trọng trong hoạt động chức năng của mỗi loại bạch cầu. Trong đó, từ tiền tủy bào trung tính sẽ biệt hóa thành tủy bào trung tính và tạo thành tế bào BCHTT ở máu ngoại vi có chức năng hoàn chỉnh.1: Sự tạo thành bạch cầu trung tính * Nguồn: Theo Abul K. Abbas và CS [10] 1. Cấu tạo bạch cầu hạt trung tính Để trở thành các tế bào miễn dịch bẩm sinh có hiệu lực chống lại vi khuẩn gây bệnh, BCHTT chứa đầy các hạt được làm giàu có khả năng gây độc tế bào với nhiều phân tử kháng khuẩn có sức mạnh khác nhau.

Chúng bao gồm 3 luan an 4 4 loại hạt nằm trong bào tương: hạt sơ cấp (azurophilic), hạt thứ cấp (specific), hạt thứ 3 (gelatinase) và túi tiết (seretory vesicles) (Hình 2). Các hạt này hoạt động theo nhiều cách khác nhau và đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể [63], [141].2: Các hạt của bạch cầu trung tính * Nguồn: Theo Roger D. Elastase là một protein serin quan trọng giúp kiểm soát sự xâm nhập của vi khuẩn và nấm gây bệnh. Elastase được dự trữ trong các hạt sơ cấp và được giải phóng vào vùng thực bào khi vi khuẩn xâm nhập.

Proteinase 3 lại tiêu diệt vi khuẩn và nấm thông qua quá trình sinh tổng hợp protein cũng như sự chuyển hoá oxy. Ngoài khả năng kháng khuẩn trực tiếp, các protein serin còn có thể liên kết với các thụ thể trên bề mặt tế bào, giúp điều chỉnh hoạt tính của các cytokine và chymokine. BCHTT có khả năng tiêu diệt các tác nhân gây bệnh bao gồm vi khuẩn và nấm là nhờ các receptor (thụ thể) trên bề mặt của nó. Trên bề mặt của các BCHTT có rất nhiều các receptor với các vai trò khác nhau: Một số thụ thể có thể nhận biết về cấu trúc của vi sinh vật, một số khác có khả năng kích hoạt phản ứng miễn dịch thích ứng.

Ngoài ra, còn có những thụ thể có khả năng 4 luan an 5 nhận ra môi trường viêm [94]. Có thể kể đến một số thụ thể như sau: G protein coupled receptor (GPCR); Fc-Receptor, Neutrophil adhesion receptors (thụ thể bám dính), thụ thể cytokine, Innate immune receptors (thụ thể miễn dịch bẩm sinh). Vai trò của bạch cầu hạt trung tính trong hệ thống miễn dịch 1. Vai trò của bạch cầu hạt trung tính trong quá trình viêm và nhiễm trùng 1.

Bạch cầu hạt trung tính trong các bệnh nhiễm trùng Các bạch cầu hạt trung tính và bạch cầu hạt lympho là những tế bào miễn dịch bẩm sinh cần thiết đóng vai trò chủ đạo trong việc chống lại vi khuẩn và nấm. Do đó, trong một số bệnh, việc thiếu hụt BCHTT gây nên các tình trạng nhiễm vi khuẩn và nhiễm nấm tái diễn [78]. BCHTT có khả năng bảo vệ cơ thể trước sự xâm nhập của cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương như: S.coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Mycobacter, Chlamydia, các loại virus: Influenza, Dengue, Respiratory syncytial virus, các loại nấm: Candida Albicans, Aspergillus fumigatus và cả các loại ký sinh trùng: Plasmodium falciparum, Toxoplasma [54], [165]. Quá trình thực bào: Khi vi sinh vật xâm nhập vào cơ thể, BCHTT được huy động đến vị trí nhiễm trùng, kích hoạt cũng như thực hiện các hoạt động khác nhau để tiêu diệt các tác nhân này.

Một trong các hoạt động đó là BCHTT sẽ gắn vào vi sinh vật gây bệnh sau đó sẽ tiêu hoá nó. Nhờ các receptor có trên bề mặt, BCHTT trực tiếp nhận ra vi khuẩn thông qua bề mặt của chúng hoặc qua các hạt chất tiết tự do được các vi khuẩn sản xuất ra như peptidoglycan, lipoprotein, lipoteichoic acid, lipopolysaccharide.Quá trình nhận dạng, gắn kết với vi khuẩn của BCHTT được tăng cường bởi các bổ thể và kháng thể có trong huyết thanh cũng như các chất tham gia vào quá trình opsonin hoá vi sinh vật. Nhờ đó, phức hợp bổ thể - vi sinh vật tiến đến BCHTT [31], [94], [142]. Vi sinh vật gây bệnh được đưa vào trong vùng thực bào 5 luan an 6 (phagosome) của BCHTT.

Tại đây, các hạt azurophilic, các hạt đặc biệt, các chất oxy phản ứng (Reactive oxygen species - ROS) được giải phóng vào vùng thực bào để tiêu diệt vi sinh vật. Quá trình này được tóm tắt bằng hình vẽ sau: Hình 1.3: Quá trình bạch cầu hạt trung tính tiêu diệt vi sinh vật Chú thích: MPO - myeloperoxidase, HOCl - axit hypochlorous, e - electron * Nguồn: Theo Sctott D. Vai trò của bạch cầu hạt trung tính trong quá trình viêm Trong quá trình viêm, BCHTT có khả năng khoanh vùng sự nhiễm trùng. Đây là một điểm quan trọng trong quá trình viêm cấp tính.

Khi có tổn thương viêm, BCHTT di chuyển qua mô để đến tổ chức viêm [148]. Sự di chuyển của BCHTT bị ảnh hưởng bởi các chất hoá học được tạo ra bởi chính các vật chủ trong quá trình viêm hoặc bởi các tác nhân gây bệnh. Một trong các chất trung gian hoá học quan trọng nhất đối với BCHTT là interleukin 8 (IL8) [81]. Ngoài ra, các BCHTT cũng được huy động tới các tổ chức viêm nhờ hoạt động của các leukotrienes và prostaglandin ngoại sinh được sinh ra từ các vị trí nhiễm trùng.

Nhiều sản phẩm khác của vi khuẩn như fMLP, peptidoglycan, các phenol hòa tan là các chất hóa học đóng góp trực tiếp vào việc huy động bạch cầu hạt trung tính [142]. 6 luan an 7 Các BCHTT có hơn 30 thụ thể khác nhau bao gồm: thụ thể G protein, thụ thể Fc, thụ thể bám dính, thụ thể cytokine, thụ thể nhận dạng mẫu. Các thụ thể này nhận ra được các trung gian tiền viêm từ đó đóng góp vào quá trình di chuyển của BCHTT tới các mô viêm [148]. Không chỉ có vai trò quan trọng trong viêm cấp tính, nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh BCHTT có vai trò to lớn trong các bệnh viêm mạn tính như viêm nha chu, hen phế quản, COPD (obtructive pulmonary disease) [62], [79], [134], [147], [159].

Những nghiên cứu khác cũng chứng minh vai trò của bạch cầu hạt trung tính trong các bệnh viêm tự miễn như viêm khớp tự miễn hay đái tháo đường tuyp 1 và bệnh Gout [83], [93], [124]. Bẫy ngoại bào bạch cầu hạt trung tính Bẫy ngoại bào trung tính (Neutrophil extracellular trap - NET) được tạo ra là kết quả của sự giải phóng vào ngoại bào các thành phần trong nhân BCHTT và có liên quan đến nồng độ glucose trong máu. NETs bao gồm các chất nhiễm sắc và các hạt (serine protease) cũng như các protein bào tương [140], [164]. Cho đến hiện nay, có 2 hình thức của NETs được giải phóng vào khoảng không ngoại bào từ các BCHTT đã được mô tả: Thứ nhất, sự giải phóng của NETs từ các BCHTT chết.

Do đó, liên quan đến cơ chế gây chết tế bào. Thứ hai, sự giải phóng của các chất chromatin và các serin protease từ các bạch cầu hạt trung tính còn nguyên vẹn. Cơ chế đầu tiên của sự hình thành NETs từ bạch cầu hạt trung tính xảy ra trong vòng 2 - 3 giờ sau khi tiếp xúc với PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate), IL-8, lipopoly saccharide (LPS) và các sản phẩm của vi khuẩn khác [21], [95], [113]. Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế hình thành NET cũng chưa được giải thích đầy đủ.

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng BCHTT khi có sự kích hoạt của các lipopolysaccharid, vi khuẩn và nấm sẽ trải qua một quá trình gọi là NETosis. Sau đó trải qua một loạt các chu trình khác để tạo ra NET [93]. 7 luan an 8 Cơ chế hình thành NET được tóm tắt trong sơ đồ dưới đây: Hình 1.4: Sự hình thành NET từ bạch cầu hạt trung tính * Nguồn: Theo Kely Campos Navegantes và CS [93] NET có thể dễ dàng làm giảm độc lực của vi khuẩn và tiêu diệt vi khuẩn bởi vì nó có chứa nhiều serine protease [63]. NET đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn, tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật kể cả Gram âm và Gram dương bao gồm: S.aureus, Shigella Flexeneri, S.

pyogens, Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, nấm Candida albicans và kí sinh trùng như Leishmania amazonensis [24], [95]. Ngoài ra, NET còn có thể tham gia vào các cơ chế miễn dịch trong một số bệnh lý miễn dịch như: viêm khớp tự miễn, đái tháo đường tuyp 1, bệnh về tiểu cầu hay một số bệnh liên quan đến tim mạch [83], [128], [141]. Ngoài chức năng chống lại vi khuẩn, NET cũng có thể gây hại cho vật chủ nếu sự tạo thành NET không được kiểm soát tốt. Sự hình thành NET quá nhiều liên quan đến các bệnh lý trung gian khác nhau như viêm mạch, Lupus ban đỏ hệ thống có tổn thương thận.

NET cũng gây kích thích tiểu cầu dẫn đến các huyết khối [64], [141], [157]. Bạch cầu hạt trung tính là chất cảm ứng của miễn dịch thích ứng 1. Điều hoà chức năng của tế bào T và tế bào B - Đối với các tế bào lympho T: + BCHTT có khả năng mang kháng nguyên tới các tế bào lympho T: Trong nghiên cứu của tác giả Peter C. Grayson và CS về bệnh viêm khớp dạng thấp đã thấy rằng: BCHTT cũng có thể mang kháng nguyên đến các hạch bạch huyết bằng cách di chuyển qua các tế bào bạch huyết, nơi chúng trực tiếp trình diện kháng nguyên với các tế bào lympho T hoặc phân phối nó tới các tế bào tua gai [124].

Ngoài ra, chúng cũng có thể mang các kháng nguyên virus từ da trực tiếp đến tủy xương để thúc đẩy sự hình thành tế bào lympho T nhớ [45]. + BCHTT cũng có thể có tác dụng ức chế miễn dịch: Chúng có thể ức chế sự gia tăng của các tế bào lympho T sản xuất IFN-γ thông qua một cơ chế phụ thuộc NO. Việc giải phóng arginase bằng các BCHTT đã được hoạt hoá hoặc các BCHTT đã chết sẽ làm suy yếu L-arginine ngoại bào. Do đó ức chế sự tăng sinh tế bào lympho T.