ĐẶT VẤN ĐỀ Có thể tổng kết trong suốt hai thế kỷ vừa qua, với sự phát minh của Bác sĩ người Anh E. Jenner ra chủng đậu bò dùng phòng ngừa dịch đậu mùa vào cuối thế kỷ 18, từ nền tảng khoa học đó suốt giai đoạn 1857-1885 nhà bác học thiên tài người Pháp L. Pasteur trở thành “Ông tổ” của ngành Vi sinh vật và cũng là người đầu tiên chế tạo ra vắc xin phòng bệnh than, bệnh dại và nhiều vắc xin khác tạo ra một trường phái riêng về sử dụng vắc xin phòng bệnh truyền nhiễm tồn tại cho tới ngày nay [5]. Với những thành tựu đạt được về phòng chống và thanh toán bệnh truyền nhiễm bằng tiêm phòng vắc xin như bại liệt, uốn ván sơ sinh, bạch hầu, viêm gan B.
, hiện nay Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã công nhận và khuyến cáo trên toàn cầu rằng tiêm phòng vắc xin là phương thức bảo vệ hiệu quả nhất giúp nhân loại tránh được các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho cộng đồng. Khoa học công nghệ ngày càng phát triển trong các lĩnh vực vi sinh, miễn dịch, sinh học phân tử, di truyền, hóa, lý, tin học và công nghệ nano, peptid, gene và protein đã hỗ trợ đắc lực cho công cuộc nghiên cứu và sản xuất ra nhiều loại vắc xin an toàn, hiệu quả và tiện lợi sử dụng hơn. Vắc xin học cũng đã tiếp cận sang nhiều lĩnh vực mới như bệnh dị ứng, bệnh xã hội, các bệnh nan y (ung thư, HIV/AIDS), bệnh ký sinh trùng (sốt rét) và đạt nhiều thành quả đáng kể. Vắc xin là chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật, được làm mất khả năng gây bệnh hoặc từ vật liệu sinh học không phải vi sinh vật nhưng có khả năng kích thích sự hình thành miễn dịch đặc hiệu để chống đỡ các mầm bệnh tương ứng hoặc được dùng với mục đích khác, vắc xin dùng để bảo vệ cho toàn thể cộng đồng người [6],[7]; Vì vậy việc kiểm soát chất lượng vắc xin trước và trong quá trình sử dụng, bảo quản là đặc biệt quan trọng và phải tuân 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thủ theo các yêu cầu khắt khe theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cũng như tiêu chuẩn của Dược điển của các quốc gia, khu vực toàn cầu.
Theo qui định chung, tất cả các loạt vắc xin và sinh phẩm y tế trước khi cấp phép xuất xưởng để sử dụng với mục đích phòng bệnh đều phải được kiểm định nghiêm ngặt về chất lượng với các tiêu chí như: tính chất vật lý, an toàn, nhận dạng đặc hiệu, công hiệu, vô trùng, chất gây sốt, và các đặc tính về hoá lý [19]. Một trong các loại vắc xin công nghệ mới được sử dụng hiện nay là vắc xin SynflorixTM phòng bệnh do phế cầu (Streptococcus Pneumoniae) gây ra như: Viêm phổi, nhiễm trùng máu, viêm màng não. đã được nghiên cứu và sử dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới và đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong. Vắc xin Synflorix™ là một vắc xin Polysaccharide cộng hợp với Protein D của Haemophilus influenzae không định týp (NTHi) và giải độc tố Bạch hầu và Uốn ván, hấp phụ với nhôm phosphate, giúp bảo vệ trẻ nhỏ phòng được các bệnh gây bởi 10 týp kháng nguyên phế cầu (1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) [26].
Khoảng 40% quốc gia và lãnh thổ áp dụng chương trình tiêm chủng mở rộng vắc xin cộng hợp phế cầu (PCV) đang sử dụng vắc xin Synflorix™. Tại Việt Nam, Synflorix™ là vắc xin được nhập khẩu từ nhà sản xuất GSK. Để đảm bảo tính an toàn cho người sử dụng, việc đảm bảo chất lượng vắc xin là rất quan trọng. Quy trình kiểm định chất lượng vắc xin gồm rất nhiều chỉ tiêu, trong đó thử nghiệm nhận dạng là một trong những chỉ tiêu quan trọng; Tuy nhiên thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™ chưa được thẩm định và chưa được xác nhận giá trị sử dụng theo tiêu chuẩn của ISO 17025, theo tổ chức Y tế thế giới.
2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chính vì vậy, với mục đích sử dụng quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên chứa trong vắc xin Synflorix™ áp dụng tại phòng kiểm định của NICVB. Chúng tôi tiến hành đề tài “Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™”. Với mu ̣c tiêu cu ̣ thể như sau: 1. Đánh giá độ mạnh của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™.
Đánh giá độ đ ặc hiệu của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™. Giới hạn phát hiện của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Phế cầu khuẩn và một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn 1.
Phế cầu khuẩn Hình thái: Phế cầu-Streptococcus pneumoniae là thành viên phổ biến của hệ vi khuẩn chí vùng hầu họng, nhưng cũng là một tác nhân chủ yếu của viêm phổi và viêm màng não ở trẻ em và người lớn [40]. pneumoniae còn được gọi là Diplococcus pneumoniae hoặc pneumococcus (phế cầu khuẩn) là một tác nhân gây bệnh ở người được phân lập đầu tiên ở Pháp bởi LouisPasteur năm 1880 từ mủ apxe. Năm 1883, Talamon (Pháp) phát hiện được phế cầu khuẩn trong đờm, trong máu và trong khối viêm phổi gan hóa của bệnh nhân và mô tả nó. Vai trò của phế cầu gây viêm màng não cấp đã được Netter phát hiện vào năm 1909 khi quan sát thấy hội chứng nhiễm trùng thần kinh trung ương ở một số người bệnh có triệu chứng viêm phổi nặng [40].
Các chủng phế cầu khác nhau có thể được phân biệt nhờ vào cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ polysaccharide bao bọc bên ngoài tế bào. Lớp vỏ polysaccharide tạo nên 1 trong những đặc tính của vi khuẩn khi phát triển trên môi trường nuôi cấy nhân tạo + Pneumococcus dạng S (smooth) có bề mặt khuẩn lạc nhẵn, tròn, kích thước 1mm, mặt bóng hơi lõm được tạo nên bởi những vi khuẩn có vỏ và có khả năng gây bệnh. + Pneumococcus dạng R (rough) là những phế cầu bị mất vỏ polysaccharide (có thể do điều kiện nuôi cấy không đủ chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoặc nuôi cấy trong một thời gian dài), tạo nên những khuẩn lạc có bề 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mặt sần, bờ không đều, mặt gồ ghề, khô.những phế cầu này ít có khả năng gây bệnh [40]. Dạng S có thể biến thành dạng R, mất vỏ và mất khả năng gây bệnh.
Ngược lại dạng R có thể biến thành dạng S khi cho vào môi trường nuôi cấy chất ADN của dạng S. Trên môi trường thạch máu 5% (cừu, thỏ), khuẩn lạc tròn bóng ướt do vi khuẩn có vỏ, không sắc tố, có khuynh hướng lõm ở giữa vì sự hoạt động của enzym ly giải [40]. Phế cầu - Streptococcus pneumoniae là những cầu khuẩn dạng ngọn nến, thường xếp đôi, đường kính khoảng 0,5 – 1,25 μm; là vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào; trong bệnh phẩm hay môi trường chứa nhiều albumin thì có vỏ [1],[9]. Hình thái của phế cầu Streptococcus pneumoniae sau khi nhuộm Gram dưới kính hiển vi 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tính chất nuôi cấy: Vi khuẩn phế cầu phát triển thích hợp ở 370C trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí tùy tiện; phát triển dễ dàng trong các môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng.
Trên thạch máu, khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, trơn trong như giọt sương, xung quanh có vòng tan máu alpha. Trên môi trường nghèo dinh dưỡng, phế cầu kém phát triển, khuẩn lạc thô, nhỏ, xù xì, những khuẩn lạc có vỏ thường lớn, hơi nhày và có màu xám nhẹ. Có thể có khuẩn lạc trung gian M [1],[9]. Tính chất hóa sinh: Phế cầu bị ly giải bởi muối mật, hoặc mật; không có catalase; không phát triển trong môi trường có ethylhydrocuperin [1],[9].
Bốn tính chất quan trọng để xác định phế cầu là: - Catalase ( -) - Optochin (+) - Bị ly giải trong muối mật - Tan máu α Phế cầu được lây nhiễm qua tiếp xúc trực tiếp với các chất tiết hô hấp của người bệnh. Vỏ của Streptococcus pneumoniae là nhân tố gây bệnh chủ yếu, vỏ phế cầu bao gồm các polysaccharide, chúng tạo thành các gel và nước trên tế bào vi khuẩn. Vỏ phế cầu có tác dụng bão hòa opsonin hóa, làm vô hiệu hóa tác dụng của IgG và bổ thể. Do vậy khả năng thực bào vi khuẩn bị giảm xuống và phế cầu vẫn tồn tại để gây bệnh [1],[9].
Tính chất kháng nguyên: Vỏ Polysaccharide là cơ sở duy nhất cho sự phân loại và là yếu tố độc lực duy nhất được biết. Hiện có trên 90 týp huyết thanh phế cầu khuẩn (pneumococci) đã được nhận biết. Phế cầu týp 23 gây bệnh phổ biến nhất. Vỏ của phế cầu là yếu tố độc lực quan trọng và có tính quyết định trong bệnh sinh.
Vỏ ức chế sự thực bào, tạo điều kiện cho vi khuẩn tồn tại, nhân lên trong 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tổ chức vật chủ và sinh bệnh. Vỏ kích thích tạo kháng thể đặc hiệu loài, có tính bảo vệ vật chủ thông qua việc tăng khả năng thực bào, giết vi khuẩn ngay ở trong tế bào bởi các bạch cầu đa nhân. Phức hợp Polysaccharide vỏ phế cầu có thành phần là: glucose, 2- acetamido-2, 4, 6-trideoxy galactose, galactosamine, ribitolphosphate và cholinphosphate [43]. Một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn Phế cầu gây ra các bệnh lý xâm lấn nghiêm trọng như viêm màng não, nhiễm trùng huyết, viêm phổi, viêm xoang và những bệnh không xâm lấn thông thường như viêm tai giữa.
Hình ảnh một số bệnh gây bởi phế cầu Streptococcus pneumoniae 1. Vắc xin phế cầu và vắc xin Synflorix™ 1. Vắc xin phế cầu Theo tổ chức Y tế Thế giới, ước lượng hàng năm có khoảng 476.000 trường hợp tử vong do bệnh phế cầu ở trẻ em dưới 5 tuổi [38]. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhiễm phế cầu là nguyên nhân chính gây tử vong và gánh nặng bệnh tật ở trẻ em trên toàn thế giới đặc biệt là các nước đang phát triển [14].
Ở Việt Nam tỷ lệ mắc phải bệnh phế cầu xâm lấn được ước tính ít nhất là: 48,7 ca/100.000 trẻ em dưới 5 tuổi theo nghiên cứu trước đây được tiến hành tại tỉnh Khánh Hòa năm 2005-2006 [13]. Các týp kháng nguyên phế cầu phổ biến nhất được phát hiện ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà nội giữa những năm 1997-1999 là: các týp 23F, 19F,6B và 14 [15].