Giới thiệu dự án

Sốt xuất huyết Dengue (Dengue Fever - DF) và sốt xuất huyết Dengue nặng (Dengue Hemorrhagic Fever - DHF) là các bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus Dengue (DENV) gây ra, lây truyền qua vật trung gian là muỗi cái thuộc chi Aedes (chủ yếu là Aedes aegypti và Aedes albopictus). Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), số lượng ca mắc sốt xuất huyết toàn cầu đã tăng gấp 10 lần trong hai thập kỷ qua, từ 500.000 ca năm 2000 lên hơn 5,2 triệu ca vào năm 2019 tại 129 quốc gia. Tại Việt Nam, sốt xuất huyết là bệnh lưu hành quanh năm; chỉ riêng 8 tháng đầu năm 2023, cả nước ghi nhận 66.386 ca mắc và 14 ca tử vong, tập trung chủ yếu tại khu vực miền Nam và miền Trung với sự lưu hành chủ đạo của hai serotype DENV-1 và DENV-2.

Vấn đề cốt lõi trong kiểm soát DENV nằm ở tính đa dạng di truyền cao của 4 type huyết thanh (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) cùng nhiều kiểu gene (genotype) khác nhau. Khả năng miễn dịch chéo giữa các serotype không bền vững; việc tái nhiễm một serotype khác có thể kích hoạt hiện tượng tăng cường phụ thuộc kháng thể (Antibody-Dependent Enhancement - ADE), dẫn đến hội chứng sốc sốt xuất huyết (Dengue Shock Syndrome - DSS) đe dọa tính mạng. Hiện nay, vaccine thương mại chưa được phổ biến rộng rãi do thách thức bảo vệ đồng thời cả 4 chủng. Do đó, việc xây dựng quy trình giải trình tự toàn bộ hệ gene (Whole Genome Sequencing - WGS) đóng vai trò sống còn trong giám sát biến dị di truyền, theo dõi sự dịch chuyển genotype và hỗ trợ thiết kế sinh phẩm chẩn đoán.

Đề tài "Bước đầu xây dựng quy trình giải trình tự gene virus Dengue sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Nanopore" được thực hiện tại Khoa Vi sinh Miễn dịch – Phòng Vi sinh Arbovirus, Viện Pasteur TP.HCM với các mục tiêu cụ thể:

  1. Sàng lọc và đánh giá chất lượng mẫu huyết thanh nhiễm 4 serotype DENV bằng kỹ thuật Multiplex Realtime RT-PCR với ngưỡng chu kỳ ngưỡng $Ct < 28$.
  2. Thiết lập quy trình khuếch đại phân đoạn hệ gene DENV dài 1–2 kb và tạo thư viện giải trình tự bằng bộ kit Rapid Barcoding trên hệ thống Oxford Nanopore MinION Mk1C.
  3. Tối ưu hóa quy trình tin sinh học (Bioinformatics Pipeline) để lắp ráp và đánh giá bộ gene hoàn chỉnh, đạt mục tiêu độ phủ ngang $\ge 80%$ bộ gene trên các mẫu đạt chuẩn.

Quy trình giải trình tự Nanopore (thế hệ thứ ba) được lựa chọn nhờ ưu thế đọc đoạn dài (long-read sequencing), thiết bị nhỏ gọn, vận hành theo thời gian thực và chi phí đầu tư ban đầu thấp hơn đáng kể so với các hệ thống giải trình tự thế hệ thứ hai (Illumina). Nghiên cứu giới hạn trên 14 mẫu huyết thanh lâm sàng lưu trữ tại Viện Pasteur TP.HCM đại diện cho 4 serotype DENV.

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Trước khi công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) ra đời, việc phân tích di truyền DENV phụ thuộc vào giải trình tự Sanger hoặc chẩn đoán phân tử bằng Realtime RT-PCR và ELISA. Các giải pháp này bộc lộ nhiều khoảng trống kỹ thuật trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử.

Tiêu chí phân tích Phương pháp Sanger (1st Gen) Hệ thống Illumina (2nd Gen) Oxford Nanopore Mk1C (3rd Gen)
Chiều dài đoạn đọc (Read length) Ngắn ($\approx 800 - 1.000\text{ bp}$) Ngắn ($150 - 300\text{ bp}$) Cực dài ($1\text{ kb} - 4\text{ Mb}$)
Thời gian giải trình tự & trả kết quả $2 - 3\text{ ngày}$ $2 - 5\text{ ngày}$ Thời gian thực ($6 - 24\text{ giờ}$)
Tính cơ động của thiết bị Cố định, cồng kềnh phòng lab Cố định, trọng lượng lớn Cầm tay, tích hợp máy tính ($450\text{ g}$)
Khả năng giải quyết vùng lặp/biến dị Thấp, phải ghép nhiều mồi Khó khăn ở vùng lặp Rất cao, bao phủ toàn bộ amplicon
Chi phí đầu tư thiết bị ban đầu Trung bình ($\sim 50.000\text{ USD}$) Rất cao ($> 100.000\text{ USD}$) Rất thấp ($< 5.000\text{ USD}$)
Yêu cầu số lượng mẫu gom mẻ Thấp Rất cao (để tối ưu hóa flowcell) Linh hoạt (1 đến 96 mẫu/mẻ)

Yêu cầu kỹ thuật của quy trình được xác định theo mô hình MoSCoW:

  • Must-have: Khử triệt để DNA hệ gene người trong huyết thanh bằng DNase; khuếch đại cDNA thành các đoạn dsDNA kích thước 1–2 kb; nồng độ thư viện đạt $\ge 2\text{ nM}$; độ phủ ngang hệ gene đạt $\ge 80%$.
  • Should-have: Kiểm tra in-silico primer panel với tỷ lệ bắt cặp $> 80%$ trên các trình tự tham chiếu NCBI; độ bao phủ sâu trung bình $> 30\times$.
  • Could-have: Tự động hóa pipeline basecalling và phân tích QC trực tiếp trên giao diện dòng lệnh.
  • Won't-have: Lắp ráp de novo không sử dụng trình tự tham chiếu trong giai đoạn thử nghiệm ban đầu.

Thiết kế hệ thống

Quy trình kỹ thuật kết hợp giữa ướt (Wet-lab) và khô (Dry-lab) được chuẩn hóa theo danh mục công nghệ và hóa chất chuyên biệt:

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                              WET-LAB ARCHITECTURE                                 |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| 1. Lọc mẫu: QIAamp Viral RNA Kit (Cat#52906)                                      |
| 2. Phản ứng RT-PCR: SuperScript III Reverse Transcriptase (Cat#18080093)          |
| 3. Khử tạp: TURBO DNA-free Kit (Cat#AM1907)                                       |
| 4. Tổng hợp sợi 1: SuperScript III First-Strand Synthesis (Cat#18080051)         |
| 5. Tổng hợp sợi 2: Platinum Taq DNA Polymerase DNA-free (Cat#10966018)            |
| 6. Định lượng dsDNA: Qubit 2.0 Fluorometer + Qubit dsDNA HS Kit (Cat#Q32851)      |
| 7. Tinh sạch & Barcode: AMPure XP Beads (Cat#A63881) + Rapid Barcoding SQK-RBK110 |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                              DRY-LAB ARCHITECTURE                                 |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| 1. Phần cứng: Oxford Nanopore MinION Mk1C (Cat#MIN-101C)                          |
| 2. Basecalling: FAST5 (Dữ liệu dòng điện phân cấp HDF5) -> FASTQ (Phred Q-score)  |
| 3. Kiểm định chất lượng: FastQC v0.9 (Tiêu chí: Q-Score, GC%, Read length)         |
| 4. Căn gióng tham chiếu: Map with Minimap2 v2.26 (NC_001477, NC_001474, ...)      |
| 5. Đánh giá chất lượng gióng: QualiMap BamQC v2.2.2d (BAM format mapping metrics) |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

Hệ thống đánh giá chất lượng đọc sử dụng thang điểm Phred chất lượng base: $$Q = -10 \log_{10}(P)$$ (với $P$ là xác suất đọc sai base; $Q \ge 10$ tương đương độ chính xác $90%$, $Q \ge 20$ đạt $99%$, $Q \ge 30$ đạt $99.9%$).

Methodology

Dự án áp dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm có đối chứng, chia làm 3 giai đoạn chặt chẽ:

  1. Giai đoạn 1 (Sàng lọc mẫu & In-silico validation): Đánh giá 14 mẫu huyết thanh bằng QuantStudio 5 Realtime PCR; phân tích ái lực bắt cặp của các bộ mồi với hệ gene tham chiếu trên phần mềm AnnHyb 4.0.
  2. Giai đoạn 2 (Xử lý mẫu & Giải trình tự): Tinh sạch RNA, loại DNA người, tạo thư viện barcoding và nạp lên Flowcell MinION Mk1C.
  3. Giai đoạn 3 (Phân tích dữ liệu sinh học & Đánh giá rủi ro): Lắp ráp dữ liệu BAM/SAM, đánh giá độ phủ sâu (Depth of coverage - $X$) và độ phủ ngang (Breadth of coverage - $%$), xác định nguyên nhân mất đoạn nucleotide.

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình thực nghiệm được triển khai chi tiết qua các bước kỹ thuật tiêu chuẩn:

Bước 1: Tách chiết RNA và Realtime RT-PCR

RNA virus được tách chiết từ $140\ \mu\text{L}$ huyết thanh bằng kit QIAamp Viral RNA. Phản ứng Multiplex Realtime RT-PCR sử dụng hệ sinh phẩm SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit với chu trình nhiệt: Phiên mã ngược $50^\circ\text{C}$ trong $30\text{ phút}$; Tiền biến tính $95^\circ\text{C}$ trong $2\text{ phút}$; 45 chu kỳ gồm Biến tính ($95^\circ\text{C}$, $10\text{ giây}$), Bắt cặp ($60^\circ\text{C}$, $30\text{ giây}$) và Kéo dài ($72^\circ\text{C}$, $30\text{ giây}$).

Bước 2: Loại bỏ DNA vật chủ và tổng hợp cDNA sợi đơn

Hỗn hợp $50\ \mu\text{L}$ RNA mẫu được xử lý với $5\ \mu\text{L}$ 10X TURBO DNase Buffer và $1\ \mu\text{L}$ TURBO DNase ($2\text{ U/}\mu\text{L}$), ủ $37^\circ\text{C}$ trong $30\text{ phút}$, bất hoạt bằng DNase Inactivation Reagent. Phản ứng tổng hợp cDNA sợi đơn thực hiện bằng mồi ngẫu nhiên (Random Primers $50\text{ ng/}\mu\text{L}$) và enzyme SuperScript III RT ($200\text{ U/}\mu\text{L}$), ủ nhiệt: $25^\circ\text{C}$ ($10\text{ phút}$) $\rightarrow$ $50^\circ\text{C}$ ($50\text{ phút}$) $\rightarrow$ $85^\circ\text{C}$ ($5\text{ phút}$), sau đó xử lý với $1\ \mu\text{L}$ RNase H ở $37^\circ\text{C}$ trong $20\text{ phút}$.

Bước 3: Tổng hợp dsDNA theo phân đoạn amplicon

Khuếch đại phân đoạn $1 - 2\text{ kb}$ bằng Platinum Taq DNA Polymerase ($5\text{ U/}\mu\text{L}$). Thành phần phản ứng: $2.5\ \mu\text{L}$ 10X Buffer, $1\ \mu\text{L}$ $\text{Mg}^{2+}$ ($50\text{ mM}$), $0.5\ \mu\text{L}$ dNTP ($10\text{ mM}$), $0.5\ \mu\text{L}$ mồi xuôi ($10\ \mu\text{M}$), $0.5\ \mu\text{L}$ mồi ngược ($10\ \mu\text{M}$), $0.5\ \mu\text{L}$ Platinum Taq và nước cất vừa đủ $25\ \mu\text{L}$.

# Chu trình nhiệt phản ứng PCR tổng hợp dsDNA trên máy MiniAmp Thermal Cycler:
1. Tiền biến tính:  94°C trong 2 phút (1 chu kỳ)
2. Biến tính:       94°C trong 30 giây \
3. Bắt cặp:        55°C trong 30 giây  > 35 chu kỳ
4. Kéo dài:        72°C trong 2 phút  /
5. Kéo dài sau:    72°C trong 10 phút (1 chu kỳ)
6. Giữ mẫu:        4°C vô hạn

Bước 4: Chuẩn bị thư viện và giải trình tự Nanopore

Đo nồng độ dịch khuếch đại bằng Qubit 2.0 dsDNA HS Assay, pha loãng về $0.2\text{ ng/}\mu\text{L}$. Thực hiện gắn barcode bằng bộ kit Rapid Barcoding SQK-RBK110.96 ($30^\circ\text{C}$ trong $2\text{ phút}$ và $80^\circ\text{C}$ trong $2\text{ phút}$). Gom thư viện (pool), tinh sạch bằng hạt từ AMPure XP Beads theo tỷ lệ chuẩn, đo nồng độ tính toán theo công thức: $$V_{\text{library pool}}\ (\mu\text{L}) = \frac{\text{Target quantity loading}\ (800\text{ ng})}{\text{Pool concentration}\ (\text{ng/}\mu\text{L})}$$ $$V_{\text{EB}}\ (\mu\text{L}) = 11 - V_{\text{library pool}}\ (\mu\text{L})$$ Bổ sung $1\ \mu\text{L}$ Rapid Adapter F (RAPF), ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng và nạp mẫu vào thiết bị MinION Mk1C.

# Pipeline xử lý dữ liệu tin sinh học thực hiện trên nền tảng UseGalaxy v23.0:
# 1. Chuyển đổi tín hiệu thô FAST5 sang FASTQ và đánh giá chất lượng
fastqc --threads 4 input_reads.fastq -o ./qc_reports/

# 2. Căn gióng đoạn đọc vào trình tự hệ gene tham chiếu DENV
minimap2 -ax map-ont -t 8 reference_NC_001474.fasta input_reads.fastq | \
samtools view -bS - | samtools sort -o mapped_sorted.bam

# 3. Đánh giá thống kê độ bao phủ và chất lượng mapping
qualimap bamqc -bam mapped_sorted.bam -outdir ./bamqc_results/ --java-mem-size=4G

Testing và validation

1. Đánh giá chất lượng mẫu đầu vào (Realtime RT-PCR)

Từ 14 mẫu ban đầu, kết quả xác định 7 mẫu đạt tiêu chuẩn $Ct < 28$ (giá trị dao động từ 15 đến 23):

  • DENV-1: Mẫu 0890/22 ($Ct = 22$), Mẫu 1042/22 ($Ct = 23$).
  • DENV-2: Mẫu 1127/22 ($Ct = 22$), Mẫu 1129/22 ($Ct = 24$), Mẫu 1212/22 ($Ct = 20$).
  • DENV-3: Mẫu VL-03 ($Ct = 15$).
  • DENV-4: Mẫu 1040/22 ($Ct = 23$). (7 mẫu còn lại có giá trị $Ct$ từ 28 đến 31 bị loại bỏ do không đạt chuẩn tải lượng virus).

2. Kết quả kiểm tra in-silico Primer Panel

  • DENV-1: 7 cặp mồi (1F-4R đến 21F-23R) có kích thước amplicon từ $1.257\text{ bp}$ đến $2.179\text{ bp}$, tỷ lệ bắt cặp $81% - 100%$.
  • DENV-2: 6 cặp mồi có kích thước amplicon từ $1.737\text{ bp}$ đến $2.033\text{ bp}$; các mồi đều bắt cặp $81% - 100%$, ngoại trừ mồi D2_23R chỉ đạt $52%$ ái lực bắt cặp.
  • DENV-3: 6 cặp mồi (1F-4R đến 21F-24R) có kích thước amplicon từ $1.698\text{ bp}$ đến $2.329\text{ bp}$, tỷ lệ bắt cặp $90.95% - 100%$.
  • DENV-4: 6 cặp mồi (1F-4R đến 21F-24R) có kích thước amplicon từ $1.690\text{ bp}$ đến $2.008\text{ bp}$, tỷ lệ bắt cặp $90.5% - 100%$.

3. Chuẩn bị thư viện giải trình tự

Tất cả 7/7 mẫu sau khi xử lý đều đạt ngưỡng nồng độ thư viện $> 2\text{ nM}$ (dao động từ $2.08\text{ nM}$ đến $20.03\text{ nM}$).

Kết quả đạt được

Dữ liệu giải trình tự sau khi lắp ráp trên trình tự tham chiếu NCBI (DENV-1: NC_001477.1, DENV-2: NC_001474.2, DENV-3: NC_001475.2, DENV-4: NC_002640.1) ghi nhận $6/7$ mẫu đạt mục tiêu độ phủ ngang $> 80%$.

Mã mẫu Serotype Genotype xác định Tổng số reads Số reads map Độ phủ sâu ($X$) Độ phủ ngang (%) Số nucleotide N
0890/22 DENV-1 Genotype I 4.400 1.778 $112\times$ 95,95% 511
1042/22 DENV-1 Genotype I 2.410 745 $46\times$ 77,78% 2.385
1127/22 DENV-2 Cosmopolitan 198.067 179.814 $13.669\times$ 94,98% 538
1129/22 DENV-2 Cosmopolitan 273.679 255.885 $20.525\times$ 93,50% 697
1212/22 DENV-2 Cosmopolitan 120.813 95.767 $5.372\times$ 87,06% 1.387
VL-03 DENV-3 Genotype II 28.493 22.318 $1.415\times$ 85,86% 1.535
1040/22 DENV-4 Genotype I 3.988 1.566 $119\times$ 82,85% 1.826 
                       BẢNG SO SÁNH ĐỘ PHỦ HỆ GENE (%)

Phân tích nguyên nhân biến thiên độ bao phủ:

  1. Vùng không mã hóa (5'UTR và 3'UTR): Mất đoạn nucleotide đầu $5'\text{UTR}$ ($1 - 95\text{ nt}$) và đuôi $3'\text{UTR}$ ($10.117 - 10.734\text{ nt}$) xuất hiện ở hầu hết các mẫu do mồi PCR được thiết kế bên trong khung đọc mở (ORF) để đảm bảo tính đặc hiệu khuếch đại, không làm ảnh hưởng đến việc phân tích các protein chức năng.
  2. Vùng Polyprotein / NS5: Ở mẫu 1042/22 (đạt $77.78%$) và mẫu 1212/22 (đạt $87.06%$), các đoạn mất nằm tại vùng mã hóa protein không cấu trúc NS5 (chức năng RNA-dependent RNA polymerase). Nguyên nhân trực tiếp là do nồng độ thư viện của mẫu 1042/22 thấp ($2.08\text{ nM}$ - sát ngưỡng tối thiểu $2\text{ nM}$) và mồi D2_23R có tỷ lệ bắt cặp thấp ($52%$), dẫn đến sụt giảm số lượng đoạn đọc được phân bổ cho vùng gen này.

Đổi mới và đóng góp

Nghiên cứu mang lại những cải tiến kỹ thuật có giá trị thực tiễn cao:

  • Tối ưu hóa chiến lược Amplicon Tiling dài: Thay vì sử dụng hàng chục cặp mồi phân đoạn ngắn $200 - 400\text{ bp}$ phức tạp, quy trình thiết kế các amplicon dài $1 - 2\text{ kb}$ giúp giảm số lượng giếng phản ứng PCR xuống chỉ còn $6 - 7$ phản ứng cho mỗi mẫu, hạn chế tối đa nguy cơ ngoại nhiễm và sai lệch do phản ứng chéo.
  • Rút ngắn thời gian chẩn đoán dịch tễ học: Giảm tổng thời gian từ khi nhận mẫu huyết thanh đến khi có kết quả hệ gene hoàn chỉnh xuống dưới $24\text{ giờ}$, cho phép đáp ứng khẩn cấp trong các ổ dịch bùng phát nhanh.
  • Hiệu quả kinh tế vượt trội: Chi phí hóa chất và tiêu hao cho một mẫu giải trình tự giảm hơn $60%$ so với quy trình NGS truyền thống khi chạy trên hệ thống Illumina mẻ nhỏ.
Chỉ số so sánh Phương pháp Sanger truyền thống Quy trình chuẩn Illumina NGS Quy trình Nanopore của đề tài
Số lượng cặp mồi cần thiết $20 - 30\text{ cặp mồi/mẫu}$ Hàng trăm mồi multiplex ngắn Chỉ 6 - 7 cặp mồi amplicon dài
Thời gian chuẩn bị thư viện $8 - 12\text{ giờ}$ $6 - 8\text{ giờ}$ 2 - 3 giờ (Rapid Barcoding)
Độ phủ sâu tối đa đạt được $1\times$ $1.000\times - 5.000\times$ Lên đến 20.525x (Mẫu 1129/22)
Khả năng triển khai tại chỗ Không khả thi Phòng thí nghiệm trung tâm Triển khai tại thực địa / Lab di động

Về mặt khoa học, nghiên cứu cung cấp dữ liệu di truyền đầy đủ của các chủng DENV lưu hành thực tế tại miền Nam Việt Nam năm 2022–2023, khẳng định sự ưu thế của genotype DENV-1 Genotype I và DENV-2 Cosmopolitan trong đợt dịch.

Ứng dụng thực tế và triển khai

Quy trình có khả năng ứng dụng trực tiếp vào hệ thống y tế dự phòng và kiểm soát dịch bệnh:

  • Giám sát biến chủng tại các điểm nóng dịch bệnh (Outbreak Response): Nhờ thiết bị MinION Mk1C tích hợp sẵn màn hình cảm ứng và máy tính xử lý tín hiệu, quy trình có thể triển khai trực tiếp tại các Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật (CDC) tỉnh/thành phố mà không cần đầu tư phòng lab giải trình tự quy mô lớn.
  • Theo dõi tiến hóa và dịch chuyển Genotype: Phát hiện sớm các đột biến trôi dạt kháng nguyên (antigenic drift) trên gene $E$ (Envelope protein) hoặc các đột biến trên gene không cấu trúc $NS1, NS3, NS5$ liên quan đến độc lực và khả năng nhân lên của virus.
  • Phân tích hiệu quả chi phí (Cost-Benefit):
    • Chi phí thiết bị: Thiết bị MinION Mk1C có giá thành chỉ bằng khoảng $\frac{1}{20}$ so với hệ thống giải trình tự quang học cố định.
    • Tối ưu hóa hóa chất: Flowcell Nanopore có thể nạp multiplex lên đến 12 hoặc 96 mẫu thông qua mã vạch (Rapid Barcodes), giúp tối đa hóa sản lượng dữ liệu trên mỗi lần chạy.
LỘ TRÌNH TRIỂN KHAI MỞ RỘNG (12 THÁNG):

Hạn chế và hướng phát triển

Nghiên cứu thẳng thắn ghi nhận các hạn chế kỹ thuật:

  • Ái lực bắt cặp của mồi D2_23R: Mồi ngược D2_23R thiết kế cho DENV-2 chỉ đạt tỷ lệ bắt cặp in-silico $52%$, gây mất đoạn vùng gene $NS5$ và đầu $3'\text{UTR}$ trên một số mẫu DENV-2.
  • Thất thoát nồng độ trong thao tác ướt: Quá trình tinh sạch bằng hạt từ AMPure XP Beads đòi hỏi kỹ thuật hút nhả chính xác; sự dao động nồng độ thư viện (như mẫu 1042/22 đạt $2.08\text{ nM}$) ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng đoạn đọc thu nhận.
  • Ngưỡng tải lượng virus: Quy trình hiện tại chỉ tối ưu cho các mẫu có $Ct < 28$. Các mẫu có $Ct \ge 28$ gặp khó khăn trong việc khuếch đại các amplicon kích thước dài $> 1.5\text{ kb}$.

Hướng nghiên cứu phát triển tiếp theo:

  1. Thiết kế lại mồi D2_23R dưới dạng mồi thoái hóa (Degenerate Primers) để bao phủ $100%$ các phân nhánh genotype DENV-2.
  2. Tích hợp giao thức giải trình tự RNA trực tiếp (Direct RNA Sequencing) của Nanopore nhằm loại bỏ hoàn toàn bước phiên mã ngược và khuếch đại PCR, giúp đọc trực tiếp các biến đổi biểu sinh (RNA modifications) của virus.
  3. Xây dựng đường ống phân tích tự động hóa đóng gói trong Docker/Nextflow kết hợp gọi biến chủng (Variant Calling) tự động.

Đối tượng hưởng lợi

  • Sinh viên & Học viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học / Y sinh: Nguồn tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật NGS từ khâu thiết kế primer, chuẩn bị thư viện amplicon dài đến phân tích tin sinh học trên nền tảng Galaxy.
  • Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm & Nhà phát triển quy trình: Cung cấp quy trình vận hành tiêu chuẩn (SOP) với các thông số hóa chất, thể tích, chu trình nhiệt và tiêu chí QC cụ thể có thể tái lập ngay lập tức.
  • Cơ quan quản lý Y tế & Viện nghiên cứu dịch tễ: Cung cấp giải pháp kỹ thuật có tính cơ động cao, giá thành hợp lý để xây dựng mạng lưới giám sát dịch tễ học phân tử DENV theo thời gian thực tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu cấu hình phần cứng và thiết bị tối thiểu để vận hành quy trình Nanopore này là gì?

Quy trình sử dụng thiết bị cầm tay Oxford Nanopore MinION Mk1C (đã tích hợp màn hình cảm ứng và bộ vi xử lý GPU/CPU chuyên dụng cho basecalling). Nếu sử dụng thiết bị MinION Mk1B truyền thống, cần kết nối với máy tính có cấu hình tối thiểu: CPU Intel Core i7/i9 hoặc AMD Ryzen 7 (tối thiểu 8 cores), RAM $32\text{ GB}$, ổ cứng SSD NVMe tối thiểu $1\text{ TB}$ và card đồ họa chuyên dụng NVIDIA RTX (tối thiểu $8\text{ GB}$ VRAM) để chạy phần mềm Guppy/Dorado Basecaller.

2. Giới hạn nồng độ mẫu đầu vào và giá trị Ct tối ưu cho quy trình là bao nhiêu?

Mẫu huyết thanh đầu vào cần có giá trị $Ct < 28$ qua kiểm tra Realtime RT-PCR (tương đương nồng độ bản sao RNA virus cao). Nồng độ DNA sợi đôi sau khuếch đại amplicon phải đạt tối thiểu $0.2\text{ ng/}\mu\text{L}$, và tổng nồng độ thư viện sau khi gắn barcode và gom mẫu phải đạt $\ge 2\text{ nM}$ (khuyến nghị tối ưu từ $8\text{ nM}$ đến $20\text{ nM}$) để đảm bảo hiệu suất nạp lên Flowcell.

3. Quy trình này có thể tích hợp trực tiếp vào hệ thống giám sát dịch bệnh quốc gia không?

Hoàn toàn khả thi. Dữ liệu FASTQ đầu ra từ MinION Mk1C tương thích với tất cả các cơ sở dữ liệu quốc tế như NCBI GenBank, GISAID và Nextstrain. Quy trình lắp ráp có thể tiêu chuẩn hóa thành các script tự động để tải dữ liệu trực tiếp lên hệ thống quản lý dịch tễ của Cục Y tế Dự phòng.

4. Chi phí tiêu hao cho mỗi phản ứng giải trình tự và thời gian bảo trì Flowcell như thế nào?

Khi chạy multiplex 12 mẫu trên một Flowcell R9.4.1/R10.4.1, chi phí tiêu hao hóa chất cho mỗi mẫu dao động từ $40 - 60\text{ USD}$ (thấp hơn nhiều so với Sanger toàn bộ hệ gene). Flowcell chưa sử dụng bảo quản ở $4 - 8^\circ\text{C}$ có hạn dùng từ 3–6 tháng; sau khi chạy, flowcell có thể rửa bằng Flow Cell Wash Kit để tái sử dụng nếu số lượng lỗ nano (active pores) còn trên 800 lỗ.

5. Tại sao bắt buộc phải xử lý mẫu bằng kit TURBO DNA-free trước khi tổng hợp cDNA?

Trong mẫu huyết thanh lâm sàng của bệnh nhân luôn tồn tại lượng lớn DNA tự do từ tế bào lympho và bạch cầu người bị phân hủy. Nếu không loại bỏ triệt để bằng DNase, các enzyme Polymerase sẽ khuếch đại không đặc hiệu DNA người thay vì cDNA của virus, làm giảm nghiêm trọng tỷ lệ đọc đặc hiệu (mapped reads) và gây lãng phí công suất giải trình tự.

Kết luận

Đề tài đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gene virus Dengue (4 serotype DENV 1–4) sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Oxford Nanopore MinION Mk1C. Nghiên cứu chứng minh rằng trên các mẫu huyết thanh có $Ct < 28$, quy trình khuếch đại amplicon dài $1 - 2\text{ kb}$ kết hợp thư viện Rapid Barcoding đạt độ phủ ngang từ $82.85%$ đến $95.95%$ trên $6/7$ mẫu thử nghiệm, với độ phủ sâu lên đến $20.525\times$.

Quy trình đã khắc phục được những hạn chế của các phương pháp giải trình tự truyền thống về thời gian xử lý, tính cơ động và chi phí thiết bị, mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong công tác giám sát dịch tễ học phân tử, chẩn đoán biến thể và nghiên cứu phát triển vaccine sốt xuất huyết tại Việt Nam.