Bệnh học và cơ chế kháng thuốc của E. ictaluri, A. hydrophila trên cá tra

Luận án tiến sĩ nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc của E. ictaluri và A. hydrophila gây bệnh gan thận mủ, xuất huyết trên cá tra.

• Tác giả: Quách Văn Cao Thi
• Người hướng dẫn: PGS. Từ Thanh Dung
• Trường học: Trường Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc của hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở Đồng bằng sông Cửu Long
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Cần Thơ

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh kháng thuốc trên cá tra

Bệnh kháng thuốc trên cá tra là một vấn đề nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản hiện đại, đặc biệt ở Đồng bằng sông Cửu Long. Hai loài vi khuẩn chính gây bệnh là Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila, những căn nguyên gây các bệnh nguy hiểm như viêm gan thận mủ (GTM) và bệnh xuất huyết (XH). Các chủng vi khuẩn này có khả năng phát triển kháng thuốc đa chiều, làm giảm hiệu quả điều trị và gây tổn thất kinh tế lớn cho các trang trại nuôi cá. Nghiên cứu về cơ chế kháng thuốc của hai loài vi khuẩn này là cần thiết để phát triển chiến lược phòng ngừa và điều trị hiệu quả, bảo vệ tính bền vững của ngành thủy sản.

1.1. Đặc điểm của Edwardsiella ictaluri

Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn gây bệnh viêm gan thận mủ (GTM) trên cá tra. Đây là loài vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng xâm nhập vào các cơ quan nội tạng như gan, thận và tỳ tạng. Các chủng E. ictaluri phân lập được cho thấy tỷ lệ tương đồng 99-100% với các chủng trên ngân hàng GenBank. Vi khuẩn này gây ra các đốm trắng li ti đặc trưng trên các cơ quan, và có độc lực cao với LD50 dao động từ 1,19x10⁵ đến 1,67x10⁴ CFU/mL.

1.2. Đặc điểm của Aeromonas hydrophila

Aeromonas hydrophila là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá tra, biểu hiện qua các triệu chứng như mắt lồi, đốm xuất huyết quanh vây, miệng, hậu môn và dịch màu hồng trong xoang bụng. Vi khuẩn này cũng là Gram âm có khả năng kháng thuốc cao. Nghiên cứu phân lập được 74 chủng A. hydrophila với 98-100% tương đồng gen, trong đó 29,73% có nguồn gốc từ cá tra bị cảm nhiễm kép.

II. Cơ chế đa kháng thuốc và cảm nhiễm kép

Cảm nhiễm kép (co-infection) giữa E. ictaluri và A. hydrophila trên cá tra là hiện tượng phổ biến trong các trang trại nuôi cá. Nghiên cứu cho thấy 32,84% chủng E. ictaluri và 29,73% chủng A. hydrophila được phân lập từ cá tra mắc cả hai loại bệnh. Sự kháng thuốc đa chiều của hai loài vi khuẩn này tạo nên những thách thức lớn trong điều trị. Cơ chế kháng thuốc được phát triển thông qua các gene kháng thuốc được mang trên plasmid hoặc chromosome, cho phép vi khuẩn tồn tại dưới áp lực của kháng sinh. Hiểu rõ cơ chế này giúp phát triển phương pháp điều trị thay thế và chiến lược quản lý kháng thuốc hiệu quả hơn.

2.1. Cơ chế kháng thuốc của E. ictaluri

Edwardsiella ictaluri phát triển kháng thuốc thông qua các cơ chế bao gồm sản xuất enzyme beta-lactamase, thay đổi vị trí liên kết thuốc trên ribosomes, và pumps máy bơm efflux. Các gene kháng thuốc thường được mang trên plasmid có khả năng truyền ngang giữa các chủng vi khuẩn. Sự tiến hóa kháng thuốc này xuất hiện do sử dụng kháng sinh quá mức và không hợp lý trong nuôi trồng thủy sản.

2.2. Cơ chế kháng thuốc của A. hydrophila

Aeromonas hydrophila sở hữu khả năng kháng thuốc vượt trội với nhiều cơ chế bảo vệ như sản xuất beta-lactamase, các pumps efflux hoạt động, và sự thay đổi trong tính thấm của màng tế bào. Loài vi khuẩn này có độc lực cao do sở hữu các gene độc tố (virulence genes) kết hợp với khả năng kháng thuốc, tạo nên một mối đe dọa lớn trong điều trị bệnh.

III. Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn

Để xác định chính xác loài vi khuẩn gây bệnh, các kỹ thuật phân lập và định danh được áp dụng bao gồm phương pháp sinh hóa truyền thống và sinh học phân tử hiện đại. Từ các mẫu cá tra bệnh gan thận mủ và xuất huyết, đề tài đã thành công phân lập được 141 chủng vi khuẩn (67 chủng E. ictaluri và 74 chủng A. hydrophila). Sử dụng bộ kít API 20E kết hợp với kỹ thuật PCR và giải trình tự gen, các chủng vi khuẩn được định danh với độ chính xác cao. Kết quả cho thấy các chủng phân lập có tương đồng gen từ 98-100% với các chủng chuẩn, xác nhận danh tính của chúng.

3.1. Phương pháp sinh hóa truyền thống

Phương pháp sinh hóa sử dụng bộ kít API 20E để xác định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn như khả năng lên men các loại đường, sản xuất enzyme và các đặc tính khác. Kỹ thuật này cho phép phân loại vi khuẩn dựa trên hình thái và các đặc tính sinh hóa. Mặc dù đơn giản nhưng độ chính xác của phương pháp này có giới hạn, đặc biệt khi cần phân biệt các chủng gần giống nhau.

3.2. Phương pháp sinh học phân tử

Kỹ thuật PCR và giải trình tự gen là các phương pháp xác định định danh có độ chính xác cao nhất. Bằng cách khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng của từng loài vi khuẩn, có thể xác định chính xác danh tính và phân biệt các chủng khác nhau. So sánh dãy gen với ngân hàng GenBank cho phép xác nhận sự tương đồng từ 98-100%, đảm bảo độ tin cậy cao.

IV. Đánh giá độc lực và liều gây chết LD50

Để hiểu rõ mức độ nguy hiểm của các chủng vi khuẩn, các thí nghiệm cảm nhiễm thử được thực hiện với các mật số vi khuẩn khác nhau từ 10² đến 10⁶ CFU/cá. Kết quả cho thấy cá tra cảm nhiễm với E. ictaluri biểu hiện các đốm trắng nhỏ trên gan, thận và tỳ tạng, trong khi nhiễm A. hydrophila gây ra mắt lồi và xuất huyết. Liều gây chết LD50 của 4 chủng E. ictaluri (1ED3, 3ED3, 8ED3, 10ED3) lần lượt là 1,58x10⁴, 1,23x10⁵, 1,67x10⁴ và 1,19x10⁵ CFU/mL, cho thấy mức độ độc lực cao và biến đổi giữa các chủng. Những dữ liệu này cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá nguy hiểm và dự báo mức độ bệnh.

4.1. Phương pháp đánh giá độc lực

Thí nghiệm cảm nhiễm được tiến hành bằng cách tiêm vi khuẩn với các mật số khác nhau vào cá tra khỏe mạnh và theo dõi các dấu hiệu lâm sàng. Độc lực được đánh giá dựa trên tỷ lệ tử vong, thời gian xuất hiện triệu chứng và mức độ nghiêm trọng của bệnh. Các chủng vi khuẩn có độc lực cao sẽ gây tử vong ở nồng độ thấp hơn, trong khi các chủng độc lực thấp cần nồng độ cao hơn.

4.2. Ý nghĩa của LD50 trong đánh giá nguy hiểm

LD50 (Lethal Dose 50) là liều gây chết 50% quần thể thử nghiệm, là chỉ số quan trọng để đánh giá mức độ nguy hiểm của vi khuẩn. Các chủng E. ictaluri với LD50 thấp hơn (như 1ED3 với 1,58x10⁴ CFU/mL) được coi là độc lực cao, trong khi LD50 cao hơn (như 3ED3 với 1,23x10⁵ CFU/mL) có độc lực tương đối thấp hơn. Dữ liệu này giúp dự báo mức độ bệnh và xây dựng chiến lược phòng chống.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương I.1 Tính cấp thiết của luận án Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là 1 trong những loài cá da trơn nước ngọt có giá trị kinh tế cao được nuôi phổ biến ở ĐBSCL (Phan et al. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, việc sản xuất và tiêu thụ cá tra đang phải đối mặt với nhiều khó khăn và thách thức do giá cả bấp bênh, thị trường xuất khẩu không ổn định và việc thâm canh hóa với mật số nuôi cao đã làm cho bệnh trên cá xảy ra thường xuyên hơn (Dung et al., 2008; Le and Cheong, 2010). Nhiều tác nhân gây bệnh (chủ yếu là các bệnh do vi khuẩn và ký sinh trùng (KST) xuất hiện trên cá tra nuôi ở ĐBSCL đã được báo cáo (Crumlish et al., 2002; Dung et al., 2008; Nguyễn Thị Thu Hằng và ctv., 2008; Ly et al., 2009; Nguyễn Thị Thu Hằng và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012; Từ Thanh Dung và ctv. Đặc biệt, các kết quả nghiên cứu gần đây đã xác định 2 loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tra là bệnh GTM do vi khuẩn E.

ictaluri (Crumlish et al., 2002; Từ Thanh Dung và ctv., 2004) và bệnh XH do vi khuẩn A. hydrophila (Ly et al., 2009; Crumlish et al. Đây là 2 bệnh có thể xảy ra trên cá tra ở tất cả các giai đoạn nuôi với tỷ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Từ Thanh Dung và ctv. Cho đến nay, kháng sinh vẫn là giải pháp chủ yếu để kiểm soát 2 bệnh này.

Tuy nhiên, việc sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh (Nguyễn Chính, 2005; Nguyễn Quốc Thịnh và ctv., 2014; Phu et al., 2015) là 1 thách thức không nhỏ đang đặt ra cho nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL do nhiều báo cáo cho thấy việc tồn dư của kháng sinh trong thực phẩm và vấn đề kháng thuốc của vi khuẩn (Cabello, 2006; Sarter et al., 2007; Akinbowale et al. Các nghiên cứu gần đây cho thấy 2 loài vi khuẩn E. hydrophila gây bệnh trên cá tra đã kháng với nhiều loại kháng sinh sử dụng trong nuôi trồng thủy sản (NTTS) (Crumlish et al., 2002; Dung et al., 2008; Từ Thanh Dung và ctv. Ngoài ra, vi khuẩn kháng thuốc có thể là nguồn để truyền và phát tán các gen kháng thuốc của chúng cho các loài vi khuẩn khác (van Elsas and Bailey, 2002; Heuer et al., 2009; Aminov, 2011; Marshall and Levy, 2011; Van Meervenne et al., 2012), đặc biệt là các loài vi khuẩn có tiềm năng, nguy cơ gây bệnh cho con người như vi khuẩn Escherichia coli, Aeromonas sp.

và Pseudomonas sp. (DePaola et al., 1995; Dung et al., 2009; Nguyen et al. Điều này có thể ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng. 1 Bên cạnh đó, người nuôi còn sử dụng kết hợp nhiều loại kháng sinh (Phu et al., 2015) để điều trị bệnh trên cá tra dẫn đến hiện tượng đa kháng thuốc (multi-drug resistance/multiple antibiotic resistance) của vi khuẩn (kháng ít nhất 2 hoặc 3 loại kháng sinh trở lên) (McPhearson et al., 1991; DePaola et al., 1995; Sarter et al.

Kết quả nghiên cứu của Dung et al. (2008) đã xác định 73% vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh biểu hiện sự đa kháng thuốc. Trong khi đó, nghiên cứu của Phạm Thanh Hương và ctv.

(2010) cho thấy có đến 96% vi khuẩn E. ictaluri và 23% vi khuẩn A. hydrophila thể hiện sự đa kháng. Hậu quả của trình trạng vi khuẩn đa kháng thuốc dẫn đến việc điều trị trở nên khó khăn và kém hiệu quả do liều lượng kháng sinh sử dụng tăng và thời gian điều trị kéo dài hơn (Phu et al.

Đặc biệt, trong vài năm trở lại đây hiện tượng nhiễm kép xuất hiện rất phổ biến trên các động vật thủy sản (ĐVTS): vật chủ bị nhiễm 2 hay nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau và mỗi tác nhân cùng ảnh hưởng có hại đến vật chủ (Bakaletz, 2004; Kotob et al. Trên cá tra nuôi ở ĐBSCL thì hiện tượng nhiễm kép 2 loài vi khuẩn E. hydrophila đã gây nhiều thiệt hại và tổn thất cho người nuôi do tỷ lệ cá chết cao đã được Crumlish and Dung (2002) ghi nhận. Kết quả nghiên cứu của Nusbaum and Morrison (2002) cho thấy cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus, Rafinesque) khi bị nhiễm vi khuẩn A.

hydrophila chưa biểu hiện bệnh nhưng bệnh sẽ bộc phát mạnh khi cá nhiễm thêm vi khuẩn E. Hiện nay, việc chẩn đoán bệnh trên cá của người nuôi chủ yếu dựa vào các dấu hiệu biểu hiện lâm sàng thường hay xuất hiện hoặc gửi mẫu xét nghiệm. Điều này không thể đáp ứng được yêu cầu điều trị khi bệnh bùng phát do phải mất thời gian xét nghiệm hoặc do việc chẩn đoán sai tác nhân gây bệnh vì các dấu hiệu bệnh ngoài tự nhiên thường giống nhau có thể do 1 hoặc nhiều tác nhân cùng gây bệnh. Do đó, để ngành nuôi cá tra thâm canh ở ĐBSCL phát triển bền vững thì việc tìm ra các giải pháp kiểm soát, quản lý dịch bệnh và cuối cùng là đưa ra các biện pháp hiệu quả trong việc phòng và trị đối với 2 loài vi khuẩn E.

hydrophila trên cá tra là rất cần thiết. Để thực hiện được điều đó, trước hết cần phải có những kiến thức về đặc điểm bệnh học do 2 loài vi khuẩn này cùng gây bệnh trên cá tra. Ngoài ra, cơ chế đa kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn cũng cần được làm sáng tỏ nhằm quản lý và sử dụng kháng sinh hiệu quả và an toàn hơn. Cho đến nay, việc nghiên cứu các đặc điểm bệnh học nhiễm đơn và hiện tượng kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn trên đã được thực hiện bởi nhiều tác giả (Ferguson et al., 2001; Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2009; Đặng Thuỵ Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010; Nguyễn Thiện Nam và ctv.

Tuy nhiên, các thông tin về bệnh học 2 cá tra nhiễm kép và các đặc điểm phân tử liên quan đến cơ chế đa kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn trên chưa được nghiên cứu ở nước ta. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc của hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở Đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện.2 Mục tiêu của luận án Xác định được 1 số đặc điểm bệnh học cảm nhiễm kép 2 loài vi khuẩn E. hydrophila gây bệnh trên cá tra nuôi thâm canh ở ĐBSCL nhằm làm cơ sở cho việc phát hiện và chẩn đoán bệnh. Xác định được cơ chế đa kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn E.

hydrophila nhằm mục đích kiểm soát, quản lý và sử dụng kháng sinh hiệu quả trên các ao nuôi cá tra ở ĐBSCL.3 Nội dung nghiên cứu Để đạt được 2 mục tiêu trên, nghiên cứu đã thực hiện các nội dung sau: Phân lập và định danh vi khuẩn E. hydrophila gây bệnh GTM và XH trên cá tra nuôi thâm canh ở 1 số tỉnh ĐBSCL. Ngoài ra, đề tài còn phân lập các chủng vi khuẩn E. coli từ ruột và nước ao nuôi cá tra để khảo sát khả năng tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn E.

hydrophila đối với vi khuẩn này. Nghiên cứu 1 số đặc điểm bệnh học (dấu hiệu biểu hiện bệnh, thời gian vi khuẩn gây bệnh, tỷ lệ cá chết và các đặc điểm mô bệnh học) cảm nhiễm kép 2 loài vi khuẩn E. Khảo sát tính nhạy cảm kháng sinh và hiện tượng đa kháng thuốc của các chủng vi khuẩn E. hydrophila phân lập từ cá tra bệnh.

Nghiên cứu các đặc điểm phân tử liên quan đến cơ chế đa kháng thuốc của vi khuẩn như xác định sự hiện diện các integron nhóm 1, 2 và 3; sự hiện diện của các plasmid kháng thuốc và xác định 1 số gen kháng thuốc kháng sinh ở 2 loài vi khuẩn này. Khảo sát khả năng tiếp hợp và trao đổi gen kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn E. hydrophila với vi khuẩn E. coli cũng như khả năng tiếp hợp và trao đổi gen kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn này với nhau.4 Phạm vi nghiên cứu và giới hạn của luận án Nghiên cứu chỉ phân lập các chủng vi khuẩn E.

hydrophila từ các cơ quan gan, thận và tỳ tạng của cá tra bệnh GTM và XH hoặc cá nhiễm kép 2 bệnh này ở 1 số tỉnh có diện tích và sản lượng nuôi thâm canh lớn của 3 vùng ĐBSCL mà không phân lập 2 loài vi khuẩn này từ môi trường ao nuôi cá tra (nước và bùn). Đề tài chỉ khảo sát độc lực của 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri và 4 chủng vi khuẩn A. hydrophila đại diện cho các chủng vi khuẩn được phân lập ở các vùng nuôi cá tra khác nhau của ĐBSCL có số lượng cá nhiễm bệnh và tỷ lệ chết cao và chỉ thực hiện thí nghiệm cảm nhiễm kép trên 2 chủng có độc lực cao nhất.

Thêm vào đó, luận án chỉ khảo sát sự hiện diện của các integron nhóm 1, 2 và 3 (liên quan đến kiểu hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn) mà không xác định các integron nhóm 4 và 5 do các intergron nhóm 4 và 5 không phổ biến như các integron nhóm 1, 2 và 3. Ngoài ra, nghiên cứu chỉ xác định sự hiện diện của các gen kháng tetracycline và florfenicol (đây là 2 trong số nhiều loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trước đây cũng như ở thời điểm hiện tại trong các ao nuôi cá tra ở ĐBSCL).5 Những đóng góp mới của luận án Luận án góp phần cung cấp các thông tin quan trọng về các đặc điểm bệnh học của việc nhiễm kép 2 loài vi khuẩn E. hydrophila trên cá tra nuôi ở ĐBSCL như thời gian vi khuẩn gây bệnh, tỷ lệ cá chết và các đặc điểm bệnh học ở mức đại thể và vi thể như các dấu hiệu biểu hiện bệnh (bên ngoài và bên trong) và các biến đổi về mặt mô bệnh học của 1 số cơ quan cá bệnh. Cung cấp các thông tin mới về tính nhạy cảm kháng sinh, đặc biệt là hiện trạng đa kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn E.

hydrophila gây bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL. Ngoài ra, luận án còn cung cấp các thông tin liên quan đến khả năng kháng thuốc kháng sinh của 2 loài vi khuẩn trên ở mức độ phân tử như xác định 1 số gen kháng tetracycline (tetA, tetB, tetC, tetG, tetK và tetS), florfenicol và sulfonamide (sul1, sul2 và sul3) mà các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào kiểu hình kháng thuốc của vi khuẩn. Luận án góp phần làm sáng tỏ cơ chế đa kháng thuốc ở mức phân tử của 2 loài vi khuẩn E.