Luận văn ThS. Đỗ Trúc Quỳnh: Xác định Estragol, Safrol trong gia vị bằng GC-MS

Luận văn trình bày phương pháp GC-MS xác định và định lượng ba hợp chất alkenylbenzen: estragol, methyl eugenol, safrol có trong các mẫu gia vị.

• Tác giả: Đỗ Trúc Quỳnh
• Người hướng dẫn: Vũ Ngân Bình
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc Và Độc Chất
• Đề tài: Xác Định Estragol, Methyl Eugenol, Safrol Trong Gia Vị Bằng Gc-Ms
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ Dược Học
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm và Tầm quan trọng của Estragol Methyl Eugenol Safrol

Estragol, Methyl Eugenol, và Safrol là ba hợp chất thuộc nhóm alkenylbenzen thường được tìm thấy trong các gia vị và hương liệu tự nhiên. Những chất này có nguồn gốc từ các thực vật như hồi, quế, đinh hương và các loại thảo mộc khác. Tầm quan trọng của việc xác định chúng nằm ở việc đánh giá độ an toàn thực phẩm và kiểm soát chất lượng gia vị trong công nghiệp thực phẩm. Các hợp chất này được quy định nghiêm ngặt bởi các tổ chức như FDA, IARC và JECFA do tiềm năng độc tính của chúng. Việc xác định chính xác hàm lượng này là bước quan trọng trong kiểm nghiệm thực phẩm và đảm bảo sản phẩm đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế về an toàn vệ sinh thực phẩm.

1.1. Định nghĩa và Cấu trúc hóa học

Estragol là một alkenylbenzen có công thức C₆H₅CH₂CH=C(CH₃)₂, chứa vòng benzene gắn với một chuỗi allyl. Methyl Eugenol có cấu trúc tương tự nhưng với nhóm methoxy trên vòng benzene. Safrol là một pheneylpropane với vòng methylenedioxy. Các hợp chất này đều là những hợp chất hữu cơ có tính chất lipophilic cao, dễ bay hơi và có mùi hương đặc trưng của các gia vị tự nhiên.

1.2. Nguồn gốc từ Gia vị tự nhiên

Những hợp chất alkenylbenzen này tự nhiên có trong các loại gia vị như hồi (anise), quế (cinnamon), đinh hương (clove), và thì là. Chúng đóng vai trò quan trọng trong hương vị và mùi hương đặc trưng của các gia vị này, làm tăng giá trị thương mại và tính hấp dẫn của sản phẩm.

II. Độc tính và Quy định quản lý Alkenylbenzen

Các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng Estragol, Methyl Eugenol, và Safrol có khả năng gây độc tính tiềm ẩn đối với sức khỏe con người. Tổ chức IARC (Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế) đã phân loại Safrol là chất gây ung thư tiềm năng (Nhóm 2B). Các hợp chất này có thể gây tổn thương gan và các cơ quan khác khi tiếp xúc lâu dài. Do đó, các quốc gia và tổ chức quốc tế đã thiết lập các giới hạn chặt chẽ cho phép của những chất này trong gia vị và phụ gia thực phẩm. FDA, Châu Âu (EC), và JECFA đều có các quy định riêng biệt nhằm bảo vệ sức khỏe công chúng thông qua việc kiểm soát hàm lượng alkenylbenzen trong các sản phẩm thực phẩm và gia vị.

2.1. Tác hại sức khỏe của Alkenylbenzen

Estragol có thể gây độc tính gan ở liều cao. Safrol được xác định là chất gây ung thư tiềm năng và có khả năng gây đột biến gen. Methyl Eugenol cũng có các tác dụng độc tính tương tự. ADI (Lượng hấp thụ hàng ngày chấp nhận được) cho những chất này rất thấp, yêu cầu kiểm soát chặt chẽ trong các sản phẩm tiêu dùng hàng ngày.

2.2. Tiêu chuẩn quốc tế và Quy định Việt Nam

Các tổ chức như FDA, JECFA, FEMA đã thiết lập các giới hạn chặt chẽ cho phép. Châu Âu cấm hoàn toàn Safrol trong thực phẩm. Việt Nam, qua Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, cần tuân thủ các tiêu chuẩn quốc tế để đảm bảo an toàn thực phẩm trong xuất khẩu và tiêu dùng nội địa.

III. Phương pháp xác định bằng GC MS

Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là phương pháp phân tích tiêu chuẩn được sử dụng rộng rãi để xác định và định lượng Estragol, Methyl Eugenol, và Safrol trong các mẫu gia vị. Phương pháp này kết hợp sức mạnh của sắc ký khí (GC) để tách các hợp chất với khối phổ (MS) để nhận dạng và định lượng chúng. GC-MS cung cấp độ chính xác cao, độ nhạy tốt và có khả năng phân tích đồng thời nhiều alkenylbenzen trong một mẫu. Phương pháp này đã được thẩm định và công nhận bởi các tổ chức quốc tế như AOAC (Hiệp hội các nhà liên phòng thí nghiệm phân tích chính thức). Quá trình phân tích bao gồm chuẩn bị mẫu, tối ưu điều kiện thiết bị, và đánh giá chất lượng phương pháp thông qua các tiêu chuẩn LOD, LOQ, độ thu hồi, và độ lặp lại.

3.1. Nguyên tắc hoạt động của GC MS

GC-MS hoạt động bằng cách đưa mẫu vào cột sắc ký khí, nơi các hợp chất được tách dựa trên điểm sôi và độ hấp thụ. Các hợp chất sau đó đi vào bộ dòm khối phổ nơi chúng bị ion hóa thành các phân mảnh đặc trưng. Mỗi alkenylbenzen tạo ra một pattern khối phổ độc nhất, cho phép nhận dạng chính xác và phân biệt giữa các hợp chất.

3.2. Xử lý mẫu và Điều kiện tối ưu

Xử lý mẫu bao gồm chiết, làm sạch, và chuẩn bị dung dịch để loại bỏ các chất cản trở. Kỹ thuật QuEChERS hoặc chiết rắn-lỏng (SLE) thường được sử dụng. Điều kiện GC-MS được tối ưu hóa bao gồm nhiệt độ cột, tốc độ dòng, năng lượng ion hóa để đạt được độ phân tách tốt nhất và tín hiệu mạnh mẽ.

IV. Ứng dụng thực tế và Kiểm nghiệm Gia vị

Phương pháp xác định GC-MS đã được ứng dụng thành công trong kiểm nghiệm các mẫu gia vị thực tế từ các nhà sản xuất và thị trường. Các kết quả phân tích cho thấy hàm lượng alkenylbenzen trong những loại gia vị khác nhau có sự khác biệt đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc thực vật, phương pháp sơ chế, và điều kiện lưu trữ. Việc giám sát định kỳ các sản phẩm gia vị thông qua phương pháp này giúp đảm bảo chất lượng và an toàn cho người tiêu dùng. Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia đã áp dụng phương pháp này trong chương trình kiểm soát chất lượng của các sản phẩm gia vị xuất khẩu và tiêu dùng nội địa. Những kết quả từ luận văn thạc sĩ tại Đại học Dược Hà Nội đã cung cấp dữ liệu quý báu về mức độ tòn tại của những hợp chất này, hỗ trợ trong việc xây dựng các tiêu chuẩn quốc gia và chính sách quản lý thực phẩm.

4.1. Kết quả phân tích mẫu Gia vị thực tế

Các mẫu gia vị được thu thập từ thị trường Hà Nội bao gồm hồi, quế, đinh hương, và các sản phẩm gia vị khác. Phân tích GC-MS cho thấy hàm lượng Safrol trong hồi ngôi sao cao hơn so với các gia vị khác. Estragol chủ yếu phát hiện trong hồi thường. Methyl Eugenol tập trung cao trong đinh hương. Các kết quả này giúp định hướng các biện pháp kiểm soát và khuyến cáo sử dụng.

4.2. Hàm ý chính sách và Khuyến nghị quản lý

Những phát hiện từ kiểm nghiệm này hỗ trợ các cơ quan quản lý trong việc rà soát, cập nhật tiêu chuẩn và thiết lập giới hạn cho các gia vị nhập khẩu và sản xuất trong nước. Việt Nam cần tiếp tục giám sát, phân tích các mẫu theo định kỳ để bảo vệ sức khỏe cộng đồng và nâng cao vị thế trong thương mại quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan chung về nhóm alkenylbenzen 1. Giới thiệu về nhóm alkenylbenzen Alkenylbenzen là nhóm hợp chất thiên nhiên tìm thấy trong rất nhiều loài thực vật khác nhau như quế (Cinnamomum spp), húng quế (Occimum basilicum), thì là (Peucedanum graveolens), đại hồi (Illicium verum), tiểu hổi (Foeniculum vulgare), hương nhu (Occimum gratiscimum), tiêu đen (Piper nigrum),. Hầu hết những loài thực vật này, đều có hương thơm đặc trưng và hấp dẫn nên được sử dụng với nhiều công dụng khác nhau như làm gia vị, làm thức ăn, làm thuốc ở hầu khắp các nơi trên thế giới.

Dưới đây là một số thông tin cơ bản về các loài thực vật, đã và đang được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia, trong thành phần chứa một tỉ lệ tương đối cao các hợp chất alkenylbenzen. - Các loài quế nói chung (Cinnamomum spp): thường được sử dụng làm gia vị và làm thuốc vì vị cay ấm đặc trưng. Thành phần chính trong vỏ, thân và lá quế là Cinamyldehyd và eugenol [6]. - Đại hồi hay hồi 5 cánh (Illicium verum): là một loại thực vật rất phổ biến ở miền bắc Việt Nam và Trung Quốc, thường xuyên được sử dụng làm gia vị cho nhiều món ăn truyền thống.

Quả đại hồi có thành phần tinh dầu lên đến 7-9% khối lượng, trong đó trans-anethol chiếm tới từ 72 – 92 %. Ngoài ra, trong thành phần tinh dầu của đại hồi còn có thêm các hợp chất terpenoid như myrcen, terpineol., một số alkenylbenzen khác như estragol (2%), cis-anethol (0,5%),. [7] - Tiểu hồi (Foeniculum vulgare), là loài thực vật có nguồn gốc từ khu vực Địa Trung Hải, sau đó qua khu vực Trung Đông, trở thành thực vật được trồng tương đối phổ biến ở Châu Á. Mọi bộ phận của cây tiểu hồi đều có thể được sử dụng cho các mục đích làm gia vị, làm thuốc trị cảm, thực phẩm hỗ trợ tiêu hóa; tuy nhiên, bộ phận được sử dụng nhiều nhất là hạt tiểu hồi.

Trong thành phần tinh dầu tiểu hồi, bên cạnh các hợp chất nhóm terpenoid như limonen, camphen, pinen; cũng có các hợp chất thuộc nhóm alkenylbenzen như eugenol, chavicol, methylchavicol (estragol), anethol,.[8] - Húng quế (Occimum basilicum): là cây nhiệt đới thuộc họ Bạc hà (Lamiacea), được dùng phổ biến như một gia vị và rau thơm trong nhiều nền ẩm thực khu vực Đông Á và Đông Nam Á. Trong thành phần của tinh dầu húng quế, có nhiều hợp chất bay hơi 3 khác nhau tùy thuộc vào tính chất của đất và khí hậu nơi trồng, trong đó có 2 thành phần có tỉ lệ lớn nhất là linanool và estragol (một alkenylbenzen đã biết có nguy cơ gây ung thư) với tỉ lệ 3:1. Ngoài ra, trong tinh dầu húng quế cũng có những hợp chất alkenylbenzen khác như eugenol, methyl eugenol,. Loại và hàm lượng alkenylbenzen trong cây và tinh dầu của một số thực vật được tổng hợp trong bảng 1.1: Hàm lượng anlkenylbenzen trong một số thực vật Hàm lượng trong Chất Cây Hàm lượng trong cây tinh dầu (%) Húng quế 1,2 ppm 92 % Hương thảo 3% Estragol Đại hồi 5 – 6% Quế 0,29 % Hạt cần tây 0,33 ppm 1,2 % Myristicin Nhục đậu khấu 13000 ppm 4-8 % Hạt rau mùi 0,05 ppm Rau thì là 0,22 ppm Elemicin Nhục đậu khấu 4-6 ppm Húng quế 0,8 ppm Eugenol Đinh hương 28,5 ppm Safrol Hồi 6,6% Nhục đậu khấu 1,6% Methyl eugenol Hạt tiêu 8,8% Hồi 9,8% Húng quế 9,27% Bên cạnh cách sử dụng dược liệu như một gia vị/thực phẩm/thuốc cổ phương, các hợp chất thơm trong tinh dầu, trong đó có nhóm hợp chất alkenylbenzen cũng thường được tách/chiết từ các loài thực vật khác nhau để sử dụng riêng lẻ như một gia vị, phụ 4 gia tạo hương thực phẩm, nguyên liệu thực phẩm, hay phụ gia trong nhiều ngành công nghiệp khác như hóa mỹ phẩm, nước hoa,.

Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý của các alkenylbenzen Alkenylbenzen là một nhóm các hợp chất hóa học có cấu trúc tương đối đơn giản, gồm 1 vòng benzen liên kết với một nhóm alkenyl, có nguồn gốc thực vật. Nhóm hợp chất này tương đối phổ biến, được tìm thấy hầu hết trong các loại tinh dầu thực vật như cam, chuối,.; đặc biệt là những loài thực vật có mùi thơm đặc trưng - được sử dụng làm gia vị như: hồi, quế, đinh hương, thảo quả, thì là,. Các hợp chất alkenylbenzen hiện đang được phân loại thành 2 nhóm lớn [9]: - Nhóm propenylbenzen: là các alkenylbenzen có liên kết đôi 2-3, với các chất đại diện như: estragol (methylchavicol), safrol, myristicin, elemicin, eugenol,. - Alkenylbenzen có liên kết đôi 1-2 (nhóm allylbenzen), với các đại diện như: trans-anethol, β-asaron,… Công thức cấu tạo của một số alkenylbenzen thường gặp được thể hiện trong hình 1.

Estragol Eugenol trans-anethol Elemicin Methyl eugenol α-Asaron Myristicin Safrol β-Asaron Hình 1.1: Công thức cấu tạo một số alkenylbenzen thường gặp 5 Theo hệ thống cảnh báo sớm các vấn đề thực phẩm và thức ăn chăn nuôi của Châu Âu (RASFF), có 5 hợp chất nhóm alkenylbenzen: estragol, methyl eugenol, safrol, trans-anethol, myriscitin, được xếp vào nhóm các tác nhân hóa học gây hại cho con người [1]. Trong đó, ba alkenylbenzen (estragol, methyl eugenol và safrol) được cấm bổ sung vào thực phẩm Quy định Châu Âu (EC) số 1334/2008 [1]. Thông tin về tính chất lý hóa cơ bản của ba hợp chất alkenylbenzen được thực hiện trong nghiên cứu được nêu trong bảng 1.2: Tính chất hoá lý của 3 hợp chất alkenylbenzen Tính chất Estragole Methyl eugenol Safrol Công thức cấu tạo Công thức C10H12O C11H14O2 C10H10O2 phân tử Nhiệt độ sôi 216 262 235 o ( C) Tỉ khối 0,946 0,980 1,09 (g/mL) 1. Độc tính của các hợp chất nhóm alkenylbenzen Nhìn chung, các chất trong nhóm alkenylbenzen có con đường chuyển hóa trong cơ thể tương tự nhau và phụ thuộc vào lượng hấp thu các hợp chất alkenylbenzen vào cơ thể [14].

Các nghiên cứu hiện nay cho rằng, có 3 con đường chuyển hóa chính các hợp chất alkenylbenzen. - Con đường O-demethyl hoá: đây là con đường chuyển hóa xảy ra chủ yếu, khi lượng alkenylbenzen hấp thu vào cơ thể ít (<10 mg/kg thể trọng). Con đường O-demethylation xảy ra ở gan bằng cách khử nhóm p-methoxy của các alkenylbenzen thành nhóm phenolic. Phân tử có nhóm p-phenolic sau đó sẽ được liên hợp với glucuronic hoặc glutathiol để loại bỏ khỏi cơ thể.

Đây là con đường không gây ra độc tính do các sản 6 phẩm chuyển hóa được liên hợp và loại khỏi cơ thể một cách an toàn, không có khả năng tạo các liên kết cộng hóa trị vào phân tử ADN [14]. - Con đường Epoxid hoá: đây là con đường chuyển hóa xảy ra khi con đường O- demethylation đã bão hòa, chỉ xảy ra ở nhóm các allylbenzen. Nhóm allylbenzen được oxy hóa tại gan tạo vòng epoxid. Hợp chất epoxid có khả năng tạo các liên kết đồng hóa trị với protein và ADN nên được nhiều tác giả cho rằng có nguy cơ gây ra các ngộ độc về gen.

Nhóm hợp chất này được gan khử độc bằng cách enzym epoxy hydroxylase tạo hợp chất 2,3-diol và liên hợp với glutathiol để loại bỏ khỏi cơ thể [15], [16]. - Con đường 1’-hydroxyl hoá: đây là con đường chuyển hóa xảy ra khi con đường O- demethyl hoá đã bão hòa, là con đường chuyển hóa chủ yếu gây ra các tác dụng ngộ độc gen/nguy cơ ung thư của nhóm alkenylbenzen. Trong con đường này, Carbon ở vị trí 1’ được gắn nhóm hydroxy, tạo thành nhóm benzylic/allylic. Phân tử này sau đó được sulfat hóa tạo thành một hợp chất kém bền, chuyển thành carbocation.

Carbocation này trực tiếp phản ứng với các nucleotid và protein, gây ra các đột biến ADN [15], [16].2: Con đường chuyển hóa các alkenylbenzen trong cơ thể Dựa vào các con đường chuyển hóa của các alkenylbenzen trong cơ thể sinh vật, các nghiên cứu độc tính của các hợp chất alkenylbenzen cũng như độc tính của các loài thực vật giàu alkenylbenzen đã được thực hiện và nghiên cứu chi tiết.3 tóm tắt 7 độc tính của ba alkenylbenzen bị cấm bổ sung vào thực phẩm trong một số loài thực vật phổ biến [13].3: Độc tính của ba alkenylbenzen bị cấm bổ sung vào thực phẩm trong một số loài thực vật phổ biến [8] Hợp chất Loài thực vật Độc tính Estragol Foeniculum vulgare Occimum basilicum Tác nhân độc gen, gây đột biến được chứng Artemisia dracunculus minh qua nhiều thí nghiệm trên chuột. Pimpinella anisum Methyl Foeniculum vulgare eugenol Occimum basilicum Artemisia dracunculus Là hợp chất có thể gây ung thư gan ở chuột Laurus nobilis qua con đường hydroxyl hoá. Zingiber officinale Cymbopogon spp Safrol Piper nigrum Tác nhân độc gen, gây đột biến được chứng Occimum basilicum minh qua nhiều thí nghiệm trên chuột. Quy định quản lý hiện hành đối với các hợp chất alkenylbenzen Các mối quan tâm về nhóm hợp chất alkenylbenzen xuất phát từ việc phát hiện ra tác động gây ung thư gan chuột đồng gây ra bởi safrol năm 1961 [9].

Sau đó, các hợp chất nhóm alkenylbenzen được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu để phát hiện ra các ảnh hưởng tới sức khỏe con người. Theo một số nghiên cứu, 3 chất safrol, estragol và methyl eugenol có khả năng gây ung thư gan trên chuột. Hiện nay, safrol và methyl eugenol đã được IARC xếp vào nhóm 2B – nhóm các chất có thể gây ung thư [2], [3]. Theo quy định của châu Âu, 2 chất này cũng không được phép thêm vào trong thực phẩm [17].

- Các quy định với estragol: Ở Mỹ, FDA cho phép sử dụng estragol như một chất điều chỉnh hương vị trong công nghiệp thực phẩm. Năm 2011, hội đồng chuyên gia của FEMA – hiệp hội các nhà sản xuất hương liệu của Hoa Kỳ tổng hợp các nghiên cứu đã 8 có và cho rằng lượng hấp thụ estragol chủ yếu tới từ các gia vị và nước sốt không đủ lớn để có thể gây ra các nguy cơ gây ung thư ở người [13], [9]. Hiện tại, hội đồng chuyên gia của WHO/FAO về phụ gia thực phẩm cũng chưa đưa ra giá trị ADI cho estragol mà yêu cầu thêm các nghiên cứu về độc tính gây ung thư trường diễn [11]. Ngược lại, năm 2008, Hội đồng Châu Âu (EC) cho rằng safrol và estragol không được phép bổ sung vào thực phẩm.

Đồng thời, EC cũng đưa ra quy định giới hạn hàm lượng tối đa với estragol có nguồn gốc tự nhiên trong thực phẩm là 50 ppm trong các sản phẩm sữa, nấm, hạt, thịt,. và 10 ppm đối trong đồ uống không cồn [17]. Hiện nay, FDA không có quy định riêng cho nhóm hợp chất alkenylbenzen trong thực phẩm mà vẫn sử dụng việc phân loại từng chất/phụ gia cụ thể: hoặc thuộc nhóm GRSA (được xem là an toàn), hoặc các nhóm chất với quy định giới hạn hàm lượng, hoặc nhóm chất bị cấm.