Khóa luận tốt nghiệp: Xa thị phƣơng thảo tổng hợp và thử tác dụng kháng tế

Nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của dẫn chất 6-benzylamino-2-phenyl quinazolin-4-on trong khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ 2019.

• Tác giả: Xa Thị Phương Thảo
• Người hướng dẫn: ThS. Hoàng Thu Trang
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 6-benzylamino-2-phenyl quinazolin-4-on
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Xa Thị Phương Thảo Tổng Hợp

Xa thị phương thảo tổng hợp là một khóa luận tốt nghiệp dược sĩ được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội vào năm 2019. Nghiên cứu này tập trung vào việc tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất 6-benzylamino-2-phenyl quinazolin-4-on. Công trình được hướng dẫn bởi ThS Hoàng Thu Trang và DS Nguyễn Thị Lai, với sự hỗ trợ từ Bộ môn Hóa Hữu cơ và Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Thuốc - Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đây là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực hóa học dược phẩm và nghiên cứu ung thư.

1.1. Mục Tiêu Nghiên Cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tổng hợp hóa học một loạt dẫn chất mới dựa trên khung cấu trúc quinazolin-4-on. Các dẫn chất được thiết kế với mục đích tăng cường hoạt tính kháng tế bào ung thư. Đồng thời, công trình cũng nhằm xác định cấu trúc chi tiết các hợp chất thông qua các phương pháp phân tích hiện đại như phổ NMR, MS và IR.

1.2. Ý Nghĩa Khoa Học

Khóa luận này có ý nghĩa đáng kể trong việc phát triển các thuốc chống ung thư mới. Các dẫn chất quinazolin-4-on đã được chứng minh có hoạt tính sinh học mạnh mẽ. Nghiên cứu góp phần vào kho tàng kiến thức về thiết kế thuốc hợp lý và cung cấp cơ sở khoa học cho các công trình tiếp theo trong lĩnh vực hóa dược.

II. Đối Tượng Nội Dung Và Phương Pháp Nghiên Cứu

Phương pháp nghiên cứu được áp dụng trong khóa luận bao gồm các kỹ thuật tổng hợp hóa học tiên tiến, xác định cấu trúc và thử nghiệm sinh học. Các dẫn chất được tổng hợp từ các chất trung gian như 5-benzylamino-2-nitrobenzamid và 2-amino-5-(benzylamino)benzamid. Công trình sử dụng các thiết bị phân tích hiện đại và tuân thủ các quy trình nghiên cứu khoa học tiêu chuẩn. Đối tượng nghiên cứu chính là các dẫn chất 6-benzylamino-2-phenylquinazolin-4-on với các biến thế khác nhau, ký hiệu từ 5a đến 5c.

2.1. Nguyên Vật Liệu Và Thiết Bị

Để thực hiện công trình, nhóm nghiên cứu sử dụng các hóa chất tinh khiết chuyên dùng và dung môi hữu cơ như DMSO, DMF, và EtOAc. Thiết bị thí nghiệm bao gồm máy phổ NMR, máy phổ khối lượng (MS), và thiết bị sắc ký lớp mỏng (TLC). Các tế bào ung thư được sử dụng trong thử nghiệm được cấp từ ATCC (American Type Culture Collection).

2.2. Phương Pháp Thử Hoạt Tính

Hoạt tính kháng tế bào ung thư được đánh giá bằng phương pháp MTT assay, một kỹ thuật in vitro phổ biến và chính xác. Phương pháp này cho phép xác định IC50 (nồng độ ức chế 50%) của các dẫn chất trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Kết quả giúp đánh giá tiềm năng sinh học của mỗi hợp chất và xác định những ứng viên tốt nhất cho các nghiên cứu lâm sàng tiếp theo.

III. Kết Quả Thực Nghiệm Và Khẳng Định Cấu Trúc

Kết quả tổng hợp cho thấy các dẫn chất 6-benzylamino-2-arylquinazolin-4-on được tạo thành thành công với hiệu suất chuyển hóa tốt. Các hợp chất được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và xác định nhiệt độ nóng chảy (Tonc). Khẳng định cấu trúc được thực hiện chi tiết thông qua các kỹ thuật phân tích: phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho thông tin về cấu trúc phân tử, phổ IR xác nhận các nhóm chức năng, và phổ MS xác định khối lượng phân tử chính xác. Tất cả dữ liệu phổ được tổng hợp trong các bảng 3.3 đến 3.6.

3.1. Tổng Hợp Chất Trung Gian

Quá trình tổng hợp bắt đầu từ chất trung gian 5-benzylamino-2-nitrobenzamid (2), tiếp theo là 2-amino-5-(benzylamino)benzamid (3). Các chất này được tinh chế bằng phương pháp kết tinh từ các dung môi thích hợp. Hiệu suất và độ tinh khiết của từng chất trung gian được kiểm soát chặt chẽ trước khi sử dụng cho giai đoạn tiếp theo của phản ứng.

3.2. Dữ Liệu Phổ Và Xác Định Cấu Trúc

Phổ 1H-NMR của các dẫn chất 5a-c cho thấy các tín hiệu rõ ràng tương ứng với các proton trên nhân quinazoline và các nhóm thế. Phổ 13C-NMR cung cấp thông tin về các loại carbon khác nhau trong phân tử. Phổ IR xác nhận sự hiện diện của các nhóm C=O, N-H và aromatic. Phổ MS xác định chính xác khối lượng phân tử của mỗi dẫn chất, xác minh tính nguyên vẹn của cấu trúc.

IV. Hoạt Tính Kháng Tế Bào Ung Thư Và Ý Nghĩa Lâm Sàng

Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất 6-benzylamino-2-phenylquinazolin-4-on được thử nghiệm chi tiết. Kết quả cho thấy các hợp chất 5a và 5b thể hiện hoạt tính sinh học đáng chú ý với IC50 thấp trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Các dẫn chất này có tiềm năng trở thành ứng viên thuốc trong tương lai. Cơ chế kháng ung thư của các quinazolin-4-on liên quan đến sự ức chế các protein kinase quan trọng hoặc tương tác với DNA topoisomerase. Những phát hiện này mở ra hướng nghiên cứu mới cho phát triển thuốc chống ung thư hiệu quả hơn.

4.1. Kết Quả Thử Hoạt Tính MTT

Phương pháp MTT được sử dụng để đánh giá độ độc tính của các dẫn chất trên các dòng tế bào ung thư. Bảng 3.7 và 3.8 trình bày kết quả định lượng với IC50 được tính toán từ các đường cong liều-đáp ứng. Các dẫn chất 5a và 5b cho thấy hiệu quả ức chế tế bào cao hơn so với các chất gốc, chỉ ra rằng quá trình tối ưu hóa cấu trúc đã thành công.

4.2. Cơ Chế Tác Dụng Và Triển Vọng

Các dẫn chất quinazolin-4-on được cho là hoạt động thông qua ức chế kinase hoặc topoisomerase, các enzyme quan trọng trong sự phân chia tế bào. Hiểu biết về cơ chế tác dụng này là nền tảng cho tối ưu hóa tiếp theo và phát triển các phiên bản cải thiện. Triển vọng lâm sàng của các hợp chất này rất lớn, hứa hẹn mang lại những phương pháp điều trị ung thư hiệu quả mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Tỉ lệ mắc và tử vong do bệnh lí ung thư đang gia tăng nhanh chóng trên toàn cầu trong thời gian gần đây. Theo ước tính GLOBOCAN của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), năm 2018 có khoảng 18,1 triệu ca mắc mới và 9,6 triệu ca tử vong do ung thư [41]. Tại Việt Nam, số trường hợp mắc mới ung thư năm 2012 là 125 000 người [12] và đã tăng lên gần 165 000 người vào năm 2018, với tỉ lệ mắc 151,4/100 000 dân [41]. Ung thư trở thành gánh nặng và là rào cản lớn để nâng cao tuổi thọ ở mọi quốc gia trên toàn cầu vào thế kỉ XXI.

Do đó, nghiên cứu và phát triển các thuốc điều trị ung thư đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học để tìm ra các thuốc có hiệu quả điều trị cao. Trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị ung thư mới, các hợp chất mang khung cấu trúc quinazolinon rất được quan tâm do có hoạt tính kháng ung thư tốt [9], [13], [34]. Do vậy, khung hợp chất này mở ra nhiều triển vọng trong nghiên cứu phát triển thuốc kháng tế bào ung thư mới có hiệu quả cao. Trong nhiều nghiên cứu, dãy hợp chất 2-arylquinazolin-4-on cho thấy khả năng kháng tế bào ung thư tiềm năng [3], [21], [42].

Mở rộng nghiên cứu về các hợp chất 2-arylquinazolin-4-on, các dẫn chất mang nhóm thế 6-alkylamino như 6-diethylamino, 6-butylamino, 6-pyrrolidinyl… được tổng hợp đã chứng minh hoạt tính kháng tế bào ung thư tương đối tốt trên một số dòng tế bào thử nghiệm [1], [2], [3], [4], [18], [32]. Tiếp nối kết quả của những nghiên cứu trước đây, nghiên cứu “Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thƣ của một số dẫn chất 6-benzylamino- 2-phenylquinazolin-4-on” được tiến hành với 2 mục tiêu: 1. Tổng hợp được một số dẫn chất 6-benzylamino-2-phenylquinazolin-4-on. Thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư người.

Hoạt tính kháng ung thƣ của các dẫn chất mang khung cấu trúc 2- arylquinazolin-4-on Quinazolin-4-on là một dẫn chất của quinazolin với nhóm thế oxo ở vị trí số 4. Khung cấu trúc này có mặt trong nhiều hợp chất thiên nhiên và trong tổng hợp hóa học. Dẫn chất 2-arylquinazolin-4-on mang khung cấu trúc quinazolin-4- on với nhóm thế aryl ở vị trí số 2. Khung cấu trúc 2-arylquinazolin-4-on Nhiều hợp chất thiên nhiên mang khung cấu trúc quinazolin-4-on được tìm thấy ở hàng trăm loài thực vật khác nhau [22], [25], [36].

Một số hợp chất có hoạt tính sinh học có thể kể đến như febrifugin được phân lập từ cây Dichroa febrifuga dùng điều trị sốt rét có hiệu quả hay các luotonin được phân lập từ loài Peganum nigellastrum Bunge (Zygophyllaceae) có tác dụng tốt trong điều trị bệnh thấp khớp, chống viêm, đặc biệt luotonin A có hoạt tính gây độc tế bào trong một số công bố gần đây [14], [29], [36], [38] (Hình 1. Cấu trúc của một số alkaloid mang khung quinazolin-4-on Khung cấu trúc quinazolin-4-on đã thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học do cấu trúc tương đối đơn giản và một số hợp chất mang khung cấu trúc này thể hoạt tính kháng tế bào ung thư tiềm năng [1], [2], [3], [4], -2- [14], [18], [21], [32], [42]. Các hợp chất này ức chế tế bào ung thư theo nhiều cơ chế khác nhau như ức chế KSP [26], thymidylat synthase [39], tankyrase [31], ức chế sự polyme hóa tubulin [17], [18], [19], ức chế topoisomerase [21]…. Một số hợp chất đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng và phát triển thành thuốc điều trị ung thư có hiệu quả (Bảng 1.Một số hoạt chất điều trị ung thư mang khung cấu trúc quinazolin-4-on.

Tên hoạt chất Cấu trúc hóa học – tác dụng Ispinesib Ức chế KSP [26] Nolatrexed Ức chế thymidylat synthase [39] Raltitrexed Ức chế dihydrofolat reductase [39] Bên cạnh các hoạt chất đang thử nghiệm lâm sàng và đã được đưa vào điều trị, nhiều nghiên cứu vẫn tiếp tục tìm kiếm các hợp chất mang khung cấu trúc quinazolin-4-on hướng tác dụng kháng ung thư với mong muốn tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính cao. Nhóm các nhà khoa học tại Mĩ đã công bố kết quả nghiên cứu về khả năng ức chế sự polyme hóa tubulin và ức chế sinh trưởng tế bào bạch cầu chuột (L1210) của các hợp chất 2-styrylquinazolin-4(3H)-on đã tổng hợp được. Phần lớn các dẫn chất đều có hoạt tính tương đối mạnh trên thử nghiệm in vitro và -3- cho thấy khả năng ức chế sự polyme hóa tubulin. Trong đó chất Ia cho thấy hoạt tính ức chế polyme hóa tubulin và L1210 mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 2,0 ± 0,4 μM và 0,001 μg/mL [19].

Dẫn chất 2-styrylquinazolin-4(3H)-on Năm 2000, Mann-Jen Hour cùng các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của dẫn chất 2-phenylquinazolin- 4-on. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng ung thư cũng như khả năng ức chế sự polyme hóa tubulin cho thấy 5 dẫn chất 2-phenylquinazolin-4-on với các nhóm thế ở vị trí số 6 cho khả năng gây độc tế bào đáng kể trên một số dòng tế bào ung thư với giá trị EC50 trong khoảng từ μM đến nM. Sử dụng 2-(3’-methoxyphenyl)-6-pyrrolidinylquinazolin-4-on (JJC-1) là chất dẫn đường, nhóm nghiên cứu trên đã thiết kế tổng hợp các dẫn xuất 6- pyrrolidinyl-2-(2-substituted phenyl)quinazolin-4-on và thử độc tính trên 6 dòng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy các dẫn chất có độc tính đáng kể đối với các dòng tế bào máu (U937 và WEHI-3) với giá trị EC50 từ 0,3 – 10,10 μM tuy nhiên ít có độc tính trên các dòng tế bào gan (Hep-G2, Hep-3B) và phổi (A549, CH27).

Tác giả nhận thấy các nhóm thế ở vị trí số 2 của vòng thế phenyl như -F, -Cl, -Br, -OCF3, -OH và -OCH3 cho độc tính tương đương JJC-1 trên dòng tế bào U937 và mạnh gấp nhiều chất dẫn đường lần trên dòng tế bào WEHI-3 [18] (Bảng 1. Độc tính của các dẫn chất 6-pyrrolidinyl-2-(2- substitutedphenyl)quinazolin-4-on và JJC-1 -4- Hợp chất Giá trị IC50 (μM) R2’ U937 WEHI-3 -F 0,51 0,75 -Cl 0,48 0,54 -Br 0,45 0,89 -OCF3 0,38 0,59 6-pyrrolidinyl-2-(2- -OH 0,40 0,30 substitutedphenyl)quinazolin-4-on -OCH3 0,35 0,47 0,34 8,89 Năm 2005, Voelter cùng cộng sự đã tiến hành tổng hợp một dãy các hợp chất mang khung 2-aryl-7-floro-6-(4-methyl-1-piperazinyl)quinazolin-4(3H)-on và đánh giá hoạt tính kháng ung thư trên 3 dòng thế bào ung thư gồm MCF-7 (vú), NCI-H460 (phổi) và SF-268 (thần kinh). Kết quả cho thấy, 3 trong số 8 hợp chất tổng hợp được có hoạt tính kháng ung thư tốt trong đó hợp chất IIa có hoạt tính chọn lọc trên dòng tế bào ung thư phổi (NCI-H460) với khả năng phát triển của tế bào ung thư sau thử nghiệm với hợp chất này là 1%, hợp chất IIb cho hoạt tính kháng ung thư tốt trên cả 3 dòng tế bào [5] (Hình 1. 2-aryl-7-floro-6-(4-methyl-1-piperazinyl)quinazolin-4-on và dẫn chất Nhóm nghiên cứu của Michael D.

Threadgill tại Đại học Bath - Vương quốc Anh đã sử dụng XAV939 – một chất có khả năng ức chế mạnh tankyrase (TNKS) (với TNKS-1 IC50 = 11 nM và TNKS-2 IC50 = 4 nM) là chất dẫn đường, nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất mang -5- khung 2-arylquinazolin-4-on hướng ức chế tankyrase - một poly(ADP- ribose)polymerases (PARPs) được biểu hiện quá mức trong một số bệnh lí ung thư trên lâm sàng. Các hợp chất tổng hợp được đều có hoạt tính tương đối mạnh và chọn lọc trên TNKS. 4 trong số các hợp chất đã tổng hợp mang nhóm thế 2- phenyl cho thấy khả năng ức chế mạnh TNKS-2 với IC50 từ 3,3 đến 6,7 nM [31] (Hình 1. Dẫn chất 2-arylquinazolin-4-on hướng ức chế tankyrase Trong một nghiên cứu khác, Khalid Mohammed Khan, M.

Iqbal Choudhary cùng cộng sự đã tổng hợp các hợp chất 2-arylquinazolin-4(3H)-on và đánh giá khả năng ức chế thymidine phosphorylase (TP) – một enzyme đóng vai trò quan trọng trong một số bệnh lí, trong đó có vai trò trong tạo mạch khối u (tumor angiogenesis). 6 trong số 25 hợp chất tổng hợp được có hoạt tính ức chế TP, trong đó chất III với nhóm thế 2-(3,4-dihydroxyphenyl) có hoạt tính mạnh nhất (IC50 = 42.0 μM), tương đương với chất đối chứng 7-deazaxanthin (IC50 = 41. Dẫn chất 2-arylquinazolin-4(3H)-on -6- Năm 2015, Marwa F. Ahmed và Amany Belal đã thiết kế nghiên cứu tổng hợp các hợp chất 2-(furan-2-yl)quinazolin-4-on và đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư trên 3 dòng tế bào Hep-G2, HCT116, và MCF-7 theo phương pháp sulforhodamine-B (SRB) với chất đối chứng chuẩn là doxorubicin.

Kết quả cho thấy, hầu hết các hợp chất tổng hợp được đều có khả năng gây độc tế bào mạnh trên các dòng tế bào. Đặc biệt IVa và Va có hoạt tính mạnh trên dòng tế bào Hep-G2, IVa có khả năng chọn lọc trên dòng tế bào MCF-7 và IVb, IVc, Vb có tác dụng chủ yếu trên dòng tế bào HCT116 với các giá trị IC50 thấp hơn 10 nM. Các hợp chất này tiếp tục được đem đánh giá khả năng ức chế EGFR tyrosine kinase (EGFR-TK) với chất đối chứng chuẩn là erlotinib trong đó IVb có khả năng ức chế mạnh nhất (84%) [7] (Hình 1.7) IVa: IC50 = 8,31 ± 0,29 nM Ar = 2-HO-C6H4- (Hep-G2) IC50 = 6,49 ± 0,28 nM (MCF-7) IVb: Ar = C6H5- IC50 = 7,67 ± 0,97 nM (HCT116) IVc: IC50 = 6,63 ± 0,18 nM Ar = 2-MeO-C6H4- (HCT116) Va: R = -OMe IC50 = 8,51 ± 0,2 nM (Hep-G2) Ar = 4-MeO-C6H4 Vb: R = H IC50 = 2,86 ± 0,43 nM Ar = C6H5- (HCT116) Hình 1. Dẫn chất 2-(furan-2-yl) quinazolin-4-on Gần đây, nhóm nghiên cứu của Mohamed F.

Zayed và các cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất mang khung cấu trúc 2-phenylquinazolin-4-on kết hợp với các L-amino acid. Các hợp chất được thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung -7- thư trên 2 dòng tế bào MCF-7 và MDA-MB-231 đều cho hoạt tính tốt, đặc biệt VIa cho hoạt tính tốt trên dòng tế bào MCF-7 (IC50 = 0,44 ± 0,01μM) và VIb có hoạt tính nổi trội trên dòng tế bào MDA-MB-231 (IC50 = 0,43 ± 0,02μM) so với erlotinib đối chứng [44] (Hình 1. Dẫn chất 2-phenylquinazolin-4-on Tại Việt Nam nhiều nghiên cứu cũng đã được tiến hành để tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của nhóm hợp mang khung cấu trúc 2- arylquinazolin-4-on. Năm 2014, nghiên cứu của Nguyễn Thị Huyền đã tổng hợp các hợp chất 2-arylquinazolin-4-on sử dụng phương pháp nhóm thế đẳng cấu sinh học trong thiết kế thuốc để phát triển cấu trúc hóa học của dẫn chất 3-arylisoquinolinon.

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên 4 dòng tế bào cho thấy 9/14 chất tổng hợp được có hoạt tính sinh học trên cả 4 dòng tế bào và phát hiện hợp chất mang nhóm thế 6-dimethylamino và 2-naphtalen-1-yl có hoạt tính kháng tế bào ung thư rất tốt với IC50 trên các dòng tế bào KB, Hep-G2, LU và MCF-7 lần lượt là 0,051 μg/mL; 0,096 μg/mL; 0,125 μg/mL và 0,5 μg/mL [4] (Sơ đồ 1.