Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 ở tế bào ối bà mẹ mang thai nghi ngờ hội chứng Down

Chuyên khảo kỹ thuật phân tích Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene sod1 ở tế bào ối bà mẹ mang thai nghi hội chứng down, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu

• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Y học
• Đề tài: Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 trong tế bào ối để phát hiện hội chứng Down
• Loại tài liệu: đề tài nghiên cứu

Mục lục chi tiết

• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Bệnh sử hội chứng Down
• 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu hội chứng Down
• 1.2. Nguyên nhân hội chứng Down
• 1.3. Tỷ lệ mắc bệnh
• 1.4. Triệu chứng lâm sàng
• 1.5. Tiên lượng
• 1.6. Chẩn đoán hội chứng Down
• 1.6.1. Đối tượng cần chẩn đoán trước sinh
• 1.6.2. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh
• 1.7. Tình hình nghiên cứu hội chứng Down
• 1.7.1. Trên thế giới
• 1.7.2. Tại Việt Nam
• 1.8. Gene SOD1
• 1.8.1. Cấu tạo gene SOD1
• 1.8.2. Sự liên quan của gene SOD1 đến hội chứng Down
• 1.9. Phương pháp và kỹ thuật phân tích nghiên cứu gene SOD-1 từ tế bào ối
• 1.9.1. Quy trình thực hiện xét nghiệm phát hiện tần suất gene SOD1 trong tế bào ối
• 1.9.2. Nguyên lý của phương pháp tách chiết DNA từ tế bào ối
• 1.10. Phản ứng PCR
• 1.10.1. Nguyên lý của phản ứng PCR

Tóm tắt

I. Tổng quan về chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1

Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 trong tế bào ối là một bước quan trọng trong việc phát hiện hội chứng Down. Gene SOD1, nằm trên nhiễm sắc thể 21, có vai trò quan trọng trong việc sản xuất enzyme SOD-1, giúp bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa. Việc phát hiện sớm hội chứng Down thông qua phân tích gene SOD1 có thể giúp giảm thiểu rủi ro cho thai nhi và gia đình.

1.1. Gene SOD1 và vai trò của nó trong hội chứng Down

Gene SOD1 (Superoxide Dismutase 1) có liên quan mật thiết đến hội chứng Down. Người mắc hội chứng này có thêm một nhiễm sắc thể 21, dẫn đến sản xuất enzyme SOD-1 nhiều hơn bình thường, gây ra sự tích tụ H2O2 trong tế bào thần kinh.

1.2. Tầm quan trọng của việc phát hiện sớm hội chứng Down

Phát hiện sớm hội chứng Down giúp gia đình chuẩn bị tốt hơn cho việc chăm sóc trẻ. Các phương pháp hiện tại như siêu âm và xét nghiệm huyết thanh có độ chính xác chưa cao, do đó, việc áp dụng kỹ thuật phân tích gene SOD1 là cần thiết.

II. Thách thức trong việc phát hiện hội chứng Down

Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán, nhưng việc phát hiện hội chứng Down vẫn gặp nhiều thách thức. Các phương pháp hiện tại như Triple test và siêu âm thai không đảm bảo độ chính xác 100%. Điều này dẫn đến việc nhiều trường hợp không được phát hiện kịp thời.

2.1. Độ chính xác của các phương pháp hiện tại

Các phương pháp như Triple test chỉ đạt độ chính xác từ 59-69%. Điều này có thể dẫn đến những quyết định sai lầm trong việc chăm sóc thai nhi.

2.2. Hạn chế trong việc sử dụng kỹ thuật truyền thống

Kỹ thuật truyền thống như nuôi cấy tế bào ối có thể mất nhiều thời gian và không phải lúc nào cũng cho kết quả chính xác. Điều này tạo ra áp lực cho các bác sĩ và gia đình.

III. Phương pháp chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1

Để chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1, cần thực hiện quy trình tách chiết DNA từ tế bào ối và tối ưu hóa phản ứng PCR. Quy trình này bao gồm nhiều bước từ lấy mẫu đến phân tích kết quả, đảm bảo độ chính xác cao nhất.

3.1. Quy trình tách chiết DNA từ tế bào ối

Quy trình tách chiết DNA bao gồm việc giải phóng ADN ra khỏi màng tế bào, loại bỏ protein và kết tủa ADN bằng ethanol. Điều này đảm bảo mẫu DNA thu được đủ sạch để thực hiện các xét nghiệm tiếp theo.

3.2. Tối ưu hóa phản ứng PCR cho gene SOD1

Phản ứng PCR cần được tối ưu hóa về nồng độ DNA khuôn và chu trình nhiệt để đảm bảo khuếch đại gene SOD1 hiệu quả. Việc này giúp tăng độ nhạy và độ chính xác của xét nghiệm.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật phân tích gene SOD1

Kỹ thuật phân tích gene SOD1 đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu và cho thấy hiệu quả cao trong việc phát hiện hội chứng Down. Việc sử dụng kỹ thuật này không chỉ giúp phát hiện sớm mà còn hỗ trợ trong việc đưa ra các quyết định y tế cho thai phụ.

4.1. Kết quả nghiên cứu về gene SOD1

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc phân tích gene SOD1 có thể giúp phát hiện hội chứng Down với độ chính xác cao hơn so với các phương pháp truyền thống. Điều này mở ra hướng đi mới trong chẩn đoán trước sinh.

4.2. Tác động của việc phát hiện sớm đến gia đình

Phát hiện sớm hội chứng Down thông qua gene SOD1 giúp gia đình có thể chuẩn bị tốt hơn về mặt tâm lý và y tế. Điều này có thể giảm bớt gánh nặng cho cả gia đình và xã hội.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu gene SOD1

Nghiên cứu về gene SOD1 trong việc phát hiện hội chứng Down đang mở ra nhiều cơ hội mới cho y học hiện đại. Việc chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 không chỉ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán mà còn góp phần cải thiện chất lượng cuộc sống cho những trẻ em mắc hội chứng này.

5.1. Tương lai của kỹ thuật phân tích gene trong y học

Kỹ thuật phân tích gene dự kiến sẽ trở thành phương pháp chủ yếu trong chẩn đoán trước sinh. Sự phát triển của công nghệ sẽ giúp nâng cao độ chính xác và giảm thiểu rủi ro cho thai nhi.

5.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp phân tích gene mới, đồng thời nâng cao nhận thức về tầm quan trọng của việc phát hiện sớm hội chứng Down trong cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hội chứng Down (Down syndrome) là một trong những bất thường di truyền do rối loạn số lượng nhiễm sắc thể (NST) phổ biến nhất ở trẻ sơ sinh còn sống, với tần số xuất hiện trong cộng đồng khoảng 1/700 đến 1/800. Bệnh gây ra các hậu quả nghiêm trọng về mặt phát triển thể chất và tinh thần như dị tật tim bẩm sinh, tắc hẹp đường tiêu hóa, suy giảm trương lực cơ, chậm phát triển trí tuệ với chỉ số IQ thường dưới 50, cùng nguy cơ cao mắc bệnh Alzheimer khi bước vào độ tuổi trung niên. Cho đến nay, y học hiện đại vẫn chưa có phương pháp điều trị triệt để hội chứng này, do đó công tác sàng lọc và chẩn đoán trước sinh đóng vai trò then chốt nhằm hạn chế tỷ lệ sinh con mắc bệnh.

Tại Việt Nam, các phương pháp chẩn đoán trước sinh truyền thống chủ yếu dựa trên xét nghiệm sàng lọc huyết thanh mẹ (Triple test), kết hợp siêu âm hình thái thai nhi và lập công thức nhiễm sắc thể (karyotype) từ tế bào dịch ối sau khi nuôi cấy. Mặc dù lập karyotype bằng phương pháp nhuộm băng G là tiêu chuẩn chẩn đoán xác định tam nhiễm sắc thể 21 (trisomy 21), kỹ thuật này đòi hỏi thời gian nuôi cấy tế bào kéo dài và độ chính xác chưa đạt mức tuyệt đối trong một số trường hợp phức tạp. Sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR), cho phép khuếch đại đặc hiệu các đoạn trình tự DNA từ một lượng mẫu ban đầu rất nhỏ (khoảng $10^{-3}\ \mu\text{g}$), mở ra hướng tiếp cận nhanh chóng và có độ nhạy cao.

Gene SOD1 (Superoxide Dismutase 1 hay Cu/Zn Superoxide Dismutase) định vị tại vùng 21q22.1 trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 21. Sự hiện diện của thêm một nhiễm sắc thể 21 ở người mắc hội chứng Down dẫn đến sự gia tăng nồng độ enzyme SOD1 lên gấp 1,5 lần so với bình thường, gây tích tụ chất chuyển hóa $H_2O_2$ và làm thoái hóa tế bào thần kinh.

Từ cơ sở thực tiễn và lý luận đó, đề tài "Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 ở tế bào ối bà mẹ mang thai nghi hội chứng Down" được thực hiện nhằm giải quyết 2 mục tiêu cụ thể:

1. Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA từ tế bào ối của bà mẹ mang thai.
2. Tối ưu hóa phản ứng PCR (nồng độ DNA khuôn, chu trình nhiệt) với gene SOD1 ở bệnh nhân mang hội chứng Down so với nhóm đối chứng.

• Đối tượng nghiên cứu: 5 mẫu tế bào ối đã qua nuôi cấy thu nhận từ các thai phụ có chỉ định chọc ối sàng lọc trước sinh (bao gồm 4 mẫu từ thai phụ mang thai bình thường và 1 mẫu từ thai phụ có chẩn đoán thai nhi mắc hội chứng Down).
• Phạm vi và địa điểm thực hiện: Nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Trường Đại học Y Hà Nội.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và cơ sở di truyền học

Cơ chế bệnh sinh của hội chứng Down liên quan trực tiếp đến sự mất cân bằng liều lượng gene trên nhiễm sắc thể 21. Ba dạng đột biến chính được xác định gồm:

• Thể tam nhiễm 21 thuần (chiếm khoảng 92% trường hợp): có bộ NST $47,\text{XX},+21$ hoặc $47,\text{XY},+21$, hình thành do rối loạn phân ly NST trong giảm phân tạo giao tử.
• Thể khảm (chiếm 2–3%): tồn tại đồng thời dòng tế bào $46\ \text{NST}$ và dòng $47\ \text{NST}, +21$ do rối loạn phân cắt hợp tử.
• Thể chuyển đoạn (chiếm 4–5%): bộ NST có 46 chiếc nhưng có một NST 21 chuyển đoạn gắn vào NST tâm đầu khác (nhóm D như 13, 14, 15 hoặc nhóm G như 21, 22).

Nguy cơ sinh con mắc hội chứng Down tăng tỷ lệ thuận với tuổi của người mẹ:

Tuổi người mẹ	Tỷ lệ ước tính trẻ mắc bệnh
20 tuổi	1/1925
25 tuổi	1/1205
30 tuổi	1/885
35 tuổi	1/365
38 tuổi	1/175
40 tuổi	1/110
45 tuổi	1/32
49 tuổi	1/12

Về mặt hóa sinh và phân tử, enzyme Cu/Zn SOD1 là một metalloenzyme chứa ion kẽm ($Zn$) và đồng ($Cu$). Ion $Zn$ liên kết với 3 gốc histidine (His61, His69, His78) và 1 aspartate (Asp81); ion $Cu$ liên kết với 4 gốc histidine (His44, His46, His61, His118), trong đó His61 đóng vai trò cầu nối. Enzyme này xúc tác phản ứng chuyển hóa gốc tự do superoxide: $$2\text{O}_2^{\bullet-} + 2\text{H}^+ \xrightarrow{\text{SOD1}} \text{H}_2\text{O}_2 + \text{O}_2$$ Sau đó, Catalase hoặc Glutathione peroxidase (GPx) chuyển hóa tiếp $\text{H}_2\text{O}_2$ thành $\text{H}_2\text{O}$ và $\text{O}_2$. Ở mô thần kinh của bệnh nhân Down, do Catalase và GPx không tăng tương ứng theo mức tăng 1,5 lần của SOD1, lượng $\text{H}_2\text{O}_2$ dư thừa gây tổn thương oxy hóa màng lipid và hoại tử neuron.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp tách chiết DNA: Sử dụng hỗn hợp dung môi hữu cơ tự pha Phenol : Chloroform : Isoamyl (tỷ lệ 25:24:1) kết hợp Sodium acetate 3M và cồn tuyệt đối để phá màng, phân giải protein bằng Proteinase K ($10\ \text{mg/ml}$) và kết tủa tách chiết DNA tổng số.
• Phương pháp kiểm tra chất lượng và định lượng DNA: Đo mật độ quang học (Optical Density - OD) ở bước sóng $260\ \text{nm}$ và $280\ \text{nm}$ bằng máy quang phổ kế, tính tỷ lệ $\text{OD}{260}/\text{OD}{280}$ và nồng độ DNA theo công thức: $$[\text{DNA}]\ (\mu\text{g/ml}) = \text{OD}_{260} \times \text{Hệ số pha loãng}\ (50) \times 50$$
• Phương pháp điện di gel Agarose: Kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA tổng số trên gel Agarose 0,8% (đệm TAE 1X, điện thế 110V, 500mA trong 30 phút); kiểm tra sản phẩm khuếch đại PCR trên gel Agarose 1,5% (đệm TAE 1X, điện thế 110V, 500mA trong 20 phút) nhuộm Ethidium bromide và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (UV).
• Phương pháp PCR đối chứng nội: Khuếch đại đoạn gene chuẩn GAPDH kích thước khoảng $300\ \text{bp}$ để thẩm định chất lượng DNA khuôn mẫu.
• Phương pháp PCR khuếch đại gene đích: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu Exon 3 của gene SOD1:
  • Mồi xuôi (Exon 3F): 5’- AAG GTG TTG CTT ATC CCA GAA GTC - 3’
  • Mồi ngược (Exon 3R): 5’- CAA TTC CTT TAA GCC CAG GAA GTA - 3’

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan

Chương này tổng hợp hệ thống y văn về hội chứng Down, dịch tễ học, cơ chế di truyền phân tử và các tiến bộ trong chẩn đoán trước sinh. Tác giả phân tích các chương trình tầm soát trên thế giới:

Loại xét nghiệm	Thời điểm áp dụng	Chỉ số sinh hóa / Dấu ấn	Tỷ lệ phát hiện (DR)	Giá trị OAPR
Double test	Tam cá nguyệt 2	AFP, hCG hoặc uE3	45–54%	1/85 – 1/70
Triple test	Tam cá nguyệt 2	AFP, hCG, uE3	59–69%	1/65 – 1/55
Quadruple test	Tam cá nguyệt 2	AFP, hCG, uE3, Inhibin-A	67–76%	1/55 – 1/50
Combined test	Tam cá nguyệt 1	Đo độ mờ da gáy (NT) + hCG + PAPP-A	85%	1/45
Integrated test	Tam cá nguyệt 1 & 2	PAPP-A, NT kết hợp Triple/Quadruple test	94%	1/9 – 1/13

Tại Việt Nam, Triple test kết hợp siêu âm và chọc ối nuôi cấy lập karyotype là quy trình chuẩn nhưng tỷ lệ phát hiện còn giới hạn (59–69%) và thời gian trả kết quả kéo dài. Việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử khảo sát gene SOD1 trên NST 21 được chứng minh là một hướng đi triển vọng.

Chương II: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Tác giả trình bày danh mục 5 mẫu bệnh phẩm tế bào ối thu thập tại Đại học Y Hà Nội:

Mẫu	Họ tên bệnh nhân	Tuổi	Đặc điểm lâm sàng / Quy trình áp dụng
1	Đỗ Thị T.	39	Thai phụ bình thường; áp dụng quy trình tách chiết cũ.
2	Trần Thị H.	42	Thai phụ bình thường; áp dụng quy trình tách chiết cũ.
3	Trần Thị U.	41	Thai phụ bình thường; áp dụng quy trình cải tiến.
4	Nguyễn Thị C.	43	Thai phụ bình thường; áp dụng quy trình cải tiến.
5	Nguyễn Thị Tuyết N.	41	Thai phụ nghi ngờ thai nhi mắc Down cao; áp dụng quy trình cải tiến.

Quy trình tách chiết thực nghiệm gồm 5 bước chính:

1. Rửa tế bào ối: Bổ sung dung dịch NaCl 9‰, ly tâm thu cặn tế bào.
2. Phá màng tế bào và nhân: Bổ sung $500\ \mu\text{l}$ dung dịch K, ủ 10 phút, ly tâm thu cặn; thêm $12,5\ \mu\text{l}$ SDS 10%, $500\ \mu\text{l}$ Lysis buffer và $2\ \mu\text{l}$ Proteinase K ($10\ \text{mg/ml}$), ủ lắc ở $56^\circ\text{C}$ trong 2–3 giờ.
3. Tách chiết protein: Xử lý phân đoạn bằng Phenol : Chloroform : Isoamyl (25:24:1) và Chloroform : Isoamyl (24:1), ly tâm thu dịch nổi.
4. Tủa DNA: Bổ sung Sodium acetate 3M (tỷ lệ 1/10) và cồn tuyệt đối $100%$ (gấp 2,5 lần thể tích), ủ đông tại $-20^\circ\text{C}$ qua đêm.
5. Rửa và hòa tan DNA: Rửa cặn tủa bằng ethanol 70%, ly tâm gạn cồn, làm khô và hòa tan trong $20\ \mu\text{l}$ dung dịch hòa tan chuyên dụng.

Các điểm cải tiến kỹ thuật được đưa vào thử nghiệm gồm:

• Bước rửa: Tăng tốc độ ly tâm từ $3500\ \text{vòng/phút} \times 15\ \text{phút}$ lên $5000\ \text{vòng/phút} \times 15\ \text{phút}$ trên máy ly tâm lạnh ($4^\circ\text{C}$) có rotor tay văng.
• Bước tách chiết: Tăng tốc độ ly tâm loại protein từ $10.000\ \text{vòng/phút} \times 10\ \text{phút}$ lên $13.000\ \text{vòng/phút} \times 10\ \text{phút}$.

Thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đối chứng (GAPDH) và phản ứng PCR khuếch đại SOD1 (tổng thể tích $10\ \mu\text{l}$):

• Thành phần phản ứng: Buffer 10X ($1\ \mu\text{l}$), dNTP mix ($1\ \mu\text{l}$), Taq polymerase ($0,1\ \mu\text{l}$), Primer F ($0,5\ \mu\text{l}$), Primer R ($0,5\ \mu\text{l}$), DNA khuôn ($1,5 - 2\ \mu\text{l}$), nước cất vừa đủ $10\ \mu\text{l}$.
• Chu trình nhiệt PCR gene SOD1: Biến tính ban đầu $94^\circ\text{C}$ trong 5 phút; lặp lại 35 chu kỳ gồm: Biến tính $94^\circ\text{C}$ (30 giây) $\rightarrow$ Bắt cặp mồi $55^\circ\text{C}$ (30 giây) $\rightarrow$ Kéo dài chuỗi $72^\circ\text{C}$ (30 giây); kéo dài kết thúc ở $72^\circ\text{C}$ trong 5 phút và giữ mẫu tại $4^\circ\text{C}$.

Chương III: Kết quả nghiên cứu

• Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA:

Mẫu	Nồng độ DNA ($\mu\text{g/ml}$)	Độ tinh sạch ($\text{OD}{260}/\text{OD}{280}$)	Ghi chú quy trình
1	87	0,9667	Mẫu bình thường, quy trình cũ
2	98	0,9635	Mẫu bình thường, quy trình cũ
3	137	0,9831	Mẫu bình thường, quy trình cải tiến
4	120	0,9756	Mẫu bình thường, quy trình cải tiến
5	124	0,9818	Mẫu bệnh lý Down, quy trình cải tiến

• Điện di DNA tổng số: Cả 5 mẫu cho hình ảnh băng DNA sáng, gọn, vệt sáng phía sau mờ chứng tỏ DNA ít bị đứt gãy và sạch tạp chất protein. Độ đậm quang học của 3 giếng mẫu áp dụng quy trình cải tiến (mẫu 3, 4, 5) sáng vượt trội so với 2 giếng quy trình cũ (mẫu 1, 2), phù hợp với số liệu đo nồng độ quang phổ.
• Khuếch đại PCR gene đối chứng GAPDH: Sản phẩm điện di trên gel Agarose 1,5% của các mẫu 3, 4, 5 đều hiển thị một băng đặc hiệu duy nhất ở vị trí $300\ \text{bp}$ với cường độ phát sáng đồng đều, xác nhận DNA tách chiết đạt chất lượng làm khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại sinh học phân tử.
• Khuếch đại PCR exon 3 gene SOD1:
  • Lần 1 ($1,5\ \mu\text{l}$ DNA khuôn): Băng khuếch đại ở mẫu bệnh (mẫu 5) có độ sáng và kích thước lớn hơn rõ rệt so với mẫu chứng (mẫu 3 và 4), tuy nhiên vạch tín hiệu ở mẫu chứng còn mờ.
  • Lần 2 (Tăng nồng độ lên $2,0\ \mu\text{l}$ DNA khuôn): Băng sản phẩm ở mẫu 3 và 4 đạt độ nét chuẩn, trong khi băng sản phẩm ở mẫu bệnh số 5 có kích thước và đậm độ quang vượt trội rõ rệt.

Chương IV: Bàn luận

Tác giả phân tích tính tối ưu của phương pháp tách chiết Phenol : Chloroform tự pha so với phương pháp tủa protein bằng muối NaCl bão hòa ($5\text{M}$). Do phương pháp phenol chỉ sử dụng Sodium acetate 3M với thể tích bằng 1/10 lượng dịch thu được, lượng muối tồn dư trong mẫu rất thấp, hạn chế tối đa nguy cơ ức chế phản ứng enzyme Taq polymerase hoặc gây sai số khi đo quang học.

Việc cải tiến thông số kỹ thuật (sử dụng máy ly tâm rotor tay văng $5000\ \text{vòng/phút}$ ở $4^\circ\text{C}$ và tăng tốc độ phân tách pha lên $13.000\ \text{vòng/phút}$) đã giúp tăng hiệu suất thu hồi tế bào cặn, dịch nổi trong hơn và bảo vệ DNA không bị phân hủy nhiệt. Kết quả đậm độ băng PCR gene SOD1 ở mẫu thai nhi mắc hội chứng Down đậm hơn mẫu bình thường phản ánh chính xác hiện tượng nhân bội bản sao gene (3 alen thay vì 2 alen) trên nhiễm sắc thể 21.

---

Kết quả và đóng góp

• Kết quả định lượng cụ thể:
  • Quy trình tách chiết cải tiến nâng nồng độ DNA thu nhận từ mức $87 - 98\ \mu\text{g/ml}$ (ở quy trình cũ) lên $120 - 137\ \mu\text{g/ml}$, tỷ số $\text{OD}{260}/\text{OD}{280}$ đạt từ $0,9756$ đến $0,9831$.
  • Thiết lập thành công chu trình nhiệt chuẩn cho cặp mồi Exon 3 gene SOD1 với nhiệt độ bắt cặp tối ưu tại $55^\circ\text{C}$ trong 30 giây qua 35 chu kỳ, dung tích phản ứng $10\ \mu\text{l}$ với thể tích khuôn DNA tối ưu là $2,0\ \mu\text{l}$.
• Đóng góp kỹ thuật:
  • Tác giả chuẩn hóa thành công quy trình tách chiết DNA bằng hóa chất tự pha giá thành thấp, phù hợp với điều kiện trang thiết bị của các phòng xét nghiệm di truyền tại Việt Nam.
  • Chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật PCR khuếch đại exon 3 gene SOD1 để phân biệt sự khác biệt về hàm lượng bản sao gene giữa mẫu tế bào ối bình thường và mẫu mang tam nhiễm sắc thể 21.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Dung lượng mẫu thử nghiệm còn nhỏ (tổng số 5 mẫu, trong đó chỉ có 1 mẫu mang hội chứng Down và 4 mẫu chứng) do mang tính chất nghiên cứu thăm dò và chuẩn hóa quy trình ban đầu.
  • Đánh giá bán định lượng sản phẩm PCR dựa trên đậm độ quang học của băng điện di gel Agarose thông thường, chưa triển khai các kỹ thuật định lượng tuyệt đối như Real-time Quantitative PCR (qPCR).
  • Hóa chất tách chiết sử dụng phenol gây độc hại cho kỹ thuật viên và thao tác ủ tủa qua đêm tốn nhiều thời gian.
• Hướng phát triển:
  • Mở rộng cỡ mẫu nghiên cứu trên quần thể thai phụ lớn hơn để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu lâm sàng.
  • Ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR hoặc Multiplex PCR kết hợp phân tích đa gene trên NST 21 (APP, DYRK, IFNAR, DSCR1) nhằm phát triển bộ kít chẩn đoán nhanh trước sinh.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên sau đại học ngành Di truyền y học, Y sinh học phân tử, Công nghệ sinh học và Sản phụ khoa. Các nội dung có giá trị ứng dụng cao gồm:

• Quy trình chi tiết 5 bước tách chiết DNA từ dịch ối nuôi cấy bằng dung môi hữu cơ tự pha kèm các thông số ly tâm cải tiến.
• Thông số thiết kế mồi, thành phần mẻ phản ứng và chu trình nhiệt chuẩn hóa cho cặp mồi exon 3 gene SOD1 và gene đối chứng GAPDH.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nồng độ enzyme SOD1 lại tăng ở bệnh nhân mắc hội chứng Down và gây tổn thương tế bào thần kinh?

Gene SOD1 nằm tại vị trí 21q22.1 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 21. Người mắc hội chứng Down có 3 nhiễm sắc thể 21, dẫn đến lượng enzyme SOD1 tổng hợp nhiều hơn bình thường 1,5 lần. Phản ứng do SOD1 xúc tác tạo ra nhiều $\text{H}_2\text{O}_2$, nhưng trong mô thần kinh các enzyme thoái hóa tiếp theo (Catalase và GPx) không tăng tương ứng, làm ứ đọng $\text{H}_2\text{O}_2$, gây thoái hóa tế bào thần kinh và dẫn đến suy giảm trí tuệ.

2. Hai điểm thay đổi kỹ thuật chính trong quy trình tách chiết DNA của tác giả là gì?

Thứ nhất, ở bước rửa tế bào ối, tốc độ ly tâm được nâng từ $3500\ \text{vòng/phút} \times 15\ \text{phút}$ lên $5000\ \text{vòng/phút} \times 15\ \text{phút}$ trên máy ly tâm lạnh ($4^\circ\text{C}$) có rotor tay văng nhằm thu hồi tối đa cặn tế bào và tránh đứt gãy DNA. Thứ hai, ở bước phân tách pha loại protein bằng dung môi hữu cơ, vận tốc ly tâm được tăng từ $10.000\ \text{vòng/phút}$ lên $13.000\ \text{vòng/phút} \times 10\ \text{phút}$ giúp dịch nổi thu được trong và triệt để hơn.

3. Trình tự cặp mồi được sử dụng để khuếch đại exon 3 của gene SOD1 là gì?

• Mồi xuôi (Exon 3F): 5’- AAG GTG TTG CTT ATC CCA GAA GTC - 3’
• Mồi ngược (Exon 3R): 5’- CAA TTC CTT TAA GCC CAG GAA GTA - 3’

4. Kết quả PCR giữa mẫu tế bào ối mắc hội chứng Down và mẫu chứng khác nhau như thế nào?

Trên hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 3 gene SOD1, giếng chứa sản phẩm khuếch đại từ mẫu bệnh (mẫu số 5) tạo ra băng DNA có độ sáng quang học đậm nét và kích thước băng lớn hơn rõ rệt so với các giếng của mẫu bình thường (mẫu 3 và 4), phản ánh lượng DNA đích ban đầu của gene SOD1 trong tế bào ối mang trisomy 21 cao hơn người bình thường.

---

Kết luận

Khóa luận đã chuẩn hóa thành công quy trình tách chiết DNA từ mẫu tế bào ối nuôi cấy bằng dung môi Phenol : Chloroform tự pha thông qua việc cải tiến tốc độ và điều kiện ly tâm lạnh. Đề tài xác lập được hệ thống phản ứng PCR tối ưu khuếch đại exon 3 gene SOD1 ($10\ \mu\text{l}$ phản ứng, nhiệt độ gắn mồi $55^\circ\text{C}$, $2\ \mu\text{l}$ DNA khuôn), cho phép phân biệt rõ rệt đậm độ sản phẩm giữa mẫu bình thường và mẫu bệnh lý trisomy 21. Kết quả này cung cấp cơ sở kỹ thuật thực nghiệm phục vụ định hướng phát triển các xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán trước sinh hội chứng Down tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Nền y học hiện đại đã phát hiện và điều trị được rất nhiều bệnh, nâng cao chất lượng sức khỏe của con người. Nhưng bên cạnh đó còn nhiều bệnh nan y chưa tìm ra phương pháp chữa trị, trong đó các bệnh di truyền vẫn là một trong những bài toán khó giải đối với nền y học. Một trong những bệnh di truyền đang được quan tâm rất nhiều hiện này là hội chứng Down ( Down syndrome ). Hội chứng Down là hội chứng hay gặp nhất trong các hội chứng có biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể.

Các hậu quả do hội chứng Down gây ra cho con người là rất lớn : sảy thai, sinh con mang dị tật, trẻ sơ sinh chết sớm, trí tuệ chậm phát triển và vô sinh. Những người mang hội chứng Down cũng đã trở thành những gánh nặng rất lớn cho gia đình và xã hội. Hiện nay y học vẫn chưa tìm ra được phương pháp chữa trị hội chứng Down mà mới chỉ có thể hạn chế trẻ mang hội chứng Down bằng phương pháp chẩn đoán trước sinh. Phương pháp để phát hiện hội chứng Down phổ biến nhất ở Việt Nam hiện nay là sử dụng Tripple test và siêu âm thai nhi, sau đó lập karyotype để xác định trisome 21 ( tam nhiễm nhiễm sắc thể 21 ).

Nhưng phương pháp này hiện nay thường cho kết quả để phát hiện hội chứng Down với độ chính xác chưa đạt được 100% [2]. Với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật hiện nay, kỹ thuật PCR đang được áp dụng rất rộng rãi trong nền y học hiện đại. Kỹ thuật PCR được Kary Mullis tìm ra đã giúp các nghiên cứu về DNA nói riêng, về sinh học phân tử nói chung đạt được những thành tựu đáng kinh ngạc. Nhờ phản ứng này, một đoạn DNA ở một vùng bất kỳ trong bộ gene được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn DNA đó đã biết.

Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng 1 sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA trong in vitro nhờ enzyme DNA polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng DNA làm khuôn ban đầu rất nhỏ (khoảng 10-3 µg). Điều này đặc biệt quan trọng và có ý nghĩa đối với việc phát hiện những mẫu DNA ít như chẩn đoán nhiễm khuẩn trong y học, xác định tội phạm gây án trong kỹ thuật hình sự, khi mà DNA thu được từ các mẫu thường rất ít.

Hiện nay chúng ta đã tìm ra được rất nhiều gene nằm trên nhiễm sắc thể 21 có liên quan đến hội chứng Down, trong đó có 1 gene rất quan trọng là gene SOD1 ( Superoxide Dismutase 1 hay Cu/Zn Superoxide Dismutase ). gene SOD -1 nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 21, quy định tổng hợp enzyme SOD -1. Enzym SOD -1 nằm trong bào tương của các tế bào Eukaryota, có chức năng chống oxi hóa bằng cách chuyển O2- thành H2O2 , sau đó enzym Catalase hoặc Glutathione peroxidase (GPx) sẽ chuyển H2O2 thành O2 và H2O. Người mắc hội chứng Down có thêm 1 nhiễm sắc thể 21, nên lượng enzyme SOD -1 được tổng hợp nhiều hơn bình thường (gấp 1,5 lần), do đó lượng sản phẩm chuyển hóa của nó cũng tăng theo.

Thông thường ở hầu hết các mô thì sự tăng enzyme SOD-1 thường kéo theo các enzyme Catalase và GPx tăng theo tương ứng. Nhưng trong các tế bào thần kinh thì không có sự tăng theo của 2 enzyme trên, chính vì vậy dẫn đến dư thừa lượng H2O2 trong các tế bào thần kinh, dẫn đến thoái hóa và phá hủy tế bào thần kinh. Tạo ra các biểu hiện lâm sàng của hội chứng Down như: đần độn, IQ thấp (dưới 50), tỷ lệ mắc Alzheimer’s cao ở độ tuổi trung niên [16,17]. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “ Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 ở tế bào ối bà mẹ mang thai nghi hội chứng Down ” với mục tiêu : 1.

Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA từ tế bào ối của bà mẹ mang thai. Tối ưu hóa phản ứng PCR ( nồng độ DNA khuôn, chu trình nhiệt ) với gene SOD1 ở bệnh nhân mang hội chứng Down với bệnh nhân chứng. 2 CHƢƠNG I : TỔNG QUAN 1.Bệnh sử hội chứng Down : 1.Lịch sử nghiên cứu hội chứng Down : Hội chứng Down hay gặp nhất trong các hội chứng có biểu hiện rối loạn NST ở trẻ sơ sinh sống. Năm 1846 , Seguin lần đầu tiên mô tả những đặc điểm hình thái của bệnh với tên gọi “ Furfuraceuos Indocy ”.

Năm 1866 , John Langdon Down đã mô tả một số bệnh nhân chậm trí tuệ với những dấu hiệu về hình thái rất đặc trưng : mặt tròn , khe mắt xếch , nếp quạt , hình ảnh bất thường về nếp gấp ở lòng bàn tay và giảm trương lực cơ , … Năm 1959 , Lejenue và các cộng sự đã phát hiện ở những bệnh nhân mắc hội chứng Down có 47 NST và thừa 1 NST số 21 [2].Nguyên nhân hội chứng Down : Khoảng 92% trường hợp mắc hội chứng Down là thể tam nhiễm 2 NST số 21 thuần : 47,XX,+21 hoặc 47,XY,+21. Thể tam nhiễm 21 này xảy ra do rối loạn sự phân ly cặp NST 21 trong quá trình tạo giao tử, karyotype của bố mẹ trong trường hợp này là bình thường. Khoảng 1% những trường hợp này, người ta có thể quan sát thấy thể khảm với dòng thể tam nhiễm 21 rất ít ở một trong hai bố mẹ hoặc rối loạn cấu trúc của các NST khác ( không liên quan đến NST 21 ) trong bộ NST [2]. Khoảng 2-3% trường hợp là thể khảm với 2 dòng tế bào : một dòng tế bào chứa 46 NST và một dòng tế bào chứa 47 NST, thừa 1 NST số 21 : 46,XX/47,XY,+21 hoặc 46,XY/47,XX,+21 hoặc thể khảm xảy ra do rối loạn phân ly cặp NST 21 trong quá trình phân cắt hợp tử.

Kết quả tạo nên dòng tế bào thể tam 3 nhiễm 21 bên cạnh dòng tế bào bình thường, dòng tế bào monosomi 21 bị loại bỏ [2]. Khoảng 4-5% trường hợp là thể chuyển đoạn, trẻ mắc hội chứng Down thể này có 46 NST với 2 NST số 21 và NST số 21 thứ 3 được chuyển đoạn với các NST tâm đầu khác trong bộ NST ( hay gặp là NST số 13,14 hoặc 15 thuộc nhóm D hoặc số 21. Về triệu chứng lâm sàng không khác so với hội chứng Down do thể tam nhiễm 21 thuần, nhưng là bệnh có tính chất gia đình. Bố hoặc mẹ của những đứa trẻ mắc hội chứng Down do chuyển đoạn có thể là những người bình thường nhưng mang NST chuyển đoạn cân bằng giữa NST 21 với các NST số 13,14,15 (nhóm D) hoặc NST số 21,22 ( nhóm G) [2].

Bảng 1 : Khả năng tạo giao tử và hợp tử ở ngƣời mang NST chuyển đoạn giữa NST số 14 và NST số 21 [2]. Người mang Thụ tinh NST chuyển Giao tử (+14,21) Hợp tử Kiểu hình đoạn - 14,21 +14;21 14,14,21,21 (1) - t(14;21) 14t(14;21),21 (2) - t(14;21)21 +14,21 14 t(14;21), 21 (3) 14,t(14;21),21 - 14 14,14,21 (4) - 14 t(14;21) +14;21 14, 14t(14;21), 21 (5) 4 - 21 14,21,21 (6) - 14, t(14;21) +14;21 14,14t(14;21),21,21 (7) -0 14,21 (8) (1): Bình thường. (2): Lành mang NST chuyển đoạn. (3): Hội chứng Down do chuyển đoạn.

(4): Monosomi NST số 21, chết phôi thai. (5): Thể tam nhiễm NST 14, thường chết phôi thai. (6): Monosomi NST số 14, chết phôi thai. (7): Thể tam nhiễm kép NST 14,21, chết phôi thai.

(8): Monosomi kép NST 14,21, chết phôi thai. Cơ chế di truyền hội chứng Down do chuyển đoạn t(21q;22q) cũng tương tự như trường hợp hội chứng Down do chuyển đoạn t(14q;21q) [2].Tỷ lệ mắc bệnh : Hội chứng Down gặp khoảng 1/700-1/800 trẻ sơ sinh. Tần số này không có sự khác biệt nhau giữa các chủng tộc và giữa các tầng lớp xã hội trên thế giới. Theo những nghiên cứu gần đây nhất , tỷ lệ trẻ sơ sinh mắc hội chứng Down tỷ lệ với tuổi của người mẹ [2]: Ước tính tỷ lệ bị hội chứng Down (Công trình nghiên cứu của tiểu bang New York)[15] Tuổi người mẹ Tỷ lệ ước tính 20 1/1925 25 1/1205 30 1/885 33 1/590 35 1/365 36 1/285 38 1/175 40 1/110 6 45 1/32 49 1/12 Ngoài ra, tuổi của người bố cũng ảnh hưởng tới tần số sinh con mắc hội chứng Down [2].Triệu chứng lâm sàng : Hội chứng Down có những biểu hiện điển hình dễ nhận biết : Đầu nhỏ , ngắn , mặt tròn , gốc mũi tẹt , khe mắt xếch , nếp quạt , khẩu cái hẹp , vòm cung cao , lưỡi to và dày hay nứt nẻ , thường thè ra ngoài làm cho miệng không đóng kín ( nửa mở )[2].

Tai nhỏ , có khi biến dạng , vị trí thấp [2]. Cổ ngắn , gáy phẳng rộng [2]. Bàn tay rộng , các ngón ngắn [2]. Chậm phát triển trí tuệ , chỉ số IQ trung bình khoảng 30-50.

Giảm trương lực cơ và nhão dây chằng [2]. Nếp vân da bàn tay : nếp ngang duy nhất ở lòng bàn tay, có thể gặp ở một hoặc cả 2 bàn tay. Chạc ba trục ở vị trí cao thường gặp ở vị trí t”. Tần số hoa vân ở mô út tăng[ 2].

7 Thường gặp là dị tật tim, tần số được xếp theo thứ tự là thông liên thất , thông liên nhĩ , còn ống động mạch. Dị tật tiêu hoá : chủ yếu là hẹp tá tràng , không hậu môn và phình to đại tràng ( Megacolon ) [2].Tiên lƣợng : Người mắc hội chứng Down thường bị chết sớm vì tật của tim hoặc tật của ống tiêu hoá, thường bị nhiễm khuẩn, thường dễ cảm ứng với bệnh bạch cầu. Trước đây khoảng 50% chết trong vòng 5 năm đầu, một số sống sót đến tuổi trưởng thành. Hiện nay do điều kiện xã hội, sự chăm sóc y tế được cải thiện nên bệnh nhân Down sống đến giai đoạn trưởng thành nhiều hơn, nhưng chỉ có một số ít bệnh nhân nữ sinh con.

Nam mắc hội chứng Down vô sinh [15,17].Chẩn đoán hội chứng Down : Hội chứng Down cho đến nay vẫn chưa có khả năng chữa được. Vì vậy, chúng ta nên chẩn đoán trước sinh nhằm hạn chế sinh ra những đứa trẻ mắc hội chứng Down.Đối tƣợng cần chẩn đoán trƣớc sinh : + Tuổi của các cặp vợ chồng, nhất là tuổi của vợ ( ≥ 35 tuổi ). + Các cặp vợ chồng có tiền sử sẩy thai liên tiếp và đẻ con dị tật, đặc biệt là đẻ con mắc hội chứng Down. + Vợ hay chồng là những người mang NST chuyển đoạn cân bằng : 45,XX(XY),t(Dq;21q) hoặc 45,XX(XY),t(21q;Gq).

+ Vợ hoặc chồng có tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến : các chất phóng xạ , các hoá chất , …[2].