Khóa luận: Phương pháp xác định dị nguyên IgG bò trong TPBVSK bằng LC-MS/MS

Khám phá phương pháp xác định dị nguyên IgG bò trong TPBVSK bằng LC-MS/MS. Khóa luận trình bày quy trình xây dựng, thẩm định và ứng dụng thực tế.

• Tác giả: Nguyễn Thị Lan Anh
• Người hướng dẫn: Thạc Sĩ Nguyễn Thị Thùy Linh
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Xây dựng phương pháp xác định dị nguyên IgG của bò trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng LC-MS/MS
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về IgG bò và ứng dụng trong TPBVSK

IgG bò (Immunoglobulin G) là một globulin miễn dịch quan trọng có nguồn gốc từ sữa non bò, được ứng dụng rộng rãi trong các thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK). IgG bò sở hữu các đặc tính sinh học quý giá, bao gồm khả năng tăng cường miễn dịch, hỗ trợ sức khỏe đường ruột và nâng cao sức đề kháng của cơ thể. Với cấu trúc phân tử gồm bốn chuỗi polypeptid (hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ), IgG bò hoạt động hiệu quả tại nhiều vị trí khác nhau trong đường tiêu hóa. Nhu cầu xác định chính xác hàm lượng IgG bò trong TPBVSK ngày càng tăng cao, đặc biệt là để kiểm soát chất lượng sản phẩm và đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng.

1.1. Nguồn gốc và đặc điểm cấu trúc IgG bò

IgG bò xuất phát từ sữa non bò, một nguồn protein tự nhiên giàu các yếu tố miễn dịch. Cấu trúc IgG bò bao gồm hai phân lớp chính: IgG1 và IgG3, với tỷ lệ khoảng 90% IgG1 và 10% IgG3. Mỗi phân lớp có những peptid đặc trưng riêng biệt, cho phép xác định và định lượng chính xác bằng các phương pháp phân tích hiện đại như LC-MS/MS.

1.2. Tác dụng sinh học và ứng dụng thực tiễn

Tác dụng sinh học của IgG bò rất đa dạng: tăng cường hệ miễn dịch, cân bằng hệ thống tiêu hóa, giảm viêm ruột và hỗ trợ phục hồi sức khỏe. Những đặc tính này khiến IgG bò trở thành thành phần quan trọng trong nhiều TPBVSK hiện nay, từ sữa bột, thực phẩm chức năng đến các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe đặc biệt.

II. Phương pháp LC MS MS trong xác định IgG bò

Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) là phương pháp phân tích tiên tiến nhất hiện nay để xác định IgG bò trong TPBVSK với độ chính xác và độ nhạy cao. Phương pháp này kết hợp ưu điểm của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong tách chiết và khối phổ trong xác định các peptid đặc trưng. Thiết bị Thermo Fisher Scientific được sử dụng rộng rãi cho loại phân tích này nhờ khả năng phát hiện các phân tử protein/peptid ở nồng độ rất thấp. Quy trình phân tích LC-MS/MS cho phép xác định đồng thời cả hai phân lớp IgG (IgG1 và IgG3), cung cấp thông tin chi tiết về thành phần IgG trong mẫu TPBVSK.

2.1. Nguyên lý và cấu tạo hệ thống LC MS MS

Hệ thống LC-MS/MS gồm hai bộ phận chính: bộ phận sắc ký lỏng tách chiết các peptid khác nhau và bộ phận khối phổ xác định khối lượng phân tử. Máy khối phổ Thermo Fisher Scientific sử dụng công nghệ Orbitrap để đạt độ phân giải cao, cho phép xác định chính xác peptid đặc trưng của IgG bò với độ chính xác khối lượng dưới 5 ppm.

2.2. Lợi thế của LC MS MS so với các phương pháp khác

So với ELISA hay phương pháp khuếch tán miễn dịch, LC-MS/MS cung cấp độ chính xác cao hơn, khả năng phát hiện hạn LOD/LOQ thấp hơn, và không bị ảnh hưởng bởi các dị nguyên khác trong mẫu. Phương pháp này cũng cho phép xác định peptid đặc trưng của từng phân lớp IgG, giúp phân biệt rõ ràng IgG1 và IgG3.

III. Quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp

Xây dựng phương pháp LC-MS/MS để xác định IgG bò trong TPBVSK là một quá trình phức tạp, bao gồm nhiều bước nghiên cứu chi tiết. Trước tiên, cần xác định peptid đặc trưng của IgG1 và IgG3 thông qua cơ sở dữ liệu peptid và phần mềm Skyline. Tiếp theo, phải khảo sát các điều kiện xử lý mẫu bao gồm lựa chọn dung môi loại béo, dung dịch đệm chiết xuất protein, và thời gian chiết. Sau đó thực hiện tối ưu hóa điều kiện LC (độ pH, nhiệt độ, tốc độ dòng chất) và điều kiện khối phổ (năng lượng kích hoạt, điện áp ion hóa). Cuối cùng, phương pháp phải được thẩm định với các tiêu chí như độ phù hợp hệ thống, độ đúng, độ lặp lại theo tiêu chuẩn AOAC và TCVN.

3.1. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Xử lý mẫu là bước quan trọng đầu tiên. Cần khảo sát dung môi loại béo (nước cất, nước có chứa acid, nước có chứa muối) để chiết xuất hiệu quả. Dung dịch đệm chiết xuất với pH tối ưu giúp bảo vệ cấu trúc protein IgG. Thời gian chiết phải được tối ưu hóa để đạt hiệu suất cao nhất mà không làm hư hại peptid đặc trưng.

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp bao gồm kiểm tra độ phù hợp hệ thống (SST) với các tiêu chí về độ phân giải đỉnh, độ đúng (recovery 85-115%), độ lặp lại (RSD < 15%), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). Phương pháp phải đạt các tiêu chuẩn kỹ thuật theo AOAC để có thể áp dụng vào phân tích thực tế.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả phân tích mẫu

Sau khi xây dựng và thẩm định thành công, phương pháp LC-MS/MS đã được ứng dụng để phân tích hàm lượng IgG bò trong các mẫu TPBVSK thực tế trên thị trường. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng IgG bò khác nhau đáng kể giữa các sản phẩm, từ các sản phẩm không chứa IgG bò cho đến những sản phẩm có hàm lượng cao. Phương pháp cho phép xác định chính xác tỷ lệ IgG1/IgG3 trong từng mẫu, giúp xác minh thông tin khai báo của nhà sản xuất. Ứng dụng này có ý nghĩa quan trọng trong kiểm soát chất lượng sản phẩm, bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng, và đảm bảo tuân thủ các quy định về an toàn vệ sinh thực phẩm. Phương pháp cũng có thể mở rộng ứng dụng cho các dị nguyên khác trong thực phẩm.

4.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý kết quả

Lấy mẫu TPBVSK phải đại diện cho toàn bộ lô sản phẩm, thực hiện theo tiêu chuẩn TCVN. Mẫu được xử lý theo quy trình đã tối ưu hóa, sau đó phân tích trên hệ thống LC-MS/MS. Xử lý kết quả bao gồm so sánh tín hiệu peptid của mẫu với mẫu đối chứng IgG bò tiêu chuẩn, tính toán hàm lượng dựa trên đường cong hiệu chuẩn được xây dựng từ các nồng độ đã biết.

4.2. Kết quả phân tích các mẫu TPBVSK trên thị trường

Các kết quả phân tích thực tế từ TPBVSK trên thị trường cho thấy phương pháp LC-MS/MS có khả năng phát hiện IgG bò ở nồng độ rất thấp (dưới 100 ng/mL). Một số sản phẩm khai báo chứa IgG bò nhưng hàm lượng thực tế khác xa với thông tin công bố, cho thấy tính cần thiết của kiểm nghiệm độc lập bằng phương pháp phân tích tiên tiến này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã lên tiếng cảnh báo về mối đe dọa toàn cầu từ tình trạng kháng kháng sinh, ước tính mỗi năm có thể khiến hàng triệu người tử vong. Nhân loại hiện đang đối diện với một thách thức nghiêm trọng trong y học hiện đại mang tên “kháng kháng sinh” – một vấn đề ngày càng trầm trọng và diễn tiến nhanh chóng. Tại Việt Nam, tình trạng lạm dụng và sử dụng kháng sinh không hợp lý, thiếu kiểm soát đã tồn tại suốt nhiều năm, góp phần đáng kể vào sự gia tăng của hiện tượng này. Trong bối cảnh đó, việc nâng cao khả năng miễn dịch tự nhiên của cơ thể trở thành một giải pháp phòng ngừa chủ động và bền vững.

Nhiều nghiên cứu cho thấy, chế độ dinh dưỡng hợp lý có thể đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường sức đề kháng. Đặc biệt, sữa non từ bò – giàu immunoglobulin G (IgG) – được xem là một nguồn dinh dưỡng có tiềm năng hỗ trợ miễn dịch hiệu quả. Nhờ đặc tính miễn dịch tự nhiên, các sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung IgG từ sữa non bò đã được phát triển, hướng tới nhóm đối tượng có nhu cầu miễn dịch cao. Bên cạnh đó, hàm lượng IgG còn được sử dụng như một chỉ tiêu đánh giá chất lượng sữa non, trong đó mức ≥ 50 g/l được xem là đạt chất lượng cao [1].

Vì vậy, để đảm bảo chất lượng, hiệu quả và an toàn cho người tiêu dùng, việc xác định chính xác hàm lượng IgG trong các sản phẩm từ sữa bò là vô cùng cần thiết. Hiện tại, Việt Nam chưa có quy định cụ thể về ngưỡng tối thiểu IgG đối với các sản phẩm sữa bò. Tuy nhiên, tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11913:2017 đã ban hành phương pháp xác định hàm lượng IgG trong sữa non bò, sữa bột và thực phẩm bổ sung có nguồn gốc từ sữa bò, thông qua kỹ thuật sắc ký lỏng ái lực với protein G – cho phép đo lường trong khoảng từ 1 mg/g đến 100 mg/g [2]. Ngoài ra, các phương pháp phân tích IgG hiện hành bao gồm kỹ thuật tách (như sắc ký lỏng, điện di.) và kỹ thuật miễn dịch (như ELISA, PCR.

Tuy nhiên, những kỹ thuật này vẫn tồn tại nhiều hạn chế: ELISA phụ thuộc lớn vào chất lượng kháng thể và kháng nguyên, dễ gây ra kết quả âm tính giả; PCR tuy nhạy nhưng lại phát hiện DNA thay vì protein, có thể dẫn đến định lượng sai lệch IgG. Trong khi đó, phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ hai lần (LC-MS/MS) – một kỹ thuật ngày càng được ứng dụng nhiều trong phân tích protein thực phẩm – đã cho thấy nhiều ưu điểm vượt trội như độ chọn lọc cao, khả năng định lượng chính xác các peptid đặc trưng và độ nhạy cao trong các nền mẫu phức tạp. Từ những lý do trên, đề tài Xây dựng phương pháp xác định IgG của bò trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng LC-MS/MS đã được thực hiện với hai mục tiêu như sau: 1 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định IgG bò trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng LC-MS/MS.

Ứng dụng phương pháp để định lượng IgG bò trong một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe trên thị trường. Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu - IgG bò 1. Nguồn gốc của IgG bò Ở bò, globulin miễn dịch G (IgG) là loại kháng thể chiếm ưu thế trong sữa, đặc biệt là trong sữa non – loại sữa được tiết ra ngay sau khi sinh [3]. Hai phân lớp IgG chính được tìm thấy ở bò là IgG1 và IgG2 [3], [4], phân lớp IgG3 mới được phát hiện gần đây với nồng độ thấp, trong đó IgG1 là phân lớp chiếm ưu thế trong cả sữa trưởng thành lẫn sữa non.

So với các loại kháng thể khác như IgA hay IgM, nồng độ IgG1 cao hơn đáng kể trong sữa bò [5]. Nồng độ IgG1 trong sữa bò trưởng thành thường dao động từ 200 – 500 μg/ml, trong khi ở sữa non, con số này có thể đạt tới 50 – 100 mg/ml trong những ngày đầu sau sinh [6], [7]. Mức độ cao như vậy là rất cần thiết, bởi vì bê con không nhận được kháng thể IgG từ mẹ qua nhau thai, nên sữa non là nguồn IgG duy nhất cung cấp miễn dịch thụ động cho bê con sơ sinh [4]. Nguồn gốc của IgG có trong sữa được xác định là do vận chuyển từ huyết thanh mẹ vào tuyến vú, đặc biệt là trong giai đoạn ngay trước và sau sinh.

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng nồng độ IgG trong máu mẹ giảm trước sinh, do sự dịch chuyển của IgG từ huyết thanh vào sữa non [8]. Hai phân lớp được dịch chuyển vào sữa nhiều hơn là IgG1 và IgG3, vì vậy hàm lượng của hai IgG này trong sữa bò cao hơn so với trong huyết thanh, và đặc biệt cao hơn ở sữa non. Chính vì nồng độ IgG cao và có tác dụng sinh học phong phú, sữa non của bò thường được sử dụng làm nguyên liệu giàu IgG cho nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực y sinh. Ngoài ra, các chế phẩm IgG từ huyết thanh bò – có thành phần tương tự như IgG trong sữa non – cũng được sử dụng trong các nghiên cứu hỗ trợ điều trị rối loạn tiêu hóa ở người [9].

Đặc điểm cấu trúc IgG là một glycoprotein đơn phân gồm 2 chuỗi nhẹ giống hệt nhau (khối lượng phân tử mỗi chuỗi khoảng 23 kDa) và hai chuỗi nặng giống hệt nhau (mỗi chuỗi khoảng 53 kDa). - Có hai loại chuỗi nhẹ là κ và λ: khác nhau về cấu trúc chuỗi nhưng tương đồng về trình tự acid amin. Chuỗi nhẹ chứa một vùng hằng số (Fc), vùng này xác định tính đặc hiệu miễn dịch của IgG. - Các chuỗi nặng và các chuỗi nhẹ được gắn với nhau bằng liên kết disulfid (-S- S-).

- Hai chuỗi nặng được gắn với nhau bằng liên kết disulfid ở gần vùng bản lề. Vùng bản lề mang lại sự linh hoạt cho phân tử trong tương tác kháng thể - 3 kháng nguyên. Có hai vị trí gắn kháng nguyên trong tương tác này, mỗi vị trí được tạo bởi phần N-tận của một chuỗi nặng và vùng biến đổi của một chuỗi nhẹ. Trong đó gen mã hóa miền Fc là những yếu tố chính quyết định đặc trưng lớp Ig, và các phân lớp IgG1, IgG2, IgG3 khác nhau chủ yếu trong miền Fc chuỗi nặng của chúng [5].

Cấu trúc của IgG [10] Cấu trúc và chức năng của globulin miễn dịch G (IgG) không ổn định khi xử lý ở nhiệt độ cao, đặc biệt trên ngưỡng khoảng 65°C, do đó dễ bị ảnh hưởng dưới các điều kiện thanh trùng thông thường [11], [12]. Các phân tích miễn dịch có chọn lọc đã chỉ ra rằng có sự khác biệt nhỏ về tính ổn định giữa các miền cấu trúc của IgG. Bất kể nguồn gốc của IgG, có nghiên cứu cho thấy rằng các vùng Fab và Fc đều thể hiện tính ổn định về mặt cấu trúc, đồng thời vẫn duy trì khả năng thích ứng với sự biến đổi của nhiệt độ, pH và hoạt động enzym [5]. IgG của bò gồm ba phân lớp: IgG1, IgG2 và IgG3.

Trong IgG3 mới được phát hiện gần đây với nồng độ thấp, chưa có nhiều nghiên cứu về phân lớp này. Tính chất của các phân lớp IgG IgG1 IgG2 Tính chất lý hóa 1. Khối lượng phân tử (kDa) 146-163 146-154 2. Loại chuỗi nặng γ1 γ2 4.

Cấu trúc monomer monomer 5. Điểm đẳng điện (pI) 5.3 Miễn dịch học 8. Cố định bổ thể +++ + 10. Sự kết tụ + (thấp) + Nồng độ (g/l) trong sữa non bò 15-180 1-3 Sau khi thủy phân bằng enzym trypsin, mỗi phân lớp tạo ra một peptid đặc trưng có thể được sử dụng cho mục đích định tính.

Tuy nhiên, không tồn tại peptid chung cho cả ba phân lớp, mà chỉ có một peptid chung cho IgG1 và IgG3. Trong ba phân lớp này, IgG1 là thành phần chiếm ưu thế, chiếm khoảng 80% tổng lượng IgG. Do đó, việc lựa chọn định lượng peptid chung của IgG1 và IgG3 có thể đại diện cho hàm lượng IgG tổng trong mẫu phân tích. Tác dụng sinh học Sữa bò chứa nhiều thành phần có đặc tính điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn.

Globulin miễn dịch bò (Ig), đặc biệt là IgG, đã được nghiên cứu từ những năm 1970 về tiềm năng của chúng trong việc hỗ trợ miễn dịch và phòng ngừa nhiễm trùng ở người [4]. IgG bò có khả năng liên kết với nhiều loại vi khuẩn, virus gây bệnh cũng như các chất gây dị ứng khác nhau [13], [14], [15]. Hơn nữa, tính đặc hiệu của các globulin miễn dịch trong sữa hoặc sữa non có thể được nâng cao thông qua việc tiêm vắc-xin cho bò trước khi thu hoạch sữa hoặc sữa non [4]. Sau khi được tiêm vắc-xin, sữa non tăng cường miễn dịch có hàm lượng IgG1 cao, giúp nhận diện chính xác các tác nhân gây bệnh có trong vắc-xin [14], [16].

Các nghiên cứu đầu tiên về việc sử dụng globulin miễn dịch bò đường uống nhằm phòng ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa chủ yếu tập trung vào sữa non tăng cường miễn dịch chứa globulin đặc hiệu với rotavirus. Chế phẩm này đã được áp dụng để phòng ngừa và điều trị nhiễm rotavirus ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Kể từ đó, nhiều nghiên cứu tiếp theo đã được thực hiện trên các hệ thống in vitro, mô hình động vật và nghiên cứu lâm sàng nhằm làm rõ cơ chế hoạt động cũng như tiềm năng ứng dụng của immunoglobulin bò trong lĩnh vực sức khỏe con người [4]. Tác dụng của IgG tại nhiều vị trí khác nhau trong đường tiêu hóa [4] Tác dụng của IgG bò tại nhiều vị trí khác nhau trong đường tiêu hóa: (A) Sau khi tiêu hóa, IgG bò có thể gặp phải các tác nhân gây bệnh đường hô hấp đã nuốt và các chất gây dị ứng hít vào.

Điều này có thể dẫn đến loại trừ miễn dịch một phần (đặc biệt là khi sữa bị trào ngược và đi vào vòm họng) và điều hòa miễn dịch ở amidan tạo nên vòng Waldeyer. (B) Ở ruột non, IgG cũng có thể loại trừ các tác nhân gây bệnh bằng cách ngăn chặn sự bám dính vào bề mặt biểu mô, nhưng cũng có thể thúc đẩy sự hấp thu các phức hợp miễn dịch của IgG với các tác nhân gây bệnh thông qua các thụ thể Fc, dẫn đến phản ứng miễn dịch điều hòa và tạo ra IgA. Tổng quan các phương pháp định lượng IgG trong sữa non bò Hiện nay, có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định hàm lượng IgG trong các nền mẫu phức tạp như sữa non và sữa bò. Các phương pháp này được chia thành 2 nhóm kỹ thuật chính là kỹ thuật miễn dịch và kỹ thuật tách.