Khóa luận tốt nghiệp Y tế: Võ thị chinh nghiên cứu chiết xuất cao rễ đan

Khóa luận nghiên cứu quy trình chiết xuất cao rễ đan sâm giàu tanshinon, đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng trong dược phẩm chức năng.

• Tác giả: Võ Thị Chinh
• Người hướng dẫn: ThS. Trần Trọng Biên
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Chiết Xuất Cao Rễ Đan Sâm Giàu Các Hoạt Chất Nhóm Tanshinon
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Đan sâm và các hoạt chất nhóm Tanshinon

Đan sâm là một trong những cây dược liệu quý giá trong y học cổ truyền Đông Á, đặc biệt là ở Việt Nam và Trung Quốc. Rễ đan sâm chứa nhiều hoạt chất sinh học có tác dụng bảo vệ sức khỏe tim mạch và chống viêm. Nghiên cứu khóa luận của Võ Thị Chinh tập trung vào chiết xuất cao rễ đan sâm giàu tanshinon, một nhóm diterpenoid quan trọng. Tanshinon IIA và cryptotanshinon là hai hoạt chất chính có hàm lượng cao nhất. Các thành phần này có khả năng hạ cholesterol LDL, cải thiện lưu thông máu và chống oxy hóa mạnh mẽ. Việc nghiên cứu này nhằm phát triển phương pháp hiệu quả để tách chiết và làm giàu các hoạt chất quý giá từ dược liệu tự nhiên.

1.1. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học

Cây đan sâm phân bố chủ yếu ở khu vực núi đá vôi, có khả năng thích ứng với đất chua. Rễ chứa hơn 50 hợp chất hoạt động, bao gồm diterpenoid tanshinon, acid phenolic, và polysaccharide. Tanshinon là nhóm chất chính với nồng độ 1-3% trên khối lượng khô, có tác dụng bảo vệ tim mạch và chống viêm hiệu quả.

1.2. Ứng dụng lâm sàng của tanshinon

Các hoạt chất tanshinon được sử dụng trong điều trị bệnh mạch vành, đau thắt ngực và suy tim. Nghiên cứu lâm sàng cho thấy tanshinon IIA có thể cải thiện tình trạng mạch máu và giảm tổn thương cơ tim. Điều này làm tăng giá trị kinh tế và nhu cầu sản xuất cao đan sâm tiêu chuẩn trên thị trường.

II. Phương pháp chiết xuất và làm giàu hoạt chất tanshinon

Khóa luận của Võ Thị Chinh sử dụng phương pháp chiết xuất bằng dung môi hữu cơ kết hợp với nhựa hấp phụ macroporous để tách chiết và làm giàu tanshinon. Quá trình chiết xuất được tối ưu hóa thông qua khảo sát các yếu tố như kích thước nguyên liệu, số lần chiết, và nồng độ dung môi. Nhựa macroporous được sử dụng để hấp phụ chọn lọc các hoạt chất tanshinon từ cao thô, giúp loại bỏ các tạp chất và tăng nồng độ hoạt chất lên tới 15-20 lần. Phương pháp này hiệu quả, an toàn và bảo vệ môi trường, thích hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp.

2.1. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất

Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng kích thước hạt đến hiệu suất chiết, cho thấy hạt nhỏ 0,5-1mm cho hiệu suất tốt nhất. Số lần chiết 3-4 lần với ethanol 70% đạt hiệu suất chiết tối ưu 8-10% theo khối lượng. Nhiệt độ chiết 60-70°C trong 2 giờ là điều kiện lý tưởng để tối đa hóa hàm lượng tanshinon.

2.2. Ứng dụng nhựa macroporous trong làm giàu hoạt chất

Nhựa macroporous polystyrene có khả năng hấp phụ chọn lọc cao đối với các hoạt chất tanshinon. Quá trình giải hấp phụ bằng ethanol 95% cho phép tách chiết các hoạt chất với độ tinh sạch cao. Phương pháp này giảm tác động hóa chất và tăng hiệu suất recovery so với các phương pháp truyền thống.

III. Quy trình phân tích và kiểm định chất lượng cao Đan sâm

Để đảm bảo chất lượng cao đan sâm giàu tanshinon, khóa luận sử dụng phương pháp HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) để định lượng tanshinon IIA và cryptotanshinon. Phương pháp phân tích được thẩm định bằng cách đánh giá độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác và độ lặp lại. Kết quả cho thấy hệ thống phân tích đáp ứng các yêu cầu khắt khe về chất lượng. Hàm lượng tanshinon IIA trong cao sau tinh chế đạt 12-15%, trong khi cryptotanshinon đạt 8-10%, tăng đáng kể so với cao thô ban đầu chỉ có 1-2%.

3.1. Phương pháp HPLC định lượng tanshinon

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp chính xác, nhạy cảm để phân tích và định lượng hoạt chất tanshinon. Cột Hypersil ODS kích thước 250×4.6mm với dòng chảy 1ml/phút và phát hiện UV 254nm cho phân tách tốt các hoạt chất. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) <5% cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao và tin cậy cho phân tích thường xuyên.

3.2. Đánh giá khoảng tuyến tính và độ chính xác

Khoảng tuyến tính của phương pháp từ 20-200 µg/ml với hệ số tương quan (R²) > 0.99, cho phép định lượng chính xác trong dải nồng độ rộng. Độ chính xác được kiểm định qua phục hồi (recovery) 98-102%, đáp ứng yêu cầu về phương pháp phân tích tin cậy cho kiểm định chất lượng sản phẩm.

IV. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu Võ Thị Chinh

Nghiên cứu chiết xuất cao rễ đan sâm giàu tanshinon của Võ Thị Chinh có ý nghĩa khoa học và thương mại quan trọng. Phương pháp được phát triển hiệu quả, kinh tế và thân thiện môi trường, phù hợp để sản xuất quy mô công nghiệp. Cao đan sâm tiêu chuẩn với hàm lượng hoạt chất cao có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng mới. Nghiên cứu này góp phần vào việc tối ưu hóa việc sử dụng dược liệu quý giá, nâng cao giá trị gia tăng và phát triển bền vững ngành dược liệu. Kết quả quy trình tinh chế mở ra hướng đi mới cho công nghiệp dược Việt Nam trong lĩnh vực chiết xuất và làm giàu hoạt chất từ tự nhiên.

4.1. Ứng dụng trong sản xuất dược phẩm hiện đại

Cao đan sâm giàu tanshinon có thể được sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất viên nang, xịt, hay các sản phẩm dạng lỏng với hàm lượng hoạt chất chuẩn hóa. Phương pháp định lượng HPLC đảm bảo kiểm soát chất lượng từng lô sản phẩm. Tiêu chuẩn hoá này nâng cao cơ hội xuất khẩu các sản phẩm dược phẩm Việt Nam ra thị trường quốc tế.

4.2. Hướng phát triển và đề xuất tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào khảo sát độc tính và tác dụng dược lý của cao tinh chế trên mô hình động vật thí nghiệm. Thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân suy tim hay bệnh mạch vành sẽ xác thực tính hiệu quả. Quy trình sản xuất cần được tối ưu hóa thêm để giảm chi phí và tăng khả năng cạnh tranh trên thị trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) là một dược liệu quý thuộc chi Salvia L., họ Hoa môi (Lamiaceae). Rễ Đan sâm đã được sử dụng từ rất lâu trong y học cổ truyền làm thuốc hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, thanh tâm lương huyết [4]. Tanshinon là tên gọi chung để chỉ nhóm các hoạt chất diterpenoid thân dầu có trong rễ Đan sâm (tanshinon IIA, cryptotanshinnon, tanshinon I, dihydrotanshinon…) với nhiều tác dụng sinh học nổi bật như: giãn mạch vành, tăng tuần hoàn máu [42], chống oxy hóa, giảm cholesterol máu [11]… Hiện nay, đã có hơn 40 tanshinon được phân lập và xác định, trong đó tanshinon IIA và cryptotanshinon là hai thành phần có hàm lượng và hoạt tính đáng kể nhất và thường được sử dụng làm chất đánh dấu cho nhóm hoạt chất này trong kiểm tra chất lượng dược liệu và các sản phẩm chiết từ rễ Đan sâm [12]. Đối với cao dược liệu nói chung, tác dụng sinh học có được là nhờ sự kết hợp đồng thời của nhiều hoạt chất có mặt trong thành phần cao.

Để điều chế các cao dược liệu giàu hoạt chất, nhiều phương pháp tinh chế dịch chiết đã được nghiên cứu và áp dụng như phương pháp kết tủa (do thay đổi dung môi, pH, nhiệt độ…), trao đổi ion hay phương pháp hấp phụ…Trong đó, phương pháp hấp phụ sử dụng nhựa macroporous được ứng dụng nhiều trong làm giàu các hợp chất tự nhiên do có khả năng hấp phụ chọn lọc nhiều nhóm phân tử mục tiêu và hầu hết đều sử dụng các dung môi "xanh" như nước và ethanol [22]. Dược điển Trung Quốc 2015 có chuyên luận “Tanshinones”, trong đó quy định hàm lượng tanshinon IIA và cryptotanshinon có trong sản phẩm chiết không được ít hơn 9,8% và 2,1% tương ứng [7]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về nhóm tanshinon chủ yếu tiến hành phân lập các đơn chất có độ tinh khiết cao bằng các kỹ thuật như kỹ thuật sắc ký lọc gel [35], sắc ký hấp phụ ngược dòng tốc độ cao [39]… Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào xây dựng được quy trình điều chế cao rễ Đan sâm giàu các hoạt chất nhóm tanshinon đạt tiêu chuẩn nêu trên mặc dù Đan sâm đã được gây giống từ lâu và cho sản lượng cao ở nhiều vùng như Hà Giang, Sa Pa, Hưng Yên, Tam Đảo [1]. Do đó, đề tài “Nghiên cứu chiết xuất cao rễ Đan sâm giàu các hoạt chất nhóm tanshinon” được thực hiện với các mục tiêu: 1.

Khảo sát được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất và làm giàu nhóm hoạt chất tanshinon từ rễ Đan sâm. Xây dựng được quy trình điều chế cao rễ Đan sâm giàu các hoạt chất nhóm tanshinon, đạt hàm lượng tanshinon IIA ≥ 9,8% và cryptotanshinon ≥ 2,1%. 1 TỔNG QUAN Thông tin về Đan sâm Đặc điểm thực vật và phân bố Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge., thuộc chi Salvia, họ Hoa môi Lamiaceae, bộ Labiatae. Đan sâm còn hay được gọi là Huyết sâm, Xích sâm, Huyết căn, sở dĩ có tên như vậy là vì rễ cây này giống sâm mà lại có màu đỏ (Đan là đỏ).

Chi Salvia là một chi lớn trong họ Lamiaceae, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới. Chi có ít loài ở vùng nhiệt đới. Đan sâm Việt Nam có nguồn gốc từ Trung Quốc, mới được di thực vào nước ta. Hiện nay, Đan sâm đã được gây giống ở Tam Đảo, Hưng Yên, Hà Giang, Sa Pa [1].

Đặc điểm thực vật: Đan sâm là loại cây sống lâu năm, cao 30 – 80 cm, đường kính 0,5 – 1,5 cm. Lá kép mọc đối, gồm 3 – 5 lá chét, mặt trên lá chét màu xanh. Cụm hoa mọc thành chum ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10 – 20 cm. Hoa mọc vòng, mỗi vòng có 3 – 10 hoa, thường là 5 hoa.

Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2 môi, môi trên hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy. Hai nhị ở hai môi dưới, bầu có vòi dài lồi ra ở môi trên. Quả nhỏ dài 3mm, rộng 1,5mm [1]. Bộ phận dùng: Dược liệu đan sâm (Radix salviae miltiorrhiza) là rễ phơi khô hay sấy khô của cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge).

Rễ ngắn, thô, hình trụ dài, hơi cong, dài 10-20 cm, đường kính 0,3-1 cm. Bên ngoài màu nâu đỏ hoặc nâu nhạt, có vân nhăn dọc, phần vỏ bám chặt vào gỗ không dễ bóc ra. Kết cấu cứng, giòn và dễ vỡ; phần gỗ màu vàng xám hoặc nâu tía, cho thấy các bó mạch màu vàng nhạt, xuyên tâm. Chất chắc, mặt bẻ gãy tương đối phẳng, hơi có dạng chất sừng.

Mùi nhẹ, vị đắng và tương đối cay [4]. Tác dụng - Theo y học cổ truyền: đan sâm vị đắng, tính mát, quy kinh tâm, can; công năng hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, thanh tâm lương huyết; chủ trị kinh nguyệt không đều, kinh nguyệt bế tắc, hành kinh đau bụng, huyền tích hòn cục, tâm phiền mất ngủ, đau thắt ngực [4]. - Theo y học hiện đại: Đan sâm đã được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh về mạch máu, bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, tăng lipid máu và đột quỵ ở nhiều nước trên thế giới [8], [18]. Các thuộc tính có lợi của Đan sâm cũng bao gồm cải thiện lưu lượng máu và giải quyết ứ máu [27].

2 + Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi sưng to do bệnh gan và huyết hấp trùng, có tác dụng an thần, gây ngủ và tác dụng làm giảm các huyết quản nhỏ [6]. + Đan sâm có tác dụng trên hệ tim mạch, làm giãn các động mạch và tĩnh mạch nhỏ, mao mạch, tăng cường tuần hoàn vi mạch, làm giảm mức độ nhồi máu cơ tim, có tác dụng bảo vệ trong chứng thiếu máu cơ tim cục bộ, bảo vệ tim, chống lại những rối loạn về chức năng và chuyển hóa gây ra bởi thiếu hụt oxy [2]. + Tác dụng chống oxy hóa của Đan sâm thể hiện trên cơ sở: loại các gốc tự do có hại cho cơ thể, ức chế sự oxy hóa LDL, ức chế tổng hợp cholesterol ở tế bào giúp hạ lipid máu [28]. Đan sâm cũng có tác dụng ổn định màng hồng cầu, tăng sức đề kháng của hồng cầu, chống huyết khối [1].

+ Ngoài ra Đan sâm còn dùng chữa bệnh vàng da, rối loạn kinh nguyệt, chảy máu tử cung, vô kinh, đau kinh, có tác dụng an thai, chữa viêm đau khớp cấp, có tác dụng an thần, giảm đau, ức chế sự phát triển của vi khuẩn: lao, E. Coli, thương hàn, bệnh Alzheimer, Parkinson, chống ung thư…[1]. Thành phần hóa học Thành phần hóa học chính có trong Đan sâm bao gồm diterpenoid, acid phenolic, flavonoid và một số thành phần khác. Các tanshinon Tanshinon là tên gọi chung để chỉ nhóm các hợp chất diterpenoid thuộc nhóm ortho- quinon, một nhóm chất có nhiều tác dụng sinh học và tạo ra màu của Đan sâm [42].

Hiện tại, có hơn 40 tanshinon đã được phân lập và xác định [14]. Trong số các tanshinon này, tanshinon IIA, cryptotanshinon, dihydrotanshinon và tanshinon I là các diterpen chính có trong Đan sâm [40]. 3 Tanshinon IIA Cryptotanshinon Dihydrotanshinon Tanshinon I Hình 1.1 Cấu trúc một số diterpenoid có trong rễ cây Đan sâm ❖ Tanshinon IIA Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA - Tính chất vật lý: bột màu đỏ, rất ít tan trong nước, tan tốt trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ethyl acetat, dimethyl sulfoxid,. - Tính chất hóa học: Trong phân tử có nhóm lacton và ceton nên dễ bị khử hóa mở vòng dưới tác động của các tác nhân nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm.

Tanshinon IIA ổn định tốt ở điều kiện pH 2-6. Ở pH 8-10, hàm lượng tanshinon IIA bị giảm nhẹ [47]. Độ ổn định của tanshinon IIA trong quá trình chiết ở các nhiệt độ khác nhau đã được nghiên cứu. Hiệu suất chiết tanshinon IIA sau 48 giờ chiết bằng ethanol ở nhiệt độ phòng, 60°C và 80°C lần lượt là 96,7%; 94,2% và 70,1%.

Kết quả cho thấy tanshinon IIA bị phân hủy một phần bởi nhiệt độ cao trong quá trình chiết xuất [25]. - Tác dụng sinh học: Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon IIA có tác dụng làm giảm đáng kể kích thước vùng nhồi máu. Cơ chế có thể do khả năng dọn gốc tự do ở màng ty thể tim. Tanshinon IIA ức chế quá trình oxy hóa LDL và hoạt động của angiotensin II, từ đó làm giảm phì đại tế bào cơ tim [17].

Tanshinon IIA cũng đã được chứng minh có tác dụng hạ lipid máu [20]; ức chế viêm, chống oxy hóa [28]; ổn định màng hồng cầu, tăng sức đề kháng của hồng cầu, chống huyết khối [2].3 Cấu trúc hóa học của cryptotanshinon - Tính chất vật lý: bột màu cam nâu, không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi hữu cơ như dimethyl sulfoxid, cloroform, ethanol, methanol, ether…, và chuyển sang màu đỏ khi tương tác với acid sulfuric đậm đặc. Ngoài ra, độ hòa tan của cryptotanshinon ít bị thay đổi trong khoảng pH từ 2 – 8 [31]. - Tính chất hóa học: cryptotanshinon thuộc dẫn xuất phenanthraquinon, khi tiếp xúc với ánh sáng sẽ xảy ra phản ứng quang hóa. Do đó, cryptotanshinon cần được bảo vệ tránh ánh sáng và dưới điều kiện khô mát (2- 8°C).

Cryptotanshinon ổn định tốt ở điều kiện pH 2-6. Ở pH 8-10, hàm lượng của cryptotanshinon bị giảm đáng kể [24]. - Tác dụng sinh học: cryptotanshinon phân lập từ rễ Đan sâm có hoạt tính kháng khuẩn mạnh [47], chống oxy hóa, chống viêm và chống ung thư [10]. Hoạt động của cryptotanshinon cũng có thể ức chế các tế bào sản xuất endothelia endothelin-1 và tạo ra sự khác biệt của một số tế bào như các tế bào gốc trong mô tủy xương [16].

Các acid phenolic Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước của Đan sâm. Hơn 30 acid phenolic đã được phân lập từ Đan sâm bao gồm acid salvianolic A, acid salvianolic B, acid salvianolic C, acid rosmarinic, acid protocatechuic, protocatechualdehyd, carnosol hoặc danshensu, acid lithospermic và các dẫn xuất khác [28]. Protocatechuic Protocatechualdehyd Acid caffeic 5 Danshensu Acid rosmarinic Acid salvianolic Hình 1.4 Cấu trúc một số acid phenolic Các thành phần khác Các hợp chất khác thu được từ cao chiết bằng ethanol như sitosterol, baicalin, ursolic acid và daucosterol; trong khi vitamin E, tannin và 5,31-dihydroxy-7,41-dimethoxy flavanon được phân lập từ dịch chiết ethyl acetat [21]. Các phương pháp chiết xuất và làm giàu tanshinon từ rễ Đan sâm Các phương pháp chiết xuất Chiết xuất là bước đầu tiên trong quy trình điều chế các cao dược liệu có hàm lượng hoạt chất cao.

Do đó, việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm tạo thành.