Luận văn: Xác định đột biến gen Alpha Globin gây bệnh Thalassemia

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu bệnh Thalassemia. Tìm hiểu quy trình xác định đột biến gen alpha globin bằng kỹ thuật PCR đa mồi, một phương pháp hiệu quả.

• Tác giả: Trần Tuấn Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Xác định đột biến gen Alpha Globin gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật PCR đa mồi
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Thalassemia và tầm quan trọng của chẩn đoán gen

Thalassemia là một bệnh di truyền máu hiếm gặp nhưng có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người. Bệnh này xảy ra khi có đột biến gen ở cụm gen α-globin hoặc β-globin, dẫn đến giảm hoặc mất khả năng tổng hợp hemoglobin. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng triệu người trên thế giới mang gen bệnh thalassemia. Việc xác định đột biến gen thalassemia sớm là chìa khóa để chẩn đoán, điều trị và lập kế hoạch phòng chống bệnh hiệu quả. Thalassemia có thể phân loại thành alpha-thalassemia và beta-thalassemia dựa vào vị trí đột biến gen. Chẩn đoán chính xác giúp các bác sĩ xác định mức độ bệnh và đưa ra phương pháp điều trị phù hợp nhất cho bệnh nhân.

1.1. Định nghĩa và phân loại bệnh thalassemia

Thalassemia là bệnh rối loạn tạo máu di truyền liên quan đến gen α-globin hoặc gen β-globin. Bệnh được chia thành hai loại chính: alpha-thalassemia (liên quan đến đột biến gen α-globin) và beta-thalassemia. Alpha-thalassemia thường gặp ở các quốc gia Đông Nam Á, đặc biệt là Việt Nam, Thái Lan và Campuchia. Các đột biến gen phổ biến là mất đoạn DNA (deletions) gây nên α+-thalassemia và αo-thalassemia với mức độ bệnh từ nhẹ đến nặng.

1.2. Vai trò của chẩn đoán gen trong phòng chống thalassemia

Chẩn đoán đột biến gen thalassemia qua kỹ thuật PCR giúp phát hiện người mang gen bệnh và bệnh nhân. Điều này hỗ trợ tư vấn di truyền, sàng lọc trước sinh, và lập kế hoạch hôn nhân cho các cặp vợ chồng có nguy cơ cao. Việc phát hiện sớm đột biến gen α-globin cũng giúp giảm số trẻ sinh ra với bệnh thalassemia nặng, từ đó giảm gánh nặng y tế và kinh tế cho xã hội.

II. Kỹ thuật PCR đa mồi trong phát hiện đột biến gen

Kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR) là phương pháp hiệu quả để xác định đột biến gen gây bệnh thalassemia. Phương pháp này sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR duy nhất, cho phép phát hiện đồng thời các đột biến gen phổ biến như mất đoạn --SEA, --THAI, --3.7, --4.2 và các mất đoạn khác. Kỹ thuật PCR đa mồi có ưu điểm là nhanh chóng, tiết kiệm chi phí, giảm lượng mẫu DNA cần thiết, và có độ chính xác cao. Các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để nhận diện từng đột biến gen cụ thể trên gen α-globin. Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose, cho phép phân biệt rõ ràng các kiểu gen khác nhau. Phương pháp này đã được chứng minh hiệu quả trong sàng lọc và chẩn đoán bệnh thalassemia tại nhiều cơ sở y tế.

2.1. Nguyên lý và cơ chế của PCR đa mồi

PCR đa mồi sử dụng DNA polymerase để khuếch đại các đoạn DNA cụ thể bằng nhiều cặp mồi đồng thời. Mỗi cặp mồi được thiết kế nhận diện một đột biến gen hoặc một vùng bình thường trên gen α-globin. Phản ứng PCR bao gồm các vòng biến tính, kết dính và tổng hợp DNA lặp lại 25-35 lần. Kích thước sản phẩm PCR khác nhau cho mỗi đột biến gen, cho phép phân biệt trên gel agarose. Phương pháp này tiết kiệm thời gian và tài nguyên so với các phương pháp phát hiện đơn từng đột biến gen.

2.2. Các đột biến gen phổ biến phát hiện được

Các đột biến gen α-globin phổ biến gây bệnh thalassemia bao gồm: mất đoạn --SEA (phổ biến ở Đông Nam Á), --THAI (ở Thái Lan), --3.7 (mất đoạn từ từng gen α), --4.2 (mất đoạn ζ2-ψα1), và những mất đoạn khác. Kỹ thuật PCR đa mồi có thể phát hiện 5 loại đột biến gen phổ biến nhất trong một lần phản ứng. Việc phát hiện đầy đủ các đột biến gen này giúp chẩn đoán chính xác và phân loại mức độ bệnh cho bệnh nhân thalassemia.

III. Quy trình thực hiện xác định đột biến gen bằng PCR đa mồi

Quy trình xác định đột biến gen thalassemia bằng kỹ thuật PCR đa mồi bao gồm các bước chính: trích ly DNA từ mẫu máu toàn bộ, định lượng và đánh giá chất lượng DNA, thiết kế cặp mồi đặc hiệu, tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR, thực hiện PCR đa mồi, phân tích sản phẩm qua điện di gel agarose, và xác định kiểu gen. Mỗi bước đều quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kết quả. Kỹ thuật PCR đa mồi được thực hiện với các thông số tối ưu như nồng độ DNA template, nồng độ dNTP, nồng độ MgCl₂ và số vòng khuếch đại. Kết quả cuối cùng cho phép xác định chính xác kiểu gen của bệnh nhân, phân biệt trạng thái mang gen bệnh và bệnh thalassemia ở các mức độ khác nhau.

3.1. Chuẩn bị mẫu và trích ly DNA

Mẫu máu được thu từ bệnh nhân hoặc người mang gen bệnh vào các ống chứa chất chống đông. DNA được trích ly từ máu toàn bộ bằng các phương pháp tiêu chuẩn hoặc kit thương mại. DNA được định lượng bằng máy quang phổ (spectrophotometer) để xác định nồng độ và độ tinh sạch. DNA chất lượng tốt có tỷ lệ hấp thụ A260/A280 khoảng 1.8-1.9. Mẫu DNA được bảo quản ở -20°C để sử dụng cho PCR đa mồi.

3.2. Thiết kế mồi và tối ưu hóa phản ứng PCR

Các cặp mồi được thiết kế dựa trên chuỗi DNA của gen α-globin bình thường và các đột biến gen phổ biến. Mỗi cặp mồi cho sản phẩm PCR với kích thước khác nhau, dễ phân biệt trên gel agarose. Điều kiện PCR đa mồi được tối ưu hóa bao gồm nhiệt độ kết dính mồi (annealing temperature), nồng độ các chất phản ứng, và số vòng khuếch đại. Quá trình tối ưu hóa đảm bảo độ chuyên hiệu cao và giảm phản ứng ngoài ý muốn.

IV. Ý nghĩa lâm sàng và ứng dụng trong thực tiễn y tế

Xác định đột biến gen thalassemia bằng kỹ thuật PCR đa mồi có ý nghĩa lâm sàng rất lớn trong chẩn đoán, điều trị và phòng chống bệnh. Kết quả chính xác giúp bác sĩ xác định mức độ bệnh (thalassemia trait, HbH disease, hay α-thalassemia major), đưa ra phương pháp điều trị phù hợp và tư vấn di truyền cho gia đình. Bệnh nhân mang gen bệnh có thể được theo dõi chặt chẽ hơn để phát hiện sớm các biến chứng. Đối với các cặp vợ chồng có nguy cơ cao, sàng lọc đột biến gen giúp đánh giá nguy cơ sinh con bị bệnh thalassemia và lên kế hoạch phòng chống. Kỹ thuật PCR đa mồi hiện được áp dụng tại các cơ sở y tế chuyên sâu, viện huyết học, và các phòng thí nghiệm y học, góp phần nâng cao chất lượng chẩn đoán và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

4.1. Giá trị chẩn đoán và phân loại bệnh

Kết quả PCR đa mồi cho phép phân loại bệnh nhân thành các nhóm: người bình thường (không có đột biến gen), người mang gen bệnh (heterozygous), và bệnh nhân thalassemia (homozygous hoặc compound heterozygous). Việc phân loại chính xác giúp bác sĩ lập kế hoạch điều trị và theo dõi thích hợp. Các bệnh nhân có cùng kiểu gen đột biến có thể có biểu hiện lâm sàng khác nhau do ảnh hưởng của các yếu tố khác, nhưng xác định đột biến gen vẫn là nền tảng quan trọng cho chẩn đoán.

4.2. Ứng dụng trong tư vấn di truyền và sàng lọc trước sinh

Kỹ thuật PCR đa mồi được sử dụng để sàng lọc bệnh thalassemia ở người mang gen bệnh và trong chương trình tư vấn di truyền. Các cặp vợ chồng có nguy cơ cao có thể được sàng lọc để xác định kiểu gen của họ, từ đó tính toán nguy cơ sinh con bị bệnh. Đối với phụ nữ mang thai, có thể thực hiện sàng lọc trước sinh (prenatal screening) để phát hiện đột biến gen thalassemia ở thai nhi. Các thông tin này giúp gia đình đưa ra quyết định thông tin về sinh đẻ và lập kế hoạch y tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------- Trần Tuấn Anh XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN ALPHA GLOBIN GÂY BỆNH THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------- Trần Tuấn Anh XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN ALPHA GLOBIN GÂY BỆNH THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. Võ Thị Thương Lan, người đã chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình em thực hiện đề tài. Cô không chỉ truyền thụ cho em nhiều kiến thức về chuyên môn mà còn giúp em bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học.

Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn, là hành trang giúp em tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Em cũng xin trân trọng cảm ơn ThS. Tạ Bích Thuận. Cô đã luôn động viên, dành cho em nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc em gặp khó khăn.

Về phía nhà trường, em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học đã giảng dạy cho em nhiều kiến thức quý báu; em xin cảm ơn Bộ môn Di truyền học, Phòng sau đại học, Phòng công tác chính trị Học sinh - Sinh viên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn thạc sỹ. Em cũng xin cảm ơn Phòng thí nghiệm Sinh Y, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein là nơi em thực hiện đề tài nghiên cứu cho luận văn thạc sỹ. Về phía cơ quan, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể Khoa Di truyền & SHPT, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương là nơi em đang công tác. Các anh chị luôn chia sẻ với em trong công việc, thường xuyên động viên về tinh thần giúp em vững tin trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Những kiến thức chuyên môn anh chị chia sẻ đã giúp em hoàn thiện luận văn tốt nhất có thể. Em xin chân thành cảm ơn NCS. Ngô Thị Hà và các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh Y đã giúp đỡ và cổ vũ em trong suốt thời gian qua. Đặc biệt em xin cảm ơn ThS.

Nguyễn Thị Thu Hường đã luôn kề bên động viên tinh thần, giúp đỡ tận tình mỗi khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn cũng như những vấn đề trong cuộc sống. Lời cuối em xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, người thân và bạn bè luôn ủng hộ, giúp đỡ em rất nhiều về cả vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2014 Học viên Trần Tuấn Anh BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ ADN : Acid Deoxyribonucleic ARN : Acid Ribonucleic bp : Base pair dNTP : Deoxynucleotide Triphosphates G6PD : Glucose-6-phosphate dehydrogenase kb : Kilobase MCH : Mean Cell Hemoglobin MCV : Mean Corpuscular Hemoglobin PCR : Polymerase Chain Reaction WHO : World Health Organization DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Cấu trúc cụm gen α-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 Hình 1. Những mất đoạn ADN là nguyên nhân gây α+-thalassemia 10 Hình 3.

Cơ chế hình thành 2 mất đoạn phổ biến gây α+-thalassemia 11 Hình 4. Những mất đoạn gây αo-thalassemia và vùng đứt gãy trên cụm gen α-globin 12 Hình 5. Sơ đồ xét nghiệm sàng lọc bệnh thalassemia 15 Hình 6. Sơ đồ thiết kế mồi phát hiện 5 mất đoạn phổ biến trong bệnh alpha thalassemia 23 Hình 7.

Sơ đồ nghiên cứu 26 Hình 8. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% 32 Hình 9. Kết quả tối ưu điều kiện cho đoạn α2 và đoạn nội kiểm LIS 33 Hình 10. Kết quả sàng lọc đột biến --SEA 34 Hình 11.

Kết quả sàng lọc đột biến --THAI 35 Hình 12. Kết quả sàng lọc và tối ưu điều kiện phản ứng PCR đơn khuếch đại đoạn -α3. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn SEA bằng cặp mồi 38 vector M13-F/R Hình 14. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn SEA bằng cặp mồi 39 SEA-F/R Hình 15.

Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 4.2 bằng cặp mồi vector M13-F/R 39 Hình 16. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 4.2 với cặp mồi 4.2-F/R 40 STT Tên hình Trang Hình 17. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp 40 Hình 18. Kết quả so sánh đoạn SEA với ngân hàng dữ liệu NCBI 41 Hình 19.

Kết quả so sánh đoạn 4.2 với ngân hàng dữ liệu NCBI 42 Hình 20. Kết quả tối ưu điều kiện phản ứng PCR với hai cặp mồi LIS và α2 44 Hình 21. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng ba cặp mồi LIS, α2, SEA 45 Hình 22. Kết quả tối ưu điều kiện phản ứng PCR sử dụng ba cặp mồi LIS, α2, 46 SEA Hình 23.

Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng bốn cặp mồi LIS, α2, SEA và 4. Kết quả tối ưu điều kiện phản ứng PCR với mồi α2/3.7-F mới thiết 49 kế Hình 25. Kết quả kiểm tra tính ổn định của mồi α2/3.7-F mới thiết kế 49 Hình 26. Kết quả tối ưu điều kiện PCR với 4 cặp mồi có bổ sung DMSO 51 Hình 27.

Kết quả sàng tối ưu PCR với 5 cặp mồi LIS, α2, SEA, α4. Kết quả PCR một số mẫu mang đột biến với quy trình PCR đa mồi tối ưu 53 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu và kích thước sản phẩm Bảng 1. 24 PCR tương ứng Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đơn mồi LIS, α2, SEA, Bảng 2. Thành phần và điều kiện nối đoạn đột biến vào vector pTZ5T-R/T 37 Thành phần và điều kiện sàng lọc khuẩn lạc với cặp mồi vector Bảng 4.

38 M13-F/R Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng hai cặp mồi LIS và Bảng 5. 43 α2 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng ba cặp mồi LIS, α2 Bảng 6. 45 và SEA Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tối ưu sử dụng ba cặp mồi Bảng 7. 46 LIS, α2 và SEA Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng bốn cặp mồi LIS, Bảng 8.

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi có bổ sung DMSO 50 Thành phần và điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR sử dụng 5 cặp Bảng 10. 52 mồi LIS, α2, SEA, α4. Tổng hợp số liệu đột biến 66 MỤC LỤC M Đ U. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

TỔNG QUAN VỀ BỆNH ALPHA THALASSEMIA. Sơ lược về bệnh thalassemia. Cơ chế sinh bệnh. Bệnh alpha thalassemia, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng.

Cơ sở phân tử bệnh alpha thalassemia. Cấu trúc và tổ chức cụm gen globin ở người. Cơ chế phát sinh đột biến. SÀNG LỌC NGƯỜI MANG GEN VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA THALASSEMIA.

Chiến lược sàng lọc người mang gen bệnh thalassemia. Các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán bệnh. Phương pháp huyết học. Phân tích thành phần hemoglobin.

Phân tích tỷ lệ tổng hợp chuỗi alpha/beta-globin. Phương pháp sinh học phân tử. PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA THALASSEMIA. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ. Đối tượng nghiên cứu. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương pháp xác định nồng độ ADN bằng đo quang phổ.

Kỹ thuật PCR đa mồi. Phương pháp điện di. Phương pháp tách dòng. Biến nạp bằng sốc nhiệt.

Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào bão hòa. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. ĐẶC ĐIỂM NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU. KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN ĐƠN.

Sàng lọc mất đoạn SEA. Sàng lọc hai mất đoạn THAI, FIL. Sàng lọc mất đoạn -α4. BIẾN NẠP, TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN ĐỘT BIẾN.

Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn đột biến SEA. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn đột biến α4. Kết quả giải trình tự đoạn đột biến. KẾT QUẢ TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI.

Tối ưu PCR với cặp mồi LIS và α2. Tối ưu PCR với 3 cặp mồi LIS, α2 và SEA. Tối ưu PCR với 4 cặp mồi LIS, α2, SEA và α4. Tối ưu PCR với 5 cặp mồi LIS, α2, SEA, α4.

KẾT QUẢ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN BẰNG PCR ĐA MỒI. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.61 TÀI LIỆU THAM KHẢO.62 Phụ lục 1 - Kết quả giải trình tự đoạn đột biến SEA.69 Phụ lục 2 - Kết quả giải trình tự đoạn đột biến α4.70 Phụ lục 3 - Kết quả phát hiện đột biến trên 100 mẫu bằng kỹ thuật PCR đa mồi 71 Phụ lục 4 - Bảng tổng hợp kết quả xét nghiệm cận lâm sàng.74 Phụ lục 5 - Những đột biến điểm gây α-thalassemia.79 Phụ lục 6 - Những đột biến alpha-thalassemia trong khu vực Đông Nam Á.80 M Đ U Hàng năm ước tính khoảng 7,9 triệu trẻ em (chiếm khoảng 6%) trên toàn thế giới sinh ra với di tật bẩm sinh nghiêm trọng có nguồn gốc di truyền. Theo thống kê năm 2001 có 5 dị tật bẩm sinh nghiêm trọng có nguồn gốc di truyền phổ biến nhất là: (1) bệnh tim bẩm sinh (1.835 trẻ), (2) dị tật ống thần kinh (323.904 trẻ), (3) rối loạn hemoglobin gồm thalassemia và bệnh hồng cầu hình liềm (307.897 trẻ), (4) hội chứng Down (217.293 trẻ), (5) thiếu hụt G6PD (177. Năm dị tật bẩm sinh này chiếm 25% trong tổng số 7.000 dị tật bẩm sinh do di truyền.

Trong những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu về mô hình bệnh trên trẻ em Việt Nam cho thấy các bệnh ung thư và bệnh di truyền ngày càng phát hiện nhiều và có xu hướng gia tăng. Đặc biệt nghiêm trọng là bệnh thalassemia, ước tính khoảng 5,3 triệu người mang gen bệnh, với 2.400 trẻ sinh ra mang gen bệnh hàng năm. Đây là nguyên nhân gây giảm chất lượng dân số và tăng gánh nặng chi tiêu ngân sách cho y tế. Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã xây dựng “Chương trình thalassemia quốc gia” nhằm hạn chế sự phổ biến của gen bệnh trong cộng đồng và giảm số trẻ sinh ra mang bệnh.

Theo chương trình này, việc sàng lọc trước hôn nhân và sàng lọc trước sinh với đối tượng nguy cơ cao là bắt buộc. Với đặc trưng dân số theo khu vực địa lý mà phác đồ sàng lọc ở mỗi quốc gia có thể khác nhau. Trong đó, xét nghiệm gen sẽ cho biết chính xác những đột biến và kiểu gen bệnh lý. Một trong những trở ngại lớn nhất là việc xác định đồng thời nhiều đột biến gen rất tốn kém chi phí và thời gian.