Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu trên thế giới có xu hướng phát triển mạnh mẽ do nhu cầu tiêu thụ các nguồn protein thay thế và thực phẩm có lợi cho sức khỏe gia tăng. Theo thống kê được trích dẫn trong công trình, thị trường nấm toàn cầu năm 2019 đạt khoảng 53,7 tỷ USD và dự báo đạt hơn 86,6 tỷ USD vào năm 2025; sản lượng nấm thế giới đạt xấp xỉ 25 triệu tấn/năm với tốc độ tăng trưởng bình quân 7% - 10%/năm. Tại Việt Nam, nghề trồng nấm có nhiều điều kiện thuận lợi về nguồn phụ phẩm nông nghiệp dồi dào (với hàng chục triệu tấn rơm rạ, mùn cưa, bã mía mỗi năm), lực lượng lao động nông thôn và điều kiện khí hậu thích hợp. Tuy nhiên, cơ cấu chủng loại nấm nuôi trồng thương mại trong nước hiện nay còn hạn chế, chủ yếu tập trung vào khoảng 16 loài phổ biến như nấm rơm, nấm mộc nhĩ, nấm sò, nấm hương, nấm linh chi.

Nấm tùng nhung (Macrocybe crassa, đồng danh Tricholoma crassum) là loài nấm ăn có kích thước quả thể lớn, thịt dày, vị ngọt béo, không độc, giàu dinh dưỡng và chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học quý. Chủng nấm này đã từng được ghi nhận trong tự nhiên tại Vĩnh Phúc (1996), TP. Hồ Chí Minh (2000-2004), Vườn Quốc gia Cát Tiên (2007, 2010), Đà Lạt, và gần đây nhất được thu thập tại khuôn viên Học viện Nông nghiệp Việt Nam (2022). Do có nguồn gốc bản địa, nấm tùng nhung có khả năng thích ứng cao với điều kiện khí hậu nhiệt đới tại Việt Nam. Dù vậy, các nghiên cứu chuyên sâu về quy trình công nghệ nhân giống và sản xuất nấm tùng nhung trong nước vẫn chưa được tiến hành đầy đủ, nấm tự nhiên hiếm gặp và chưa được đưa vào sản xuất đại trà.

Xuất phát từ thực tế đó, đề tài "Bước đầu đánh giá sinh trưởng, phát triển của chủng nấm tùng nhung (Macrocybe crassa) trên các nguồn dinh dưỡng và môi trường nhân giống khác nhau" được thực hiện nhằm xác định các yếu tố dinh dưỡng phù hợp cho sự sinh trưởng của hệ sợi nấm ở giai đoạn nhân giống.

Mục tiêu chung của nghiên cứu:

  • Khảo sát và đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng nấm tùng nhung (Macrocybe crassa) trên các môi trường nhân giống khác nhau.

Các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được xác định:

  1. Xác định nguồn cung cấp cacbon và hàm lượng cacbon thích hợp cho sinh trưởng, phát triển của chủng nấm tùng nhung (Macrocybe crassa) trong môi trường nhân giống nấm cấp 1.
  2. Xác định nguồn cung cấp nitơ và hàm lượng nitơ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển của chủng nấm tùng nhung (Macrocybe crassa) trong môi trường nhân giống nấm cấp 1.
  3. Xác định nguồn cung cấp khoáng và hàm lượng khoáng thích hợp cho sinh trưởng, phát triển của chủng nấm tùng nhung (Macrocybe crassa) trong môi trường nhân giống nấm cấp 1.
  4. Đánh giá sự sinh trưởng hệ sợi của chủng nấm tùng nhung trên một số môi trường nhân giống cấp 2 có bổ sung dinh dưỡng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm tùng nhung (Macrocybe crassa) được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Phát triển nấm ăn, nấm dược liệu - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
  • Phạm vi không gian: Viện Nghiên cứu và Phát triển nấm ăn, nấm dược liệu - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2021 đến tháng 05/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và phân loại học

Theo phân loại sinh học (Chang và Hayes, 1978; Pegler & cộng sự, 1998), nấm tùng nhung có vị trí phân loại như sau:

  • Giới (Kingdom): Fungi
  • Ngành (Division): Basidiomycota
  • Lớp (Class): Agaricomycetes
  • Bộ (Order): Agaricales
  • Họ (Family): Tricholomataceae
  • Chi (Genus): Macrocybe
  • Loài (Species): Macrocybe crassa

Về giá trị dinh dưỡng, công bố của Inyod & cộng sự (2016) trên 5 dòng nấm Macrocybe crassa nuôi trồng tại Thái Lan (DOA, DOA-1, DOA-4, DOA-7, DOA-10) ghi nhận thành phần tính theo trọng lượng khô gồm: protein thô dao động từ 11,85% đến 26,10%; cacbohydrat từ 53,79% đến 68,08%; chất béo thô từ 1,30% đến 2,49%; hàm lượng $\beta$-glucan cao từ 40,86% đến 46,56%. Ngoài ra, nấm chứa hàm lượng khoáng đa lượng và vi lượng dồi dào, tiêu biểu như kali (35.300 - 43.100 mg/kg), photpho (5.300 - 7.000 mg/kg), natri (828,97 - 1.152,24 mg/kg), canxi, magie, sắt, kẽm và mangan. Về dược tính, Khatua & cộng sự (2014) chỉ ra rằng M. crassa chứa các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao (phenol, flavonoid, axit ascorbic, $\beta$-carotene, lycopene) và có khả năng ức chế vi khuẩn Gram dương (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) cũng như vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng phương pháp thực nghiệm vi sinh vật học trong điều kiện phòng thí nghiệm vô trùng:

  • Phương pháp đánh giá đặc điểm hệ sợi: Dựa theo quy trình mô tả của Nguyễn Thị Bích Thùy (2014) và phương pháp quan sát, cho điểm mật độ hệ sợi theo Kadiri & cộng sự (1998) với 5 mức độ (+: rất thưa; ++: thưa; +++: trung bình; ++++: dày; +++++: rất dày).
  • Phương pháp bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm trên môi trường cấp 1 (đĩa petri) và cấp 2 (ống nghiệm) đều được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
  • Chỉ tiêu theo dõi và công thức tính toán:
    • Tốc độ mọc của hệ sợi ($V$, đơn vị mm/ngày): $V = \frac{X}{T}$ (với $X$ là đường kính hệ sợi, $T$ là thời gian mọc).
    • Độ dài hệ sợi ($d$, đơn vị mm): $d = \frac{d_1 + d_2}{2}$ (trung bình cộng hai trục vuông góc).
    • Thời gian hệ sợi sinh trưởng kín bề mặt thạch đĩa petri hoặc kín ống nhân giống (ngày).
    • Đặc điểm hình thái hệ sợi (màu sắc, cấu trúc mọc phẳng hay bông xù).
  • Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Microsoft Excel và IRRISTAT 5, đánh giá sự sai khác giữa các nghiệm thức qua phép thử LSD ở mức ý nghĩa 5% ($LSD_{0,05}$) và hệ số biến động ($CV%$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Mục đích, yêu cầu của đề tài

Chương này nêu rõ tính cấp thiết của việc nghiên cứu một loài nấm bản địa có giá trị thực phẩm và dược liệu cao nhưng chưa có quy trình nhân giống chuẩn tại Việt Nam. Tác giả xác định mục tiêu tổng thể là đánh giá sự sinh trưởng của nấm tùng nhung trên môi trường cấp 1 và cấp 2, từ đó đặt ra 4 yêu cầu cụ thể tương ứng với việc khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbon, nitơ, khoáng và môi trường cơ chất nhân giống cấp 2.

Chương II: Tổng quan tài liệu

Nội dung chương tổng hợp tình hình sản xuất nấm trên phạm vi quốc tế và trong nước; tổng thuật vị trí phân loại, phân bố sinh thái học của Macrocybe crassa; tổng quan các nghiên cứu quốc tế về thành phần dinh dưỡng, khoáng chất, hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn của nấm. Chương II cũng trình bày hệ thống lý thuyết về các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hệ sợi nấm (nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N, chất khoáng, nguyên tố vi lượng, vitamin, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, độ pH, độ thông khí) và đặc tính hóa sinh của các nguồn cơ chất nông nghiệp phổ biến như mùn cưa gỗ mềm (71,2% cellulose và lignin), cám ngô, cám gạo, cám mạch và bông phế thải.

Chương III: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương III trình bày chi tiết về chủng giống nấm, hóa chất dinh dưỡng (8 nguồn đường, 5 nguồn nitơ, 6 nguồn khoáng), trang thiết bị thí nghiệm (tủ cấy, nồi hấp vô trùng, phòng nuôi điều hòa hai chiều). Chương này mô tả thiết kế cụ thể của 7 thí nghiệm thực nghiệm:

  • Thí nghiệm 1: 9 công thức môi trường khảo sát nguồn cacbon (Dextrin, Fructose, Glucose, Lactose, Maltose, Saccharose, Tinh bột tan, Xylose với liều lượng 10 g/L trên nền môi trường PA gồm 200g dịch chiết khoai tây + 16g agar) so với đối chứng không bổ sung đường.
  • Thí nghiệm 2: 5 công thức hàm lượng Glucose (10, 15, 20, 25, 30 g/L).
  • Thí nghiệm 3: Khảo sát nguồn nitơ (Peptone, Cao nấm men, $\text{NH}_4\text{NO}_3$, $\text{NH}_4\text{Cl}$, $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$ liều lượng 3 g/L) trên nền PGA.
  • Thí nghiệm 4: Khảo sát hàm lượng cao nấm men (1, 2, 3, 4, 5 g/L).
  • Thí nghiệm 5: Khảo sát nguồn khoáng ($\text{MgSO}_4$, $\text{KNO}_3$, $\text{NaNO}_3$, $\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{K}_2\text{HPO}_4$, $\text{FeSO}_4$ liều lượng 2 g/L).
  • Thí nghiệm 6: Khảo sát hàm lượng $\text{K}_2\text{HPO}_4$ (1, 2, 3, 4, 5 g/L).
  • Thí nghiệm 7: Khảo sát môi trường nhân giống cấp 2 phối trộn hạt thóc tẻ luộc với mùn cưa và 1% $\text{CaCO}_3$ theo 5 tỷ lệ cơ chất (99% thóc; 89% thóc + 10% mùn; 79% thóc + 20% mùn; 69% thóc + 30% mùn; 59% thóc + 40% mùn).

Chương IV: Kết quả và thảo luận

Chương IV phân tích số liệu thực nghiệm thu được từ các thí nghiệm:

  • Đánh giá nguồn cacbon: Nguồn cacbon ảnh hưởng rõ rệt đến đặc điểm và tốc độ lan của hệ sợi. Fructose cho tốc độ dài cao nhất (5,08 mm/ngày) nhưng mật độ hệ sợi mỏng, thưa (++). Trong khi đó, Glucose mang lại chất lượng hệ sợi vượt trội nhất: sợi nấm màu trắng, phân nhánh đều, bông xù, mật độ dày (++++), tốc độ mọc 4,40 mm/ngày và thời gian ăn kín đĩa thạch đạt 18,33 ngày. Môi trường đối chứng và môi trường bổ sung Lactose không ghi nhận được thời gian kín đĩa do hệ sợi dừng phát triển hoặc bị già hóa sớm sau 18-20 ngày.
  • Đánh giá hàm lượng Glucose: Khi khảo sát từ 10g đến 30g Glucose/L, môi trường bổ sung 15g Glucose/L cho kết quả sinh trưởng tốt nhất với tốc độ mọc hệ sợi đạt 2,74 mm/ngày, thời gian ăn kín đĩa là 26,83 ngày, hệ sợi dày và mọc đồng đều (++++). Nồng độ Glucose cao hơn (25 - 30 g/L) làm giảm tốc độ mọc sợi (còn 2,37 và 2,22 mm/ngày) do nồng độ đường cao làm mất cân bằng tỷ lệ C/N trong môi trường thạch.
  • Đánh giá nguồn và hàm lượng Nitơ: Môi trường PGA bổ sung 4g Cao nấm men/L nước cất đạt hiệu quả tối ưu cho hệ sợi nấm tùng nhung, với tốc độ mọc đạt 4,23 mm/ngày và thời gian mọc kín đĩa thạch rút ngắn xuống còn 16,17 ngày.
  • Đánh giá nguồn và hàm lượng Khoáng: Môi trường PGA bổ sung 1g $\text{K}_2\text{HPO}_4$/L nước cất mang lại tốc độ mọc hệ sợi đạt 3,93 mm/ngày, thời gian ăn kín đĩa đạt 18,33 ngày.
  • Đánh giá môi trường nhân giống cấp 2: Hệ sợi nấm tùng nhung phát triển thuận lợi trên môi trường hạt thóc kết hợp mùn cưa ở các tỷ lệ thấp: MT1 (99% thóc + 1% bột nhẹ: tốc độ 1,98 mm/ngày, kín ống sau 62,67 ngày); MT2 (89% thóc + 10% mùn + 1% bột nhẹ: tốc độ 2,10 mm/ngày, kín ống sau 62,00 ngày); MT3 (79% thóc + 20% mùn + 1% bột nhẹ: tốc độ 2,05 mm/ngày, kín ống sau 62,33 ngày).

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm tổng hợp

Thí nghiệm / Chỉ tiêu Môi trường / Nghiệm thức tối ưu Tốc độ mọc sợi ($V$) Thời gian mọc kín Mật độ / Đặc điểm hệ sợi
Nguồn cacbon (cấp 1) Môi trường PA + 10g Glucose 4,40 mm/ngày 18,33 ngày ++++, sợi trắng, bông xù, đồng đều
Hàm lượng Glucose (cấp 1) Môi trường PA + 15g Glucose 2,74 mm/ngày 26,83 ngày ++++, hệ sợi trắng, mảnh, mọc dày
Nguồn & lượng Nitơ (cấp 1) Môi trường PGA + 4g Cao nấm men 4,23 mm/ngày 16,17 ngày Hệ sợi sinh trưởng khỏe, dày
Nguồn & lượng Khoáng (cấp 1) Môi trường PGA + 1g $\text{K}_2\text{HPO}_4$ 3,93 mm/ngày 18,33 ngày Hệ sợi sinh trưởng ổn định, đồng đều
Môi trường cấp 2 (MT1) 99% Thóc + 1% Bột nhẹ 1,98 mm/ngày 62,67 ngày Sợi ăn kín ống nghiệm
Môi trường cấp 2 (MT2) 89% Thóc + 10% Mùn cưa + 1% Bột nhẹ 2,10 mm/ngày 62,00 ngày Tốc độ lan sợi nhanh nhất
Môi trường cấp 2 (MT3) 79% Thóc + 20% Mùn cưa + 1% Bột nhẹ 2,05 mm/ngày 62,33 ngày Sinh trưởng tốt, tiết kiệm hạt ngũ cốc

Khuyến nghị kỹ thuật từ tác giả

  1. Đối với môi trường nhân giống cấp 1: Nên sử dụng môi trường nền khoai tây thạch bổ sung 15g Glucose, 4g Cao nấm men và 1g $\text{K}_2\text{HPO}_4$ trên 1000ml nước cất (cùng 16g agar) để đảm bảo hệ sợi có tốc độ phát triển nhanh và mật độ dày, khỏe.
  2. Đối với môi trường nhân giống cấp 2: Khuyến nghị sử dụng công thức kết hợp thóc hạt luộc chín với 10% đến 20% mùn cưa và 1% $\text{CaCO}_3$ (MT2 hoặc MT3) nhằm vừa đảm bảo thời gian ăn kín ống giống (khoảng 62 ngày), vừa giảm tỷ lệ sử dụng thóc hạt, hạ giá thành nguyên liệu.

Đóng góp của đề tài

Đề tài cung cấp những dẫn liệu thực nghiệm ban đầu có hệ thống về các chỉ tiêu sinh lý dinh dưỡng của chủng nấm tùng nhung (Macrocybe crassa) bản địa tại Việt Nam. Kết quả này bổ sung cơ sở khoa học cho các nghiên cứu bảo tồn nguồn gen nấm ăn quý hiếm và phục vụ việc xây dựng quy trình công nghệ nhân giống chuẩn hóa tại các cơ sở nghiên cứu và sản xuất giống nấm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Thí nghiệm chịu ảnh hưởng của điều kiện thời tiết thực tế (nhiệt độ giảm sâu và mưa rét trong đợt tiến hành thí nghiệm 2), dẫn đến thời gian bung sợi và tốc độ sinh trưởng của hệ sợi bị chậm hơn so với giai đoạn trước.
  • Nghiên cứu mới dừng lại ở phạm vi phòng thí nghiệm trên môi trường thạch cấp 1 và môi trường hạt cấp 2 đóng trong ống nghiệm thủy tinh, chưa theo dõi đến giai đoạn nhân giống cấp 3 (giống thương phẩm) và nuôi trồng tạo quả thể trên giá thể đóng túi.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tiếp tục nghiên cứu công thức phối trộn cơ chất nhân giống cấp 3 và thử nghiệm nuôi trồng quả thể nấm tùng nhung trên các nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến như mùn cưa cao su, rơm rạ, bông phế thải.
  • Khảo sát các điều kiện môi trường ngoại cảnh tối ưu cho giai đoạn hình thành quả thể (nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng kích thích, độ thông thoáng và pH giá thể) nhằm hoàn thiện quy trình nuôi trồng nấm tùng nhung thương phẩm tại Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo thiết thực cho:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng, Trồng trọt và Nông nghiệp công nghệ cao đang thực hiện các đề tài về phân lập, thuần hóa và nhân giống nấm lớn.
  • Kỹ thuật viên tại các trung tâm, viện nghiên cứu và cơ sở sản xuất giống nấm ăn, nấm dược liệu quan tâm đến công thức dinh dưỡng tối ưu cho hệ sợi nấm tùng nhung.
  • Phần đáng tham khảo nhất trong công trình là hệ thống số liệu chi tiết ở Chương III và Chương IV về cách thức bố trí thí nghiệm dinh dưỡng đơn nhân tố (C, N, khoáng) và tỷ lệ phối trộn cơ chất nhân giống cấp 2 bằng hạt thóc kết hợp mùn cưa.

Câu hỏi thường gặp

1. Nấm tùng nhung (Macrocybe crassa) có đặc điểm hình thái và dinh dưỡng như thế nào?

Theo mô tả trong khóa luận, nấm tùng nhung có quả thể dạng bán cầu, mũ rộng 7-10 cm, lúc đầu nón lồi sau đó trải rộng, màu trắng dần chuyển sang vàng nhạt như rơm, mép hơi cong vào. Phiến nấm màu trắng, mọc dày, đính tự do; cuống nấm đặc hình trụ dài 10-15 cm, đường kính 1-2 cm, bề mặt có lông nhỏ nếp dọc; mô nấm màu trắng, dày 1,0-1,5 cm. Về dinh dưỡng (theo Inyod & cs, 2016), quả thể chứa 11,85% - 26,10% protein, 53,79% - 68,08% cacbohydrat, 40,86% - 46,56% $\beta$-glucan, cùng lượng khoáng kali, photpho rất cao.

2. Vì sao môi trường bổ sung Glucose được chọn là tối ưu ở cấp 1 dù Fructose cho tốc độ dài cao hơn?

Mặc dù môi trường chứa Fructose đạt tốc độ lan hệ sợi cao nhất (5,08 mm/ngày so với 4,40 mm/ngày của Glucose), nhưng hệ sợi trên môi trường Fructose lại mảnh, mỏng và mật độ rất thưa (++). Ngược lại, môi trường Glucose cho hệ sợi có mật độ dày (++++), mọc bông xù, phân nhánh đều và có khả năng chiếm lĩnh bề mặt cơ chất khỏe hơn. Do đó, Glucose được đánh giá là nguồn cacbon phù hợp nhất.

3. Tại sao khi tăng nồng độ Glucose lên mức 25g - 30g/L thì tốc độ sinh trưởng của hệ sợi lại suy giảm?

Kết quả thí nghiệm 2 cho thấy tốc độ mọc của hệ sợi giảm từ 2,74 mm/ngày (ở mức 15g/L) xuống còn 2,37 mm/ngày (ở mức 25g/L) và 2,22 mm/ngày (ở mức 30g/L), đồng thời thời gian ăn kín đĩa thạch kéo dài lên tới 30,5 ngày. Tác giả giải thích hiện tượng này là do nồng độ đường hòa tan quá cao làm mất cân bằng tỷ lệ C/N trong môi trường, gây hiện tượng ức chế thẩm thấu và làm chậm quá trình sinh trưởng của hệ sợi nấm.

4. Thành phần môi trường nhân giống nấm cấp 1 hoàn chỉnh được tác giả xác định gồm những gì?

Từ các thí nghiệm đơn yếu tố, công thức môi trường nhân giống cấp 1 tối ưu cho nấm tùng nhung gồm: dịch chiết từ 200g khoai tây, 15g Glucose, 4g Cao nấm men, 1g $\text{K}_2\text{HPO}_4$ và 16g Agar pha trong 1000ml nước cất.

5. Công thức cơ chất nào thích hợp nhất để nhân giống nấm tùng nhung cấp 2?

Trong 5 công thức phối trộn cơ chất hạt thóc và mùn cưa, các công thức MT1 (99% thóc + 1% bột nhẹ), MT2 (89% thóc + 10% mùn cưa + 1% bột nhẹ) và MT3 (79% thóc + 20% mùn cưa + 1% bột nhẹ) đều cho kết quả tốt. Trong đó, MT2 cho tốc độ mọc sợi nhanh nhất (2,10 mm/ngày, kín ống sau 62 ngày), và MT3 (2,05 mm/ngày, kín ống sau 62,33 ngày) giúp tiết kiệm đáng kể lượng thóc nguyên liệu.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Lan đã thực hiện đánh giá thực nghiệm có hệ thống về đặc tính sinh trưởng của chủng nấm tùng nhung (Macrocybe crassa) bản địa trên các môi trường dinh dưỡng nhân giống cấp 1 và cấp 2. Nghiên cứu đã xác định được công thức môi trường thạch cấp 1 tối ưu gồm nền dịch chiết khoai tây bổ sung 15g/L Glucose, 4g/L Cao nấm men và 1g/L $\text{K}_2\text{HPO}_4$, đồng thời xác định tỷ lệ cơ chất nhân giống cấp 2 phù hợp là hỗn hợp thóc tẻ bổ sung 10% - 20% mùn cưa và 1% $\text{CaCO}_3$. Kết quả thu được cung cấp cơ sở kỹ thuật thực nghiệm cần thiết phục vụ công tác thuần hóa, giữ giống và hoàn thiện quy trình công nghệ nuôi trồng thương phẩm loài nấm ăn quý này tại Việt Nam.