Đặt vấn đề Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), sốt xuất huyết Dengue đang là mối lo ngại đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Báo cáo cho thấy số ca mắc đã tăng từ 500000 lên 5,2 triệu ca từ năm 2000 đến 2019 tại 80 quốc gia/ vùng lãnh thổ. Cũng theo Bộ Y tế, Việt Nam là quốc gia mà sốt xuất huyết lưu hành quanh năm, chỉ riêng từ tháng 1 đến tháng 8 năm 2023 ghi nhận có 66386 ca mắc và 14 ca tử vong tại Việt Nam. Dự kiến trong tương lai tỷ lệ người bệnh do virus Dengue gây ra sẽ còn tăng lên bởi ảnh hưởng của biến đổi khí hậu và quá trình đô thị hóa nhanh chóng.
Virus sốt xuất huyết (DENV) thuộc họ Flaviviridae, chi Flavivirus, lây truyền sang người bởi muỗi Aedes, chủ yếu là Aedes aegypti (Martina Byron và ctv, 2009). DENV được phân chia thành bốn type virus (DENV-1, DENV-2, DENV-3 và DENV-4) va mỗi type được phân chia thành các kiêu gene khác nhau (Yenamandra và ctv, 2021). DENV- 1 bao gồm năm kiểu gene (I, II, II, IV và V), DENV-2 được chia thành sáu kiểu gene (Asian I, Asian II, Cosmopolitan, American, American/Asian và Sylvatic), năm kiéu gene đã được xác định cho DENV-3 (I, II, III, IV và V) và bốn kiểu gene DENV-4 (L, IL, II, Sylvatic) (Dieng va ctv, 2021). Khi nhiễm một chủng DENV sẽ tạo ra kháng thé đối với type virus đó nhưng không có khả năng miễn dịch chống lại các type virus còn lại.
Vì vậy, những người sống trong vùng lưu hành dịch bệnh có thể nhiễm từ một đến cả bốn chủng DENV trong suốt cuộc đời (Gubler, 1998). Có thể thấy kiểu gene phân bồ rất đa dạng và việc xuất hiện biến thể mới là điều rất đễ xảy ra trong tương lai đới RNA virus, điều này làm cho việc phòng ngừa và điều trị trở nên phức tạp hơn. Mặt khác, đến thời điểm hiện tại vaccine phòng ngừa sốt xuất huyết Dengue chưa được công nhận và phố biến rộng rãi vì việc phát triển ra loại vaccine an toàn và hiệu quả đề có thể đáp ứng được với cả bốn chủng DENV vẫn còn là một thách thức rất lớn (Nemirov và ctv, 2023; Thomas, 2023). Vì vay, thực hiện giải trình tự gene virus gop phan phục vu cho việc giám sát dich té hoc, phát hiện sự biến đôi cấu trúc bộ gene từ đó giúp ích cho công trình nghiên cứu và sản xuất vaccine.
Giải trình tự thế hệ mới (NGS) là phương pháp dùng đề xác định trình tự DNA và RNA. Trong một lần thực hiện, NGS có thé phân tích lên đến hàng triệu đoạn gene hoặc toàn bộ bộ gene ở khoảng thời rất ngắn. Điều này giúp tối ưu hóa thời gian và chi phí thực hiện thí nghiệm so với công nghệ ra truyền thống Sanger (Qin, 2019). Mặc dù sở hữu hiệu suất cao nhưng NGS vẫn đảm bảo đữ liệu thu được là chính xác và tin cậy nhờ có hệ thống quản lý chất lượng Quality Control (QC).
QC cho phép kiểm soát từ bước chuẩn bị đầu vào, phân tích dit liệu đầu ra và cho đến kết quả cuối cùng (Nietsch va ctv, 2016). Đặc biệt, công nghệ giải trình tự Nanopore còn có những lợi thế vượt trội hơn vì đây công nghệ giải trình tự đoạn dài lên đến 4 Mb, điều này khắc phục được những khuyết điểm so với công nghệ giải trình tự đoạn ngắn. Hơn hết, thiết bị sử dụng cho công nghệ này rất nhỏ gọn nên có thê đễ đàng đi chuyển đến những vùng lưu hành dịch bệnh. Nhờ những ưu điểm trên nên mặc dù tôn tại nhiều thế hệ giải trình tự khác nhau nhưng NGS vẫn mang lại tiềm năng và giá trị rất lớn.
Mặt khác, hiện nay có rất ít nghiên cứu về trình tự bộ gene virus Dengue bằng công nghệ giải trình tự thé hệ mới tại Việt Nam. Vì thế, đề tài “Bước đầu xây dựng quy trình giải trình tự gene virus Dengue sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Nanopore” được thực hiện với mong muốn giải mã và phân tích bộ gene của các chủng virus Dengue nhằm cung cấp nguồn dit liệu cho việc phát triển vaccine phòng chống dịch bệnh sốt xuất huyết hiệu quả hơn. Mục tiêu đề tài Bước đầu xây dựng quy trình giải trình gene sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Nanopore dé thu được trên 80 % bộ gene virus Dengue (4 type huyết thanh) trên các mẫu có giá trị Ct < 28. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Kiểm tra mẫu huyết thanh đầu vào bằng phương pháp Realtime PCR.
Nội dung 2: Chuẩn bị thư viện và giải trình tự trên hệ thống Nanopore. Nội dung 3: Phân tích kết quả giải trình tự. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue 2.
Phân biệt sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue 2. Giới thiệu Sốt Dengue (SD) và sốt xuất huyết (SXHD) là bệnh truyền nhiễm do virus Dengue gây ra, DENV lây truyền sang cơ thé con người bởi vết muỗi đốt thong qua vật trung gian là muỗi Aedes, chủ yếu là Aedes aegypti và Aedes albopictus. Mặc dù nguyên nhân gây bệnh đều từ một loài virus và cùng con đường truyền bệnh nhưng SD và SXHD có những triệu chứng, biểu hiện va mức độ bệnh khác nhau (Gubler, 1998). Sốt Dengue Theo Gubler (1998) SD có một số đặc điểm đặc trưng như sau: Đối tượng nhiễm bệnh: Chủ yêu xảy ra ở trẻ lớn và người lớn.
Triệu chứng: Người bệnh thường sốt cao đột ngột khoảng từ 38°C đến 40°C, kéo dài từ 2 đến 7 ngày. Kèm theo một số các triệu chứng như nhức đầu vùng trán, đau hai hốc mắt, đau nhức cơ thể, đau họng nhẹ, buồn nôn, nôn mửa đau khớp, suy nhược va phát ban. Ngoài ra, người bệnh có thé gặp phải tình trạng chán ăn, thay đổi vị giác va các van đề về tiêu hóa. Một số biểu hiện xuất huyết từ mức độ nhẹ đến nặng như đốm xuất huyết trên da, chảy máu nướu, chảy máu cam, rong kinh và xuất huyết đường tiêu hóa.
Hai biểu hiện hiếm gặp phải là tiêu ra máu và vàng da. Các triệu chứng cho thấy xuất huyết không chỉ xuất hiện ở SXHD mà còn có ở SD. Xét nghiệm: Kết quả xét nghiệm cho thấy bạch cầu giảm, nồng độ men gan có thể tăng cao nhưng mức tăng thường nhẹ. Tinh trạng giảm tiêu cầu cũng có thé xảy ra ở bệnh nhân SD.
Mức độ bệnh: SD không khó để điều trị và hiếm khi gây tử vong. Người bệnh có thê điều trị ngoại trú hoặc theo dõi tại các cơ sở y tế. Tuy nhiên, giai đoạn cấp tính của bệnh diễn ra từ 3 đến 7 ngày nhưng giai đoạn phục hồi cơ thể có thể diễn ra đến hàng tuần và có thé dan đến suy nhược cơ thé, đặc biệt là ở người lớn. Sốt xuất huyết Dengue Theo Gubler (1998) SXHD có một số đặc điểm đặc trưng như sau: Đối tượng nhiễm bệnh: Chủ yếu xảy ra ở những trẻ em dưới 15 tuổi nhưng người lớn vẫn có thể mắc phải.
Triệu chứng: Người bệnh thường sốt cao đột ngột, kéo dài từ 2 đến 7 ngày. Một số dấu hiệu thường gặp như đốm xuất huyết phân tán ở nhiều nơi trên bề mặt da, có vết bam máu, chảy máu cam, chảy máu nướu răng, xuất huyết tiêu hóa và có thé tiêu ra máu. Giai đoạn đầu khó phân biệt với SD. Tuy nhiên, khi bước vào giai đoạn trở nặng, người bệnh có thê nôn ra máu, phân có màu den sam.
Trẻ em ở giai đoạn nguy hiểm thường buồn ngủ, xuất hiện đốm xuất huyết trên mặt và tím tái quanh miệng. Ngoài ra, người bệnh có thé bị giảm huyết áp, cảm giác lạnh khắp cơ thé, đồ nhiều mồ hôi, đây là dấu hiệu phổ biến cho thấy người bệnh có thé chuyên qua giai đoạn nặng hơn và có nguy cơ tử vong đo sốc sốt xuất huyết (SSXH). Xét nghiệm: Giống với SD, SXHD cũng làm giảm bạch cầu. Ngoài ra, xét nghiệm cho thay người bệnh bị giảm tiểu cầu và nồng độ máu, đây là dau hiệu cho thấy có sự rò rỉ mạch máu xảy ra phô biến ở SXHD giai đoạn đầu nhưng sẽ trở nặng và có thé chuyền qua giai đoạn SSXH.
Kết quả còn cho thấy thành mao mạch của bệnh nhân kém bền, đây là nguyên nhân gây ra sự xuất hiện 6 ạt của các đốm xuất huyết. Một biểu hiện phổ biến khác là kích thước gan to hơn bình thường và nồng độ men gan cũng tăng cao. Rò rỉ huyết tương cũng là nguyên nhân gây giảm huyết áp ở giai đoạn SSXH, kèm theo là tình trạng tràn dich màng phổi va tràn dịch mang bụng. Mức độ bệnh: Khi nhiễm SXHD bệnh nhân nên điều trị và theo dõi tích cực tại các cơ sở y tế.
Hầu hết các triệu chứng và biểu hiện ở bệnh nhân mắc SXHD giai đoạn nhẹ đều biến mắt ngay khi người bệnh hết sốt. Tuy nhiên, không nên chủ quan vì sốt giảm có thê kèm theo các dau hiệu như đồ nhiều mồ hôi, nhịp tim và huyết áp thay đôi, lạnh khắp cơ thể và sung huyết dưới da, đây là các triệu chứng khi người bệnh bị SSXH. Ở giai đoạn nặng này nếu không được điều trị hợp lý và kịp thời bệnh nhân có nguy cơ tử vong trong vòng 8 đến 24 giờ. Nhưng sẽ nhanh chóng phục hồi sau khi được xử lý và sử dụng thuốc chống sốc.
Sau khi vượt qua cơn sốc, người bệnh có thể phục hồi trong vòng 2 đến 3 ngày. Tình hình dịch bệnh 2. Tình hình thế giới và châu Á Theo tô chức Y tế thé giới (WHO), trong hai thập kỷ qua tỷ lệ mắc SXH ngày càng tăng rõ rệt. Đặc biệt, từ năm 2000 — 2019 ghi nhận số ca được báo cáo trên toàn thế giới 4 tăng gap 10 lần, từ 500000 lên 5,2 triệu.
Năm 2019 đánh dau một đỉnh cao chưa từng có, với các trường hợp được báo cáo lan rộng khắp 129 quốc gia. Sự gia tăng có biểu hiện suy giảm vào giai đoạn 2020 — 2022 do đại dịch Covid, tuy nhiên vào năm 2023 lại là một năm đại dịch SXH bùng nổ. Châu Phi nằm trong số 4 khu vực bị ảnh hưởng nhiều nhất. Năm 2023, có 171991 ca sốt xuất huyết được báo cáo ở các nước trong khu vực và 753 ca tử vong.
Có 15 trong số 47 quốc gia được ghi nhận bùng phát đại dịch. Quốc gia bị ảnh hưởng nặng né nhất trong khu vực vào năm 2023 là Burkina Faso với 688 trường hợp tử vong trong số các trường hợp nghi ngờ. 42 quốc gia và các vùng lãnh thé trong khu vực Châu Mỹ có tổng cộng 4,1 triệu ca nghi ngờ sốt xuất huyết (ty lệ mắc tích lũy là 419 ca trên 100000 dân), bao gồm 6710 ca nặng (0.