Khóa luận: Định lượng Saccharide trong sữa bằng HPAEC-PAD - Phan Thị Giang

Khóa luận trình bày phương pháp HPAEC-PAD xác định hàm lượng các saccharide phổ biến trong sản phẩm sữa. Quy trình phân tích và thẩm định chi tiết.

• Tác giả: Phan Thị Giang
• Người hướng dẫn: Tiến Sĩ Vũ Ngân Bình
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Xác Định Hàm Lượng Một Số Saccharide Trong Sản Phẩm Sữa Bằng Phương Pháp Sắc Ký Trao Đổi Anion Hiệu Năng Cao Kết Hợp Phát Hiện Ampe Kế Xung HPAEC-PAD
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về phương pháp HPAEC PAD

Phương pháp HPAEC-PAD (High-Performance Anion-Exchange Chromatography với Pulsed Amperometric Detection) là một kỹ thuật phân tích tiên tiến được sử dụng rộng rãi trong việc xác định saccharide trong sữa. Đây là sự kết hợp giữa sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao và đầu dò ampe kế xung, cho phép phát hiện và định lượng các loại đường như glucose, galactose, fructose, lactose, maltose và sacarose một cách chính xác và nhạy cảm. Phương pháp này có khả năng tách biệt các thành phần saccharide phức tạp mà các phương pháp truyền thống không thể đạt được. Ưu điểm nổi bật của HPAEC-PAD bao gồm độ phân giải cao, độ nhạy cảm tốt, và khả năng phân tích đồng thời nhiều loại đường trong một lần chạy.

1.1. Nguyên lý hoạt động của sắc ký trao đổi anion

Sắc ký trao đổi anion dựa trên nguyên lý tương tác tĩnh điện giữa các phân tử saccharide mang điện tích âm với các nhóm anion trên cột sắc ký. Các saccharide có các nhóm -OH tạo thành các anion trong môi trường kiềm, cho phép chúng gắn kết với pha tĩnh định. Bằng cách thay đổi nồng độ điện ly trong dung dịch lỏng, các saccharide khác nhau sẽ được giải phóng và tách riêng rẽ.

1.2. Nguyên lý hoạt động của đầu dò ampe kế xung PAD

Đầu dò ampe kế xung PAD phát hiện saccharide thông qua việc đo dòng điện phát sinh từ quá trình oxy hoá hoặc khử các phân tử đường tại bề mặt điện cực. Phương pháp xung giúp làm sạch bề mặt điện cực, tăng độ nhạy và độ ổn định của phép đo. Đây là một phương pháp phát hiện không phá huỷ và có độ nhạy cao.

II. Các saccharide quan trọng trong sữa

Sữa chứa một số loại saccharide quan trọng bao gồm glucose, galactose, fructose, lactose, maltose và sacarose. Trong đó, lactose (đường sữa) là saccharide chủ yếu, chiếm khoảng 4-5% khối lượng sữa. Glucose và galactose là sản phẩm phân hủy của lactose. Fructose có thể xuất hiện tự nhiên ở nồng độ thấp. Maltose và sacarose có thể được thêm vào trong các sản phẩm sữa chế biến. Việc xác định hàm lượng saccharide trong sữa là rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng, hương vị và khả năng tiêu hóa của sản phẩm. Phương pháp HPAEC-PAD cho phép phân tích đồng thời nhiều loại đường này một cách hiệu quả.

2.1. Lactose saccharide chủ yếu trong sữa

Lactose là một disaccharide được tổng hợp trong tuyến sữa, cấu tạo từ glucose và galactose. Đây là saccharide chính trong sữa bò, chiếm tỷ lệ cao nhất. Lactose có vai trò quan trọng trong cung cấp năng lượng cho trẻ sơ sinh và hỗ trợ hấp thụ canxi. Việc xác định chính xác hàm lượng lactose bằng HPAEC-PAD là yêu cầu thiết yếu.

2.2. Glucose galactose và các monosaccharide khác

Glucose, galactose và fructose là các monosaccharide có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng. Chúng được sinh ra từ việc phân hủy lactose hoặc có thể được thêm vào trong quá trình chế biến. Maltose và sacarose cũng có thể xuất hiện trong sữa bổ sung. Phương pháp HPAEC-PAD giúp định lượng tất cả các loại đường này với độ chính xác cao.

III. Quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp

Quá trình xây dựng phương pháp HPAEC-PAD để xác định saccharide trong sữa bao gồm nhiều bước quan trọng. Trước tiên, cần khảo sát các điều kiện sắc ký như thành phần dung dịch điện ly, pH, tốc độ dòng chảy, và nhiệt độ cột. Sau đó, cần tối ưu hoá quy trình xử lý mẫu để loại bỏ các chất can nhiễu và tối đa hóa hiệu suất trích chiết. Tiếp theo, phương pháp phải được thẩm định theo các tiêu chuẩn quốc tế (AOAC, TCVN) bao gồm đánh giá độ thích hợp hệ thống, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ thu hồi, độ lặp lại, và độ chính xác. Các tham số thẩm định này đảm bảo rằng phương pháp có độ tin cậy cao và có thể ứng dụng trong thực tế.

3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu

Khảo sát điều kiện sắc ký là bước đầu tiên trong xây dựng phương pháp. Cần xác định loại cột sắc ký phù hợp, thành phần dung dịch điện ly (gradient), pH môi trường, tốc độ dòng, và nhiệt độ vận hành. Các điều kiện này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tách biệt các saccharide và chất lượng của phép phân tích.

3.2. Xử lý mẫu và thẩm định phương pháp

Xử lý mẫu liên quan đến các bước làm loãng, lọc và sơ chế mẫu sữa để loại bỏ protein và chất béo. Thẩm định phương pháp bao gồm kiểm tra độ thích hợp hệ thống, LOD, LOQ, độ thu hồi, độ lặp lại và tuyến tính. Những tiêu chuẩn này đảm bảo tính khả thi và độ tin cậy của phương pháp.

IV. Ứng dụng và ý nghĩa trong kiểm quản chất lượng sữa

Phương pháp HPAEC-PAD xác định saccharide trong sữa có ứng dụng rộng rãi trong kiểm quản chất lượng sản phẩm sữa. Nó giúp xác minh thành phần đúng như khai báo trên nhãn sản phẩm, phát hiện các vi phạm về pha trộn hoặc tẩm bột, và đảm bảo tính an toàn thực phẩm. Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong kiểm phát các sản phẩm sữa bổ sung chứa các loại đường khác nhau. Ngoài ra, xác định hàm lượng saccharide chính xác cũng cần thiết để kiểm soát quá trình sản xuất, đánh giá giá trị dinh dưỡng, và nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nhiệt tới thành phần đường trong sữa. Sự kết hợp giữa độ nhạy cảm cao và khả năng phân tích đồng thời của HPAEC-PAD làm cho nó trở thành một công cụ quan trọng trong lĩnh vực kiểm nghiệm thực phẩm.

4.1. Ứng dụng trong kiểm quản chất lượng sản phẩm sữa

HPAEC-PAD được sử dụng để kiểm quản chất lượng sữa tươi, sữa tráng, sữa bột, và các sản phẩm sữa bổ sung. Phương pháp này giúp xác minh tính toàn vẹn sản phẩm, phát hiện pha trộn trái phép, và đảm bảo tuân thủ tiêu chuẩn chất lượng quốc gia.

4.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu và phát triển sản phẩm

Phương pháp xác định saccharide bằng HPAEC-PAD hỗ trợ nhà sản xuất trong phát triển sản phẩm mới, tối ưu hoá công thức, và nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện xử lý tới thành phần đường. Điều này giúp cải thiện chất lượng, hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm sữa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1. Lịch sử ra đời Đường tự nhiên trong thực phẩm, chủ yếu là monosaccharid (glucose, fructose, galactose) và disaccharid (sacarose, lactose, maltose), đã xuất hiện trong khẩu phần ăn của con người từ hàng nghìn năm qua thông qua việc tiêu thụ các thực phẩm như mật ong, trái cây, sữa, ngũ cốc. Tuy nhiên, các nghiên cứu có hệ thống và khoa học về các loại đường này chỉ bắt đầu được tiến hành từ cuối thế kỷ 18 đầu thế kỷ 19 [9][10].

Glucose lần đầu được nhà hóa học người Đức Andreas Marggraf chiết xuất từ nho khô vào năm 1747, đánh dấu bước khởi đầu cho việc phân lập carbohydrate từ thực phẩm tự nhiên [11]. Tên gọi “glucose” sau đó được nhà hóa học người Pháp Jean-Baptiste Dumas chính thức đặt ra vào năm 1838 [12]. Fructose được Augustin- Pierre Dubrunfaut phân lập từ mật ong vào năm 1847 [13]. Sacarose là loại đường đã được người Ấn Độ cổ đại sử dụng từ hơn 2.000 năm TCN dưới dạng đường từ mía.

Tuy nhiên, mãi đến đầu thế kỷ 19, các nhà hóa học như William Prout và các đồng nghiệp ở Châu Âu mới xác định chính xác công thức hóa học của nó [14], mở đường cho việc chiết xuất và tinh chế đường từ mía và củ cải đường trên quy mô công nghiệp. Lactose, một loại disaccharid đặc trưng trong sữa, được Carl Wilhelm Scheele phát hiện vào khoảng năm 1780 với tên gọi ban đầu là “đường sữa”. Thành phần chính tạo nên lactose là glucose và galactose. Đến năm 1856, Louis Pasteur đã xác định được galactose như một monosaccharid riêng biệt [15].

Maltose, hay còn gọi là đường mạch nha, được tạo thành trong quá trình thủy phân tinh bột từ hạt nảy mầm. Vào năm 1872, Dubrunfaut lần đầu mô tả loại đường này, và ngay sau đó, nhà hóa học Cornelius O’Sullivan xác nhận cấu trúc maltose như là một disaccharid gồm hai phân tử glucose liên kết bằng liên kết α(1→4) [16]. Galactose tự do trong thực phẩm khá hiếm gặp, chủ yếu tồn tại như một phần của lactose hoặc các polysaccharid phức tạp. Cuối thế kỷ 19, Emil Fischer và Robert Morrell đã xác định cấu hình phân tử của galactose, từ đó thúc đẩy các nghiên cứu về rối loạn chuyển hóa như galactosemia – một bệnh lý di truyền nguy hiểm liên quan đến việc tích tụ galactose trong cơ thể do thiếu hụt enzym [17].

Những nghiên cứu ban đầu này đã đặt nền móng cho việc tìm hiểu vai trò và ứng dụng các loại đường tự nhiên trong công nghệ thực phẩm, y dược và nhiều lĩnh vực công nghiệp khác. Việc xác định cấu trúc, tính chất và nguồn gốc tự nhiên của từng 3 loại đường này không chỉ giúp làm sáng tỏ vai trò sinh học và chuyển hóa của chúng trong cơ thể người, mà còn mở rộng hiểu biết về mối liên hệ giữa đường và sức khỏe. Tên gọi, công thức hóa học, công thức cấu tạo và phân loại Tên gọi, công thức hoá học, công thức cấu tạo và phân loại của glucose, galactose, fructose, sacarose, lactose và maltose được thể hiện trong bảng 1. Tên gọi, công thức hoá học, công thức cấu tạo của glucose, galactose, fructose, sacarose, lactose và maltose STT Tên gọi CTHH CTCT Phân loại Glucose (3 R , 4 S , 5 S , 6 R )- 1 6- C6H12O6 Monosaccharid (hydroxymethyl)oxan e-2,3,4,5-tetrol Fructose (3 S , 4 R , 5 R )-2- 2 C6H12O6 Monosaccharid (hydroxymethyl)oxan e-2,3,4,5-tetrol Galactose (3 R , 4 S , 5 R , 3 6 R )-6- C6H12O6 Monosaccharid (hydroxymethyl)oxan e-2,3,4,5-tetrol Sacarose (2 R , 3 R , 4 S , 5 S , 6 R )-2-[(2 S , 3 S , 4 4 S , 5 R )-3,4- C12H22O11 Disaccharid dihydroxy-2,5- bis(hydroxymethyl)ox olan-2-yl]oxy-6- 4 (hydroxymethyl)oxan -3,4,5-triol Lactose (2 R , 3 R , 4 R , 5 R )-2,3,5,6- tetrahydroxy-4-[(2 S , 5 C12H22O11 Disaccharid 3 R , 4 S , 5 R , 6 R )- 3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymethyl)oxan -2-yl]oxyhexanal Maltose (2 R , 3 S , 4 S , 5 R , 6 R )-2- (hydroxymethyl)-6- [(2 R , 3 S , 4 R , 6 C12H22O11 Disaccharid 5 R )-4,5,6- trihydroxy-2- (hydroxymethyl)oxan -3-yl]oxyoxan-3,4,5- triol.

Tính chất vật lý, hóa học Tính chất vật lý, hóa học của glucose, galactose, fructose, sacarose, lactose và maltose được thể hiện trong bảng 1. Tính chất vật lý, hóa học cơ bản của glucose, galactose, fructose, sacarose, lactose và maltose Galactose Glucose Fructose Sacarose Lactose Maltose Khả Có (đường Có (đường Có (đường Có (đường Có (đường năng Không khử) khử) khử) khử) khử) khử KLPT 180 180 180 342 342 342 Tinh thể Tinh thể Tinh thể Tinh thể Tinh thể Tinh thể không màu không màu không màu không màu không màu không màu hoặc dưới hoặc dưới hoặc dưới hoặc dưới hoặc dưới hoặc dưới Cảm dạng bột dạng bột dạng bột dạng bột dạng bột dạng bột kết quan kết tinh kết tinh kết tinh kết tinh kết tinh tinh trắng, trắng, trắng, trắng, trắng, trắng, không mùi, không mùi, không mùi, không mùi, không mùi, không mùi, vị ngọt. [α]ᴰ²⁰ +80,2° +52,7° –92,4° +66,5° +52,3° +140,7° Dễ tan Dễ tan trong nước, Tan tốt trong nước, Dễ tan ít tan trong trong nước, methanol, ít trong nước, Dễ tan trong etanol, ít tan trong Tính Tan tốt tan trong ít tan trong nước, rất ít không tan ethanol, tan trong nước. ethanol ; ethanol, tan trong trong không tan không tan không tan ethanol.

aceton, trong dietyl trong dietyl trong ether. Ổn định ở Ổn định ở Ổn định ở Ổn định ở nhiệt độ Ổn định ở nhiệt độ điều kiện Kém ổn pH trung thường, bị nhiệt độ thường, dễ thường, dễ định hơn tính, dễ bị thủy phân thường; bị Độ ổn phân hủy oxy hóa glucose, dễ thủy phân bởi enzym thủy phân định trong môi trong môi bị phân hủy bởi acid lactase bởi enzym trường acid/ trường ở pH thấp. hoặc hoặc môi hoặc môi kiềm kiềm. trường trường acid.

Vai trò của 6 loại đường phổ biến: glucose, galactose, fructose, sacarose, lactose và maltose. Đường đóng một vai trò quan trọng trọng đối với cơ thể. Không chỉ là nguồn cung cấp năng lượng nhanh chóng, góp phần cải thiện tình trạng dinh dưỡng tổng thể, đường tham gia vào nhiều vai trò sinh học và dinh dưỡng quan trọng khác. Tuy nhiên, khi tiêu thụ quá mức hoặc không hợp lý, đường có thể là yếu tố góp phần vào nguy cơ phát triển các bệnh lý như sâu răng, béo phì, bệnh tim mạch và tiểu đường [1].

Tổ chức y tế thế giới khuyến nghị nên hạn chế lượng đường tự do tiêu thụ xuống dưới 10% tổng 6 năng lượng hàng ngày để tạo nên một chế độ ăn lành mạnh. Việc giảm lượng đường xuống dưới 5% tổng năng lượng tiêu thụ sẽ mang lại nhiều lợi ích sức khỏe hơn [18]. Vai trò cụ thể của mỗi đường trong 6 loại đường như sau: Glucose: Đường glucose tự do thường có một lượng rất nhỏ trong rau và hoa quả. Dù không xuất hiện nhiều trong tự nhiên nhưng lại được sản xuất rất nhiều trong thương mại và công nghiệp thực phẩm từ các thức ăn có nhiều tinh bột.

Trong quá trình chuyển hóa năng lượng, glucose là nguồn năng lượng quan trọng nhất trong tất cả các sinh vật. Glucose lưu thông trong máu dưới dạng đường huyết. Nồng độ glucose máu lúc đói của người bình thường từ 70 mg/dL (3,9 mmol/L) đến 100 mg/dL (5,6 mmol/L) [19]. Glucose là nguồn cung cấp chính năng lượng cho hệ thống thần kinh trung ương, người ta thấy hệ thống thần kinh trung ương sử dụng sử dụng xấp xỉ 5,6 mg glucose trên 100 g mô não người mỗi phút [20].

Tuy nhiên, việc tiêu thụ quá mức glucose có liên quan đến tình trạng kháng insulin, làm tăng nguy cơ mắc bệnh đái tháo đường type 2 và các biến chứng liên quan như bệnh tim mạch [21]. Fructose: Fructose là một monosaccharid tự nhiên thường được tìm thấy trong trái cây và mật ong. Đây là một trong ba loại monosaccharid trong chế độ ăn uống, cùng với glucose và galactose, được hấp thụ trực tiếp từ ruột vào tĩnh mạch cửa trong quá trình tiêu hóa. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng chế độ ăn giàu fructose có thể làm thay đổi thành phần của hệ vi sinh vật, làm mất cân bằng vi khuẩn có lợi, từ đó ảnh hưởng đến chức năng hàng rào ruột và gây viêm [22].

Tiêu thụ fructose cao liên quan đến sự phát triển của bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu, tăng mỡ nội tạng, kháng insulin và tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Fructose cũng làm tăng sản xuất uric acid, góp phần vào viêm và tổn thương tế bào [23] [24]. Galactose: Là một monosaccharid có trong sữa và các sản phẩm từ sữa. Trong cơ thể, galactose được chuyển hóa và sử dụng làm nguồn năng lượng.

Ngoài ra, galactose là thành phần chính của galactosylceramid – một glycosphingolipid quan trọng trong myelin, lớp vỏ bao quanh sợi thần kinh [25]. Tuy nhiên, ở những người mắc rối loạn chuyển hóa galactose, việc tích tụ galactose trong cơ thể có thể dẫn đến tổn thương gan, đục thủy tinh thể và suy giảm chức năng thần kinh [26]. Sacarose: Là một disaccharid cấu thành từ hai monosaccharid: glucose và fructose, thường được chiết xuất từ cây mía và củ cải đường. Sacarose rất cần thiết cho dinh dưỡng của con người vì nó cung cấp nguồn năng lượng nhanh chóng và góp phần tạo nên hương vị cảm quan của nhiều loại thực phẩm.

Tuy nhiên, lượng tiêu thụ sacarose phải được cân bằng, vì lượng tiêu thụ quá nhiều có thể dẫn đến các vấn đề sức khỏe như béo phì và sâu răng [1]. 7 Lactose: Thường được gọi là đường sữa, là một loại disaccharid có trong sữa của động vật có vú, cấu trúc bao gồm 2 phân tử glucose và galactose liên kết với nhau. Lactose không chỉ có trong sữa mà còn có trong nhiều sản phẩm từ sữa như pho mát, bơ và sữa chua. Một số người thiếu hụt lactase, enzym phân hủy lactose có thể dẫn đến các triệu chứng như đau bụng, đầy hơi và tiêu chảy sau khi tiêu thụ các sản phẩm từ sữa, tình trạng này được gọi là không dung nạp lactose [27].

Maltose: Thường được gọi là đường mạch nha, là một disaccharid bao gồm hai phân tử glucose được nối với nhau bằng liên kết glycosid α(1→4). Đường này là chất trung gian quan trọng trong quá trình tiêu hóa tinh bột và cũng được tìm thấy trong hạt nảy mầm, chẳng hạn như lúa mạch, vì chúng phân hủy tinh bột dự trữ thành đường cho cây đang phát triển, nên nó được gọi là đường mạch nha. Trong hệ tiêu hóa của con người, maltose được phân giải bởi enzym maltase thành hai phân tử glucose, sau đó được hấp thụ vào máu và sử dụng làm nguồn năng lượng [28]. Mặc dù ít được nghiên cứu hơn, nhưng maltose khi tiêu thụ quá mức cũng có thể góp phần vào tăng đường huyết [29].