Luận văn: Xác định loài tre (Bambusa) biến đổi hình thái bằng phân tích ADN

Nghiên cứu xác định các loài tre thuộc chi Bambusa ở Việt Nam bằng kỹ thuật phân tích ADN. Luận văn giải quyết vấn đề phân loại do biến đổi hình thái.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thúy Hằng
• Người hướng dẫn: Đinh Thị Phòng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Xác định tên một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) do biến đổi hình thái ở Việt Nam bằng kỹ thuật phân tích ADN
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về loài tre Bambusa và tầm quan trọng của xác định loài

Tre Bambusa là một trong những loài thực vật quan trọng ở Việt Nam, có giá trị kinh tế, sinh thái và văn hóa cao. Tuy nhiên, xác định loài tre Bambusa truyền thống gặp nhiều khó khăn do sự biến đổi hình thái giữa các loài khác nhau. Đặc biệt, các loài như tre Bụng phật (Bambusa vulgaris), tre Vàng sọc và tre Đùi gà thường có những đặc điểm hình thái không rõ ràng khi chịu tác động của điều kiện sống khác nhau. Vì vậy, kỹ thuật phân tích ADN đã trở thành phương pháp hiệu quả để xác định chính xác danh pháp các loài tre, vượt qua hạn chế của phương pháp hình thái học truyền thống.

1.1. Đặc điểm sinh học chính của chi Bambusa

Chi Bambusa Schreb. thuộc họ Poaceae, được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Các loài tre trong chi này có cấu trúc hình thái đa dạng với những biến dạng rõ nét ở thân, nhánh và lá tùy theo điều kiện sinh thái. Tre Bụng phật và tre Đùi gà là những ví dụ điển hình cho hiện tượng này, khi chúng có thể biến đổi thành nhiều dạng khác nhau trong cùng một môi trường.

1.2. Tầm quan trọng của xác định chính xác loài tre

Xác định loài tre chính xác có ý nghĩa quan trọng trong bảo tồn, phát triển bền vững và ứng dụng thực tiễn. Sự nhầm lẫn giữa các loài có thể dẫn đến sử dụng sai loài, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và hiệu quả bảo tồn đa dạng sinh học của các loài tre quý hiếm.

II. Phương pháp hình thái học và những hạn chế trong phân loại tre

Phương pháp hình thái học truyền thống đã được sử dụng lâu đời để phân loại thực vật, bao gồm việc quan sát các đặc điểm về hình dạng thân, lá, nhánh, hoa và quả. Tuy nhiên, trong trường hợp của tre Bambusa, phương pháp này gặp phải những khó khăn đáng kể. Sự biến đổi hình thái do điều kiện sống khác nhau làm cho các loài tre trông rất khác nhau dù chúng cùng một loài, hoặc ngược lại, các loài khác nhau lại có những đặc điểm hình thái rất giống nhau. Các nhân viên phân loại có thể nhầm lẫn giữa tre Bụng phật dạng lóng thẳng với tre Bụng phật dạng lóng phồng, hoặc giữa tre Đùi gà với các loài Bambusa khác.

2.1. Các giới hạn của phân loại hình thái học

Phương pháp hình thái học chỉ dựa trên các đặc điểm ngoại hình, không có khả năng phân biệt ở cấp độ di truyền. Điều này đặc biệt problematic với tre vì biến đổi hình thái có thể xảy ra trong cùng một loài tùy theo độ ẩm, ánh sáng và dinh dưỡng.

2.2. Nhu cầu phát triển phương pháp phân loại hiện đại

Để khắc phục hạn chế của phương pháp truyền thống, phương pháp phân loại phân tử dựa trên phân tích ADN đã được phát triển. Phương pháp này cho phép xác định chính xác loài dựa trên các đặc điểm di truyền, độc lập với biến đổi hình thái môi trường.

III. Kỹ thuật phân tích ADN trong xác định loài tre Bambusa

Kỹ thuật phân tích ADN là phương pháp hiện đại để xác định loài thực vật dựa trên phân tích trình tự nucleotide. Trong nghiên cứu xác định loài tre Bambusa, các nhà khoa học sử dụng bốn vùng gen quan trọng bao gồm: gen PIF (vùng gen nhân), và ba vùng gen lục lạp là psbA-trnH, matK, và trnL-trnF. Quy trình thực hiện gồm: tách chiết và tinh sạch ADN tổng số từ mẫu mô tre, thiết kế cặp mồi đặc hiệu, thực hiện kỹ thuật PCR để nhân bản các đoạn gen đích, điện di gel để phân tích sản phẩm, rồi giải mã trình tự nucleotide để so sánh với dữ liệu công bố trên Genbank.

3.1. Các vùng gen sử dụng trong phân tích

Gen PIF nằm trong vùng gen nhân, có độ đa hình cao giúp phân biệt các loài khác nhau. Gen psbA-trnH (vùng lục lạp) là barcode DNA phổ biến nhất. Gen matK cung cấp thông tin di truyền quan trọng, còn vùng trnL-trnF có tính bảo thủ thích hợp cho phân tích tiến hóa.

3.2. Quy trình thực hiện phân tích ADN

Quy trình bắt đầu bằng tách chiết ADN từ mô tươi của tre, sau đó dùng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản gen đích. Sản phẩm PCR được điện di để xác nhận kích thước đoạn gen, tiếp theo là giải mã trình tự nucleotide bằng sequencing, cuối cùng so sánh với các trình tự công bố để xác định loài.

IV. Ứng dụng và kết quả nghiên cứu xác định loài tre Bambusa

Thông qua phân tích ADN các vùng gen, nghiên cứu đã thành công trong việc xác định chính xác danh pháp của loài tre Bụng phật, tre Vàng sọc và tre Đùi gà. Kết quả cho thấy mức độ tương đồng nucleotide cao giữa các mẫu cùng loài, xác nhận chúng thuộc cùng một loài mặc dù có biến đổi hình thái rõ rệt. So sánh với dữ liệu trên Genbank, tre Bụng phật được xác nhận là Bambusa vulgaris, trong khi tre Đùi gà tương đồng cao với Bambusa ventricosa và Bambusa tuldoides. Những phát hiện này không chỉ giúp cải chính các lỗi trong phân loại truyền thống mà còn cung cấp cơ sở di truyền cho các chương trình bảo tồn và phát triển bền vững tre ở Việt Nam.

4.1. Kết quả xác định các loài tre chính

Nghiên cứu đã xác định chính xác ba loài tre chính bằng phân tích ADN. Tre Bụng phật (Bambusa vulgaris) được xác nhận qua sự tương đồng cao ở cả bốn vùng gen. Tre Đùi gà cho thấy tương đồng cao với B. ventricosa và B. tuldoides, giúp làm rõ các quan hệ phân loại trước đây còn không rõ.

4.2. Ứng dụng thực tiễn và hướng phát triển

Phương pháp phân tích ADN có thể ứng dụng trong chương trình bảo tồn, nhân giống tre quý hiếm và phát triển bền vững. Kỹ thuật barcode DNA từ vùng gen psbA-trnH có thể được sử dụng để kiểm tra nhanh danh pháp tre, hỗ trợ các cơ sở lâm nghiệp và bảo tồn đa dạng sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Từ bao đời nay cây tre là hình ảnh rất quen thuộc trong tâm trí của người Việt Nam. Tre có mặt hầu khắp các nẻo đường đất nước và gắn bó với cộng đồng dân tộc Việt Nam. Đặc biệt trong tâm thức người Việt, cây tre chiếm vị trí sâu sắc và lâu bền hơn cả và được xem như là biểu tượng của con người Việt Nam. Tre là loại cây dễ trồng, sinh trưởng nhanh, sớm khai thác, dễ chế biến và có nhiều đặc tính phù hợp với các mục đích sử dụng khác nhau.

Tre trúc phân bố ở nhiều châu lục, trừ châu Âu. Châu Á là nơi có số lượng loài nhiều nhất với 65 chi và 900 loài. Việt Nam nằm ở vùng nhiệt đới châu Á, với 25 chi và 216 loài trong đó chi tre (Bambusa Schreb.) có 67 loài [51], có thể nói tre ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng. Những nghiên cứu về tre đã được bắt đầu từ lâu nhưng việc phân loại và định loại tên loài cho chi tre vẫn chưa thống nhất giữa các tác giả vì phương pháp áp dụng chủ yếu dựa trên phương pháp hình thái.

Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi mẫu vật phải có đầy đủ các đặc điểm phân loại, đặc biệt là cơ quan sinh sản mà đối với tre thì các mẫu vật chỉ có cơ quan dinh dưỡng, hầu hết không có đặc điểm về cơ quan sinh sản (hoa và quả) vì chu kỳ ra hoa tới vài chục năm, nếu ra hoa thì thường chỉ một lần rồi chết vì vậy việc phân loại bằng phương pháp này gặp khó khăn. Hơn nữa, trong một số trường hợp phương pháp phân loại bằng hình thái khó thực hiện hoặc dễ bị nhầm lẫn do mẫu không còn nguyên vẹn hoặc bị biến đổi trong những điều kiện sinh thái khác nhau. Hai loài tre Bụng phật (Bambusa vulgaris Schr.cv Wamin McClure) và tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris Schr.cv Vittata McClure) có chung tên khoa học là Bambusa vulgaris [15], bởi sự giống nhau cơ bản ở nhiều đặc điểm hình thái, nhưng là các thứ trồng khác nhau nên giữa hai loài có một số đặc điểm khác nhau như: chiều cao thân khí sinh (13-15 m đối với tre Vàng sọc, 4 – 6 m đối với tre Bụng phật), độ dài lóng thân (tre Vàng sọc dài 20 – 30 cm, tre Bụng phật dài 4 – 10 cm), tre Bụng phật có dạng lóng phồng, lóng thẳng và lóng phồng thẳng (½ thân phía dưới phồng, ½ thân phía trên thẳng), còn tre Vàng sọc thì chỉ có dạng lóng thẳng và tròn đều. Theo các tác giả Nguyễn Khắc Khôi (2007), Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) [15, 51] đều đồng ý các dạng này chỉ là biến thể của một loài dựa trên 1 một số đặc điểm hình thái nhưng vẫn thiếu tính xác thực vì không có cơ quan sinh sản.

Tương tự, đối với tre Đùi gà theo Lê Nguyên (1971), Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) [16, 51] cho rằng tre Đùi gà có tên khoa học là Bambusa ventricosa McClure nhưng Nguyễn Khắc Khôi (2007), Vũ Văn Dũng (2000), Dransfield và Widjaja (1995) [15, 4, 34] cho rằng tre Đùi gà là sự biến danh của loài Bambusa tuldoides (tên Việt Nam là Hóp nhỏ). Khó khăn này không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả trên thế giới. Vì vậy việc định loại tên loài ở chi tre vẫn còn rất nan giải, cần có sự hỗ trợ của kỹ thuật phân tích ADN. Phương pháp phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) là phương pháp phân loại chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích ADN và đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật.

So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị ADN cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường. Đối với thực vật, hai nhóm gen chính thường được sử dụng là vùng gen nhân và hệ gen lục lạp (cpADN) là những gen rất bao thủ trong tiến hóa. Hiện nay, trong cơ sở dữ liệu ngân hàng gen (Genbank, 2012) đã lưu giữ 16542 trình tự nucleotide cho phân loại Họ phụ tre (Bambuso ideae), trong đó có 607 trình tự nucleotide cho chi Bambusa Schreb. trong số này rất nhiều loài cũng cớ ở Việt Nam.

Đây là nguồn dữ liệu có giá trị để chúng ta có thể khai thác và ứng dụng cho nghiên cứu này. Đến nay, ở Việt Nam có khá nhiều công trình công bố về hiệu quả của việc giải trình tự một số vùng gen giúp cho việc định loại tên loài ở nhiều đối tượng sinh vật [12, 22, 25], nhưng đối với các loài tre mới chỉ có Nguyễn Minh Tâm (2006) [21] đã sử dụng một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam. Mặc dù các kết quả thu nhận chưa được nhiều nhưng cũng là cơ sở để ứng dụng phương 1 pháp phân tích ADN góp phần làm sáng tỏ tên khoa học cho một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) do có sự biến đổi hình thái ở Việt Nam. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định tên một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) do biến đổi hình thái ở Việt Nam bằng kỹ thuật phân tích ADN”.

Với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau: - Giải trình tự nucleotide 01 vùng gen nhân (PIF) và 03 vùng gen lục lạp (trnL-trnF, psbA-trnH và matK) cho 19 mẫu của ba loài tre Bụng phật (Bambusa vulgaris Schr. cv Wamin McClure), tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris Schr. cv Vittata McClure) và tre Đùi gà (Bambusa ventricosa McClure ) có sư biến đổi hình thái ở Việt Nam. - Các dạng biến đổi hình thái giữa các mẫu trong loài có phải là của cùng một loài tre Bụng phật hoặc tre Vàng sọc hoặc tre Đùi gà không ? - Tre Bụng phật và tre Vàng sọc có phải là cùng loài B.

vulgaris ? - Tre Đùi gà (B. ventricosa) có phải là sự biến danh của loài Hóp nhỏ (B. tuldoides) hay không ? 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu tổng quát về một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.

Vị trí phân loại của chi Bambusa Schreb. Cây tre được phân bố rộng rãi trên nhiều vùng ở nước ta. Tre rất quen thuộc đối với người Việt Nam vì tre được sử dụng rất nhiều trong tất cả các lĩnh vực liên quan đến đời sống như nông nghiệp, công nghiệp, ngư nghiệp, thủ công mỹ nghệ… Theo phân loại cổ điển, tre thuộc: Giới (regnum) : Plantae Ngành (division) : Magnoliophyta Lớp (classic) : Liliopsida Bộ (ordo) : Poales Họ (familia) : Poaceae Chi ( genus) : Bambusa Schreb. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị sử dụng một số loài tre Các loài tre rất phong phú, đa dạng, dễ trồng, sinh trưởng nhanh, sớm cho khai thác, dễ chế biến nên được sử dụng cho rất nhiều mục đích khác nhau.

Tre có thân cứng như gỗ song có đặc trưng là thân thường rỗng trong ruột, có hệ thống thân ngầm và phân cành khá phức tạp, có hệ thống mo thân hoàn hảo, được sử dụng hiệu quả trong quá trình phân loại [17]. Tre có ba kiểu thân ngầm chính là thân ngầm mọc cụm, thân ngầm mọc rải và thân ngầm kiểu hỗn hợp. Trong khi thân ngầm của tre thường nằm dưới mặt đất thì thân khí sinh lại sinh trưởng ở phần không gian phía trên mặt đất. Tre có hai loại lá có chức năng khác nhau.

Loại thứ nhất làm nhiệm vụ bảo vệ măng, thân cây non là mo thân. Loại thứ hai làm nhiệm vụ quang hợp tổng hợp vật chất nuôi cây gọi là lá quang hợp. Mo thân có hình vảy, có các bộ phận bẹ mo, phiến mo, tai mo và lưỡi mo. Khi tre trưởng thành thì mo thân tự bóc và chết.

Lá quang hợp có màu xanh, gồm phiến lá, bẹ lá, cuống lá, lưỡi lá và tai lá. Các loài tre còn có hoa và quả, tuy nhiên sau khi tre ra hoa hàng loạt thường chết hoặc chu kỳ ra hoa rất dài [16]. Sau đây là những đặc điểm sinh học chính và giá trị sử dụng của ba loài tre đang nghiên cứu: 1 1. Tre Bụng phật Tên khoa học: Bambusa vulgaris Schr.cv Wamin McClure Tên khác: Bambusa wanin Camus Thân ngầm: mọc cụm thưa, cây cách nhau 10 – 20cm.

Thân khí sinh: cao 4 – 6m, đường kính thay đổi từ gốc lên ngọn. Phần dưới thân thẳng hoặc cong, phần ngọn uốn cong. Lóng dài khoảng 4 – 10cm, màu xanh thẫm, sáng bóng, các lóng phía dưới thường phình to, phần phình to có 2 dạng: phần gốc có đường kính lớn nhất (10 – 12cm), dài 5 – 10cm, phình to đều; phần trên đến giữa thân đường kính nhỏ dần (5 – 7cm), chỉ phình to ở dưới, ở trên thót dần hình chiếc bình (như tre đùi gà); phần thân trên các lóng thẳng và nhỏ hơn, đường kính khoảng 4 – 5cm. Một số vòng thân (khoảng 3 – 4) sát mặt đất có vòng rễ khí sinh nhỏ.

Vách thân dày 1,2 – 1,75cm. Tuy nhiên mỗi cụm tre vẫn có một vài thân hoàn toàn có lóng thẳng từ gốc trở lên (chiếm 5 – 10%) phân cành khoảng giữa thân, có một cành to và nhiều cành nhỏ ở mỗi đốt. Mo thân: bẹ mo hình thang, mặt ngoài phủ lông mềm, màu hung. Phiến mo và bẹ mo làm thành một mặt phẳng, mặt trong và ngoài phủ lông cứng màu đen.

Tai mo rộng 2,5cm, cao 1cm, mép có một hàng lông tua, dài 1mm. Thìa lìa cao 1mm. Lá: Phiến lá hình lưỡi mác hay ngọn giáo, dài 24 – 26,5cm, rộng 2,2 – 3cm, gốc gần tròn, đỉnh nhọn, có 6 đôi gân, 2 mép có răng cưa nhỏ và sắc. Thìa lìa cao 1mm.

Phân bố: Nhiều nơi trong nước và thế giới. Giá trị: Cây có dáng đẹp, lóng có hình dạng đặc biệt, thân có thể uốn thành các hình dạng con vật và tạo cảnh theo ý muốn. Vì vậy, thường được trồng làm cảnh trong công viên, vườn nhà. Đôi khi dùng thân làm đồ thủ công mỹ nghệ.

Loài tre Bụng phật dạng lóng thẳng (Bambusa vulgaris) số hiệu K. Loài tre Bụng phật dạng lóng phồng (Bambusa vulgaris) số hiệu K. Tre Vàng sọc Tên khoa học: Bambusa vulgaris Schr. cvVittata McClure (1961) Thân ngầm: Mọc cụm thưa, cây cách nhau 20 – 30cm.

Thân khí sinh: Cao 8 – 15m, đường kính 8 – 12cm, phần dưới thân đứng thẳng hay hơi cong hình chử chi (Zic-zắc), phần ngọn cong.