Đặt vấn đề Nitơ là nguồn dinh dƣỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật, thực vật và ngay cả với các loài vi sinh vật. Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, riêng trong không khí nitơ chiếm 78% thể tích. Ƣớc tính, trong bầu khí quyển bao trùm lên một hecta đất đai chứa tới 8 triệu tấn nitơ. Lƣợng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu năm.
Tuy nhiên, cây trồng không tự đồng hóa đƣợc nguồn nitơ này. Cây trồng chỉ có thể sử dụng nguồn nitơ trong không khí thông qua quá trình cố định nitơ của các vi sinh vật. Ngày nay, nguồn nitơ cung cấp cho cây trồng trong nông nghiệp chủ yếu là từ phân bón hóa học. Nhƣng việc sử dụng không đúng cách và lạm dụng quá mức dẫn đến hiệu quả không cao và gây ô nhiễm môi trƣờng đất và môi trƣờng nƣớc.
Nhằm khắc phục những bất lợi của việc sử dụng quá mức phân bón hóa học, hiện nay đã và đang có nhiều nghiên cứu ứng dụng về việc sử dụng phân bón sinh học trong nông nghiệp. Đây là một trong những biện pháp làm tăng độ phì nhiêu cho đất, tăng khả năng giữ ẩm đất, cải tạo cấu trúc đất và hạn chế sự ô nhiễm môi trƣờng. Tuy nhiên, giá thành của loại phân này vẫn còn cao và chƣa đƣợc ngƣời nông dân ƣa chuộng sử dụng bởi hiệu quả không tức thì nhƣ phân bón hóa học. Vì vậy, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lƣợng phân bón vi sinh vật là việc làm hết sức cần thiết.
Xuất phát từ các lý do trên chúng tôi đã lựa chọn đề tài nghiên cứu: “Đánh giá sự ảnh hưởng của vi khuẩn cố định nitơ lên một số loại cây trồng”. * Mục tiêu của đề tài: Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn cố định nitơ đã đƣợc tuyển chọn của Phòng Vi sinh vật Môi trƣờng – Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam lên một số loại cây trồng, qua đó 2 phục vụ sản xuất phân hữu cơ nhằm hạn chế việc sử dụng phân bón hóa học, tăng năng suất cây trồng và bảo vệ môi trƣờng. * Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng cố định nitơ và và sự ảnh hƣởng của vi khuẩn cố định nitơ lên năng suất cây trồng khi bổ sung vào đất ở quy mô phòng thí nghiệm. - Đánh giá khả năng cố định nitơ và và sự ảnh hƣởng của vi khuẩn cố định nitơ lên năng suất cây trồng khi bổ sung vào đất ở quy mô ngoài đồng ruộng.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên Nitơ là nguồn dinh dƣỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật, thực vật và các loài vi sinh vật trên trái đất [35]. Lƣợng dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, trong không khí nitơ chiếm khoảng 78% thể tích [30]. Ngƣời ta ƣớc tính, trong bầu không khí bao trùm lên một hecta đất đai chứa tới 8 triệu tấn nitơ.
Lƣợng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu năm. Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 0,4 x 109 tấn nitơ. Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4 x 1015 tỷ tấn nitơ. Muối vô cơ của nitơ (muối ammon, nitrate, nitrite) có độ hòa tan trong nƣớc cao và dễ tham gia vào vòng tuần hoàn.
Chất mùn (humus) trong đất ôn đới thông qua việc khoáng hóa từ từ mà chuyển biến thành nitơ vô cơ. Vùng nhiệt đới do nóng và ẩm, tốc độ khoáng hóa nhanh nên ít tích lũy chất mùn. Khí nitơ là loại khí trơ, muốn mở nối liên kết phân tử của nó cần dùng rất nhiều năng lƣợng. Tuy nhiên, chỉ có một số ít sinh vật trong tự nhiên có thể cố định đƣợc nitơ.
Thông qua tia chớp phóng điện, phun trào của núi lửa có thể cố định đƣợc một lƣợng ít nitơ. Ngoài ra cố định nitơ tại các nhà máy phân đạm hóa học (tốn rất nhiều năng lƣợng) cũng có thể biến nitơ thành muối ammon hoặc nitrate cung cấp cho cây trồng. Khoảng 85% tác dụng cố định nitơ trên Trái đất là do vi khuẩn cố định nitơ thực hiện, trong đó 60% xảy ra trên đất liền và 40% xảy ra ở ngoài đại dƣơng [38]. Cây trồng không đồng hóa trực tiếp nitơ hữu cơ, mà phải nhờ các loại vi sinh vật phân hủy và chuyển hóa nguồn nitơ bền vững thành ra nitơ dạng dễ tiêu (NH3 hoặc NH4+), cung cấp nguồn dinh dƣỡng nitơ cho cây trồng, quá trình này đƣợc gọi là quá trình amôn hóa [9].
Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả 4 năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Các vi sinh vật này có khả năng tiết ra men phân giải protein vào môi trƣờng, thủy phân thành các amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa. Tiếp nối quá trình amôn hóa, các loài vi sinh vật lại chuyển hóa tiếp từ NH3 thành NO3- đƣợc gọi là quá trình nitrat hóa.
Tiếp theo của quá trình nitrat hóa, các loại vi sinh vật lại chuyển hóa từ NO3- thành N để bù trả nitơ cho không khí và đƣợc gọi là quá trình phản nitrat hóa. Dƣới tác dụng của các loại vi sinh vật, nitơ không khí đƣợc chuyển vào các hợp chất hữu cơ chứa nitơ đƣợc gọi là quá trình cố định nitơ phân tử. Tất cả các quá trình: cố định – phân hủy – chuyển hóa và phản nitrat hóa luôn xảy ra dƣới tác dụng của các loài vi sinh vật và tạo đƣợc thế cân bằng nitơ. Nhờ đó mà đã khép kín đƣợc vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên theo hình 1.
Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên (theo J. Quá trình cố định nitơ phân tử Bản thân thực vật không thể sử dụng đƣợc nitơ trong không khí bởi vì nguồn nitơ này không thể sử dụng để làm nguồn dinh dƣỡng cho thực vật đƣợc, nhƣng chúng có thể nhờ vào vi khuẩn để tạo nên các cổng xử lý nitơ trong nốt sần trên rễ cây [36]. Để cây trồng có thể sử dụng nguồn tài nguyên này làm chất dinh dƣỡng, nitơ không khí phải đƣợc chuyển hóa thông qua quá trình cố định nitơ, trong đó nitơ phân tử đƣợc chuyển hóa thành amôn. Nitơ là nguyên tố trơ và khó liên kết hóa học với các nguyên tố khác, nếu không có chất xúc tác và các điều kiện đặc biệt khác, nó không ngừng bị chuyển hóa trong một chu trình khép kín do tác động sinh học hay hóa học khác nhau.
Dƣới tác động của hoạt động hóa học hoặc sinh học, nitơ phân tử chuyển thành đạm vô cơ, sau chuyển thành đạm thực vật hoặc động vật thông qua quá trình chuyển hóa. Một phần đạm thực vật dƣới dạng tàn dƣ và một phần đƣợc cây trồng sử dụng, một phần còn lại mất do rửa trôi và bay hơi do hoạt động của vi sinh vật đất có khả năng phân giải đạm. Quá trình mất đạm chịu ảnh hƣởng lớn bởi các chế độ canh tác. Nitơ đồng thời cũng là yếu tố dinh dƣỡng vô cùng quan trọng không chỉ với sinh vật bậc cao mà cả với các sinh vật có kích thƣớc nhỏ mà mắt thƣờng chúng ta không nhìn thấy đƣợc [7].
Quá trình cố định nitơ có thể xảy ra nhờ các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học, trong đó ngƣời ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm sinh học vì hiệu quả và tính an toàn của nó đối với môi truờng. Quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử nitơ thành NH3 có xúc tác của enzym nitrogenaza, khi có mặt của ATP [31]. 6 nitrogenaza N2 + AH2 + ATP NH3 + A + ADP + P Năm 1992, các nhà khoa học đã hoàn thiện đƣợc cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử nhƣ sau [31]: N=N NH=NH H2N-NH2 NH3 nitrogenaza + - N2 + 8H + 8e + 16 Mg.ATP + 160 2NH3 + H2 + 16Mg. Quá trình cố định nitơ tự do 1.
Vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí (Azotobacter) Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitơ hoạt động nhất. Trong số các loài Azotobacter đã đƣợc miêu tả thì các loài đƣợc nghiên cứu nhiều hơn cả là Az. agilis và Az. chroococcum tạo ra những khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc lan, lúc đầu không màu, sau đó biến thành mầu nâu tối, thậm trí màu đen nhƣng không làm nhuộm màu môi trƣờng khuẩn lạc.
Đặc điểm của Az. vinelandii và Az. agilis là có khuẩn lạc trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng – lục hoặc lam – lục, sắc tố khuếch tán vào môi trƣờng [25], [26], [27]. Khi còn non, tế bào Azotobacter có khả năng di động, hình que đầu tròn, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi, đồng chất, tế bào chất nhuộm màu đồng đều.
Chiều dài của tế bào từ 2 – 3μm đến 4 – 6μm. Tế bào của Az. agilis có kích thƣớc lớn nhất (khoảng 5 – 6μm). Dần dần các tế bào hình que chuyển thành hình cầu hay hình bầu dục lớn với đƣờng kính lên tới 4μm, hình dạng không cố định.
Khi có tiêm mao rụng đi và tế bào trở lên bất động, bọc bao nhầy, tế bào chất xuất hiện cấu tạo dạng hạt, các trế bào tròn có thể phủ lớp vỏ dày và chuyển thành kén. Hình dạng tế bào Azotobacter và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc vào tuổi của giống và điều kiện phát triển [7]. 7 Tất cả các loài Azotobacter (theo hình 1.2) đều sống dị dƣỡng. Để dùng nguồn cacbon, chúng sử dụng nhiều nguồn hữu cơ khác nhau: monosaccarit, disaccarit, một số polysaccarit đa đƣờng, các axit hữu cơ trong đó bao gồm cả các hợp chất thơm.
Nguồn nitơ đối với Azotobacter không chỉ là nitơ phân tử mà còn là muối ammon, nitrat, nitrit, amino axit. Azotobacter [34] Tùy thuộc vào các hợp chất chứa nitơ có trong môi trƣờng mà quá trình cố định nitơ trong môi trƣờng bị ức chế nhiều hay ít. Azotobacter có nhu cầu lớn đối với photpho, canxi và nhận năng lƣợng từ quá trình oxy hóa các hợp chất hữu cơ thành CO2 và H2O. Phần lớn các chủng Azotobacter phát triển ở pH lớn hơn 6 và cần độ ẩm cao hơn so với nhiều loại vi khuẩn, vì vậy ít gặp chúng ở nơi khô hạn.
Phần lớn các chủng Azotobacter phân lập đƣợc từ tự nhiên có khả năng cố định đƣợc trên 10mgN/1g hợp chất cacbon. Một số chủng Azotobacter trong điều kiện thích hợp có khả năng đồng hoá đƣợc đến 300mgN/1g hợp chất cacbon. Nhiều nghiên cứu cho biết khi phát triển chung với một số vi khuẩn khác Azotobacter sẽ có hoạt động cố định nitơ cao hơn so với việc nuôi cấy riêng rẽ.
