mở đầu với các công nghệ trong lĩnh vực thụ tinh nhân tạo và cấy chuyển phôi trong suốt thế kỷ 20, đƣợc tiếp tục với nuôi thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM), thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF), kích hoạt sinh sản vô tính (trinh sản – parthenogenetic), nuôi phôi ống nghiệm và nhân bản các động vật bản địa bằng cách chuyển nhân từ các tế bào sinh dƣỡng. Các công nghệ này góp phần nâng cao năng suất sinh học vật nuôi, bảo tồn đa dạng sinh học. Lợn đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho con ngƣời. Ngoài ra, lợn còn có sự tƣơng đồng với con ngƣời về giải phẫu, di truyền học, sinh lý học (Meuren vcs.
Do đó, việc tạo ra các sản phẩm phôi ống nghiệm ở lợn kết hợp với chuyển gene sẽ tạo ra nhiều cơ hội cho việc sử dụng động vật biến đổi gene nhƣ là thiết bị kiểm tra các phản ứng sinh học của sản phẩm dƣợc, con cho trong ghép mô khác loài, các dòng tế bào gốc phôi hay là sử dụng làm mô hình trong nghiên cứu các bệnh ở ngƣời (Nguyễn Thị Ƣớc vcs, 2008; Katska, 2006) [7, 25]. Hơn nữa, sự phát triển của các công nghệ in vitro cho phép tạo ra các sản phẩm tế bào trứng thành thục và phôi với số lƣợng lớn, giá thành thấp hơn so với các sản phẩm tạo ra trong cơ thể. Kỹ thuật nuôi thành thục trứng lợn trong ống nghiệm (IVM) sử dụng những tế bào trứng chƣa thành thục thu từ các nang trứng trên bề mặt buồng trứng. Điều này cho phép khai thác tiềm năng noãn khổng lồ của buồng trứng lợn.
Hơn nữa, thời gian cho sự thành thục của tế bào trứng lợn và ngƣời là tƣơng tự nhau. Vì vây, nghiên cứu IVM ở lợn là nền tảng ý tƣởng cho kỹ thuật IVM ở ngƣời. Thành thục trứng bao gồm những thay đổi quan trọng trong nhân và tế bào chất của trứng. Thành thục nhân xảy ra trong suốt quá trình nối lại giảm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.
Thành thục tế bào chất cần thiết cho sự thành công của quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi. Sự thành thục tế bào chất không hoàn toàn của tế bào trứng xảy ra giải thích cho những vấn đề chính của sự thụ tinh và sự phát triển của phôi (Melanie, 2007) [39] Thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization) là một trong những kỹ thuật chủ yếu tạo phôi ống nghiệm. Con lợn đầu tiên sinh ra từ kỹ thuật này đƣợc công bố bởi Cheng vcs, 1986. Tiếp theo đó, Matiolli vcs., 1989 công bố về khả năng phát triển in vitro của trứng lợn thành thục, thụ tinh ống nghiệm.
Thụ tinh ống nghiệm ở lợn bị thách thức bởi hiện tƣợng đa tinh trùng. Hiện tƣợng này xảy ra ở lợn nhiều hơn so với các loài động vật khác, ngay cả khi thụ tinh trong cơ thể dƣới các điều kiện thực nghiệm đa dạng (Hunter, 1990) [23]. Mặc dù các kỹ thuật về thành thục ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm ở lợn đã đƣợc cải thiện dần dần trong những năm gần đây, tỷ lệ đa tinh trùng cao ở lợn vẫn là một trong những vẫn đề chính trong hệ thống thụ tinh ống nghiệm ở lợn (Abeydeera, 2001) [9] Nhƣ vậy, hai vấn đề chính cần khắc phục để đảm bảo sự thành công trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn là sự không thành thục tế bào chất của trứng lợn và hiện tƣợng đa tinh trùng. Ở Việt Nam, đây cũng là một trở ngại lớn dẫn đến hiệu suất thấp trong thụ tinh ống nghiệm.
Việc lựa chọn môi trƣờng nuôi thành thục và nồng độ tinh tối ƣu là điều kiện tiên quyết dẫn đến sự thành công trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục và nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm” 1.2 Mục đích Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thành thục, sự hình thành tiền nhân và sự phát triển của tế bào trứng lợn thụ tinh ống nghiệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c Đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm 1.3 Ý nghĩa Góp phần tạo nguồn nguyên liệu trứng lợn thành thục phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực công nghệ Phôi trên động vật có vú, đặc biệt là lợn. Góp phần hoàn thiện hệ thống TTON trong điều kiện ở Việt Nam. Cung cấp nguồn nguyên liệu tế bào phôi chất lƣợng tốt phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo đặc biệt là theo hƣớng y sinh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1Sự hình thành và phát triển tế bào trứng lợn 2.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng Sự hình thành và phát triển nang trứng ở động vật có vú đƣợc chia làm ba giai đoạn: Từ nang nguyên thủy phát triển thành nang sơ cấp, nang thứ cấp và cuối cùng là nang trứng thành thục (De Graff). Nang nguyên thủy sinh ra từ biểu mô mầm chỉ có ở cơ thể con vật trong giai đoạn bào thai. Phân chia nguyên phân của tế bào mầm bắt đầu từ ngày thứ 13 của phôi cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh.
Sau khi con vật đƣợc sinh ra thì các nang nguyên thủy sẽ phát triển thành nang thứ cấp. Nang nguyên thủy thƣờng bao gồm một tế bào trứng (ovocyt I) và đƣợc bao bọc bởi lớp tế bào nang mỏng, dẹt. Số lƣợng nang nguyên thủy của lợn rất lớn khoảng 12000 - 86000 nang. Nang sơ cấp: bao gồm một ovocyt I có đƣờng kính khoảng 30 - 60 m, nhân to, có hạt dự trữ Balliani, bên ngoài đƣợc bao bọc bởi một lớp tế bào nang mỏng.
Hạt Balliani là thể noãn đặc biệt: có tính ƣa axit, dạng hạt nhỏ, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành noãn hoàng. Nang nguyên thủy và nang sơ cấp là những nang trứng không có xoang nang. Nang thứ cấp đƣợc hình thành từ sự phát triển của nang sơ cấp, gồm một ovocyt I đã phát triển lớn hơn, chứa nhiều noãn hoàng hơn. Vỏ của ovocyt I dầy lên tạo thành màng trong suốt, có nhiều lớp tế bào bao quanh.
Nang trứng thành thục (Nang De Graff) do nang thứ cấp phát triển thành gồm một ovocyt I có đƣờng kính 120 – 150 m, có nhiều noãn hoàng hơn, nhân to, tròn, rõ, vẫn còn hạt Balliani. Bao quanh tế bào trứng là màng trong suốt, bên ngoài màng trong suốt là vành phóng xạ. Xung quanh hai bên của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c ovocyt I là phần tế bào hạt dày lên để giữ tế bào trứng gọi là đĩa trứng. Nang trứng thành thục có hai lớp vỏ: lớp vỏ bên ngoài mỏng, lớp vỏ bên trong dày hơn có chứa các mạch quản, lót trong màng trong là lớp tế bào hạt (lớp tế bào màng hạt).
Giữa lớp màng hạt và màng phóng xạ của trứng là xoang nang chứa dịch nang có hormone estrogen và protein. Lợn là loài động vật đa thai sinh sản không theo mùa, một chu kỳ rụng trứng thì có nhiều trứng rụng vì vậy có nhiều nang trứng thành thục cùng phát triển trong một chu kỳ. Trong quá trình phát triển từ nang không có xoang thành nang có xoang trứng đƣợc di chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, sau khi từ nang có xoang phát triển thành nang trứng thành thục thì trứng lại ra bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho sự rụng trứng. Giải phẫu miền vỏ buồng trứng của một gia súc cái có hoạt động sinh sản (Hình 2.1) [59] cho ta thấy nang trứng ở các giai đoạn phát triển khác nhau.
Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành xoang. Khi xoang đƣợc hình thành tế bào trứng tiếp tục phát triển cho đến khi thành thục và rụng ra khỏi buồng trứng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng lợn 2.2 Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng Cấu tạo buồng trứng Quá trình hình thành tế bào trứng xảy ra ở lớp vỏ của buồng trứng từ những noãn bào nguyên thủy đƣợc phân bố vùng ngoại biên. Ở lợn, noãn bào nguyên thủy đƣợc hình thành từ những biểu mô phôi thai khi cơ thể vẫn còn trong giai đoạn bào thai.
Những nang nguyên thủy này đạt 5000 ở thời điểm sinh (Black và Ericsion, 1968) [14] và giảm xuống 420.000 ở thời điểm thành thục về tính (Gosden và Telfer, 1987) [20]. Một số nang nguyên thủy có thể phát triển thành nang sơ cấp hoặc nang có xoang ở ngày 70 sau khi sinh. Cấu tạo tế bào trứng Hình 2. Cấu tạo tế bào trứng [58] Trứng là loại tế bào lớn nhất trong cơ thể chỉ mang n nhiễm sắc thể, có dạng hình cầu (hình 2.2), ở lợn trứng có đƣờng kính từ 0,12 - 0,17 mm.
Cấu tạo tế bào trứng gồm ba phần: Nhân, nguyên sinh chất và màng bao Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c Nhân: bao gồm lƣới nhiễm sắc thể và nhiều hạt nhân Phần nguyên sinh chất: Bao gồm các thành phần chủ yếu là nƣớc, vật chất hữu cơ, muối khoáng và các vật chất khác. Màng: Bao gồm ba lớp màng từ trong ra ngoài: Màng trong, mang giữa và màng ngoài. o Lớp màng trong: Là lớp màng mỏng bao bọc nguyên sinh chất, còn đƣợc gọi là màng noãn hoàng hay là màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi dƣỡng tế bào trứng đã thụ tinh.
Trong màng có chứa men Muraminidaza. o Lớp màng giữa (màng trong suốt): Bao gồm nhiều tế bào, đƣợc sinh ra từ tế bào hình nang, là lớp nuôi dƣỡng tế bào trứng. Tác dụng chủ yếu của màng này là đảm bảo dinh dƣỡng cho tế bào trứng trong buồng trứng và ngăn không cho tình trùng khác loài có thể đi vào nhân trong quá trình thụ tinh do trong màng chứa mem Zonalizin đặc hiệu cho từng loài. Giữa màng trong suốt và màng nguyên sinh chất một khoảng trống.
Khoảng trống này có độ dày khoảng 14 - 24 m, có độ pH 3 - 5, chứa dịch có nồng độ ion cao. o Lớp màng ngoài: Bao gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp. Những tế bào này đƣợc phân bố xung quanh tế bào trứng nên đƣợc gọi là màng phóng xạ, hay màng tia. Các tế bào này liên kết với nhau bởi axít Hyaluronilic.