ĐẶT VẤN ĐỀ Trong lịch sử phát triển nghiên cứu y sinh học, việc ứng dụng sử dụng các dòng tế bào có nguồn gốc từ động vật, thực vật rất phổ biến và là vật liệu không thể thiếu trong việc triển khai nghiên cứu trong phòng thí nghiệm y sinh, đặc biệt là lĩnh vực sản xuất và kiểm định chất lượng thuốc, vắc xin, sinh phẩm y tế phục vụ công tác phòng và điều trị bệnh cho cộng đồng [11;12]. Việc ứng dụng rộng rãi phương pháp nuôi cấy tế bào động vật trong sản xuất cũng như kiểm định các sản phẩm vắc xin và sinh phẩm y tế từ đầu thế kỷ XX, đặc biệt trong 3 thập kỷ gần đây với việc phát triển và ứng dụng rộng rãi các thành tựu khoa học công nghệ tiên tiến như là các các kỹ thuật sinh học phân tử như DNA tái tổ hợp, gene, protein kết hợp với sử dụng các dòng tế bào động vật nguyên phát hoặc thường trực vào việc nghiên cứu y sinh học để phát triển sản xuất ra nhiều loại sản phẩm sinh học công nghệ cao an toàn, hiệu lực và tiện sử dụng trong công tác phòng bệnh chủ động và điều trị bệnh có chất lượng, an toàn và hiệu quả cao [13]. Mỗi loại tế bào thích hợp dùng để nuôi cấy một số loại vi rút khác nhau, nhưng có một số loại tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy nhiều loại vi rút khác nhau như tế bào thận khỉ, tế bào chuột đất vàng, tế bào CHO, tế bào MRC-5, tế bào BHK, và tế bào MD K… [21;22]. Trong số đó, dòng tế bào Vero được sử dụng rộng rãi trong sản xuất và kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế, đặc biệt là các vắc xin vi rút sống giảm độc lực hoặc vi rút bất hoạt như: vắc xin sởi, vắc xin quai bị, vắc xin rubella, vắc xin Viêm não nhật bản B, vắc xin dại, vắc xin rotavirus, vắc xin dengue.
Mặt khác, để chủ động cho công tác kiểm định chất lượng sản phẩm, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã có các tài liệu hướng dẫn kỹ thuật (TRS) cho các cơ quan kiểm định quốc gia các nước hoặc khu vực thiết lập và đánh giá chất lượng và sử dụng dòng tế bào Vero cho sản xuất và kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đồng thời WHO khuyến cáo các cơ quan kiểm định quốc gia nên chủ động xây dựng ngân hàng tế bào riêng mình bao gồm: ngân hàng tế bào gốc giống (Master Cell Bank-MCB) và ngân hàng tế bào làm việc (Working Cell Bank-WC đạt tiêu chuẩn chất lượng theo hướng dẫn của WHO để chủ động trong công tác kiểm định chất lượng và quản lý hệ thống chất lượng của cơ quan quản lý vắc xin quốc gia (NRA) và cung cấp cho hệ thống phòng kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm trên phạm vi toàn quốc [40;41;42]. Việt Nam là một trong số 39 quốc gia có cơ quan quản lý quốc gia vắc xin (NRA) đạt tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và nền công nghiệp sản xuất vắc xin từ những năm 1970. Viện kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế (NICVB) thực hiện hai trong sáu chức năng của cơ quan quản lý quốc gia vắc xin (NRA) là xuất xưởng lô và kiểm định chất lượng trong phòng thí nghiệm, giám sát chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế trên phạm vi toàn quốc, quản lý cung cấp mẫu chuẩn quốc gia (chủng chuẩn, độc tố chuẩn, kháng huyết thanh chuẩn, các dòng tế bào chuẩn.) cho các phòng kiểm định của các nhà sản xuất vắc xin và sinh phẩm trên toàn quốc[4;5;6;35].
Do vậy, việc nghiên cứu đề tài Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào Vero chuẩn quốc gia dùng cho kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế” là nhu cầu rất cấp thiết và phù hợp với yêu cầu thực tế nâng cao năng lực của cơ quan NRA và kiểm định quốc gia trong công tác kiểm định và giám sát chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế trên phạm vi toàn quốc với các mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu xây dựng qui trình chuẩn đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào Vero đạt tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) 2. Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào Vero MCB và WCB 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1. Tế bào động vật và cơ sở của việc nuôi cấy tế bào động vật Tế bào động vật trong cơ thể trưởng thành hầu như t biểu hiện t nh toàn năng, có quá trình chết theo chu trình, rất nhạy cảm với môi trường, tốc độ sinh sản chậm,… vì thế rất khó để nuôi cấy một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào của cơ thể trưởng thành.
Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhau bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô. Mô động vật thường được phân chia theo 4 nhóm: biêu mô (epithelium), mô liên kêt (connective tissue), mô cơ (muscle) và mô thần kinh (nerve). Biêu mô tạo thành lớp phủ và lớp lót trên các bề mặt tự do của cơ thể, cả bên trong và bên ngoài. Ở mô liên kết, các tế bào thường được bao bọc trong thể gian bào rộng kéo dài , đó có thể là chất lỏng, hơi rắn hoặc rắn.
Các tế bào mô cơ thường thon dài và được găn với nhau thành một phiên hoặc một bó bởi mô liên kêt. Mô cơ chịu trách nhiệm cho hầu hêt chuyên động ở động vật bậc cao. Các tế bào mô thần kinh gồm có thân tế bào chứa nhân và một hoặc nhiều phần mở rộng dài và mảnh được gọi là sợi. Các tế bào thần kinh được k ch th ch dễ dàng và truyền xung động rât nhanh [3].
Các tế bào dịch huyền phù Tế bào hồng cầu và bạch huyêt là các mô liên kêt không điên hình dạng thể lỏng. Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyêt là các tế bào dịch huyền phù (suspension cells), hoặc không d nh bám khi chúng sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro. Các tế bào không d nh bám không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng. Chẳng hạn, các tế bào bạch huyết lymphocytes Hình 1a bắt nguồn từ mô bạch huyết là các tế bào không d nh bám và có hình cầu đường k nh từ 1 - m.
Chúng có thể được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng theo phương thức tương tự vi khuẩn. ác tế nh á Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào d nh bám, vì thế chúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng. Trong các ứng dụng, người ta sử dụng rộng rãi các loại tế bào d nh bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi fibroblast Hình 1b và 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các tế bào d nh bám cần có một bề mặt ẩm để sinh trưởng như là thủy tinh hoặc plastic.
Đĩa petri hoặc các chai trục lăn là các loại được sử dụng rộng rãi nhất. Các chai được đặt nằm trên một trục lăn quay tròn chậm trong tủ ấm. Chai có dung t ch 1l chứa khoảng 1 ml môi trường là th ch hợp cho các tế bào vừa sinh trưởng trên thành chai vừa tiếp xúc với môi trường và không kh. Tuy nhiên, chai trục lăn chỉ dùng cho quy mô phòng th nghiệm vì diện t ch bề mặt trên một đơn vị thể t ch của chai nuôi cấy khá nhỏ (500 cm2/l).1: Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cây.
a tế bào bạch huyết, b tế bào biểu mô, c nguyên bào sợi Tỷ lệ diện t ch thể t ch có thể được tăng lên khi các tế bào sinh trưởng trên các giá thể là polymer bọt biển spongy , thể gốm ceramic , các sợi rỗng, bao vi thể (microcapsule), hoặc trên các hạt nhỏ có k ch thước hiển vi gọi là microcarrier 12]. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Năm 19 7, Harrison là người đầu tiên đã nuôi cấy thành công một mảnh mô phôi ếch trong dịch bạch huyết với kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop. Năm 19 3, Carel đã hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong các bình thủy tinh in vitro , dễ tiệt trùng và tạo điều kiện cho tế bào phát triển tốt. Nhưng phải chờ đến những năm 196 , khi hoàn thiện được môi trường nuôi cấy nhân tạo thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật mới được phát triển mạnh và được ứng dụng vào nhiều ngành công nghệ sinh học [19].
4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Môi trường nuôi cấy Vấn đề quan trọng bậc nhất trong nuôi cấy tế bào động vật là môi trường nuôi cấy phải đủ chất dinh dưỡng, nhân tố sinh trưởng, độ pH và nồng độ muối ổn định, đồng thời phải có hệ thống thải bỏ các sản phẩm trao đổi độc hại để tế bào có thể sống và phát triển được. Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật lớn hơn vi sinh vật do, không giống các vi sinh vật, động vật không trao đổi chất nitrogen vô cơ. Vì thế, nhiều amino acid và vitamin cần phải được bổ sung vào môi trường.
Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose. Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ -20% (theo thể t ch huyết tương của động vật có vú. Mặc dù huyết thanh có thành phần chưa được xác định đầy đủ, nhưng nhiều nghiên cứu đã cho thấy nó rất cần thiết cho sự phát triển và tồn tại của tế bào trong nuôi cấy. Môi trường hóa chất Huyết thanh dùng trong môi trường nuôi cấy không chỉ đắt tiền mà còn là nguồn nhiễm bẩn virus và mycoplasma.
Do bản chất hóa học của huyết thanh chưa được xác định đầy đủ nên trong một số trường hợp có thể ảnh hưởng xấu đến kết quả nuôi cấy. Sự hiện diện của nhiều protein khác nhau trong huyết thanh cũng có thể làm phức tạp các quá trình phân tách và tinh sạch đầu ra. Vì l do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xây dựng công thức môi trường không có huyết thanh. Những công thức này chứa các hormone và các nhân tố sinh trưởng được tinh sạch để thay thế cho huyết thanh.