Sàng lọc chủng vi khuẩn quang dưỡng tía có khả năng hấp thu muối hiệu quả

Toàn văn đồ án sàng lọc và định danh chủng vi khuẩn quang dưỡng tía có khả năng hấp thu muối, ứng dụng tiềm năng trong xử lý môi trường nhiễm mặn.

• Tác giả: Nguyễn Thị Diễm My
• Người hướng dẫn: Thạc Sĩ Ngô Đức Duy
• Trường học: Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Sàng Lọc Chủng Vi Khuẩn Quang Dưỡng Tía Có Khả Năng Hấp Thu Muối
• Loại tài liệu: Đồ Án Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Vi khuẩn quang dưỡng tía và đặc điểm sinh học

Vi khuẩn quang dưỡng tía là một nhóm vi sinh vật có khả năng sử dụng ánh sáng làm nguồn năng lượng để thực hiện các quá trình sinh học. Những loại vi khuẩn này được phát hiện trong các môi trường aquatic có nồng độ muối cao, đặc biệt là ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long và các khu vực ven biển. Vi khuẩn quang dưỡng tía sở hữu những sắc tố quang hợp độc đáo giúp chúng thích ứng với các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Chúng có vai trò quan trọng trong chu trình biogeochemical của các hệ sinh thái nước mặn. Công nghệ sinh học hiện đại cho phép các nhà khoa học phân lập, định danh và nghiên cứu các đặc tính của những loài vi khuẩn này, mở ra những ứng dụng tiềm năng trong xử lý tài nguyên nước và bảo vệ môi trường.

1.1. Đặc điểm hình thái và phân loại

Vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh là một phân nhóm quan trọng có khả năng sử dụng các yếu tố khác để khử muối. Chúng thường có hình dạng cầu hoặc rod, với kích thước dao động từ 0.5-3 micromet. Nhuộm Gram cho kết quả âm tính, và những vi khuẩn này phát triển tốt trong môi trường có pH trung tính đến hơi kiềm. Sắc tố chứa trong chúng tạo nên màu tía đặc trưng, là chứng chỉ của hàm lượng bacteriochlorophyll cao.

1.2. Cơ chế quang hợp độc đáo

Khác với thực vật xanh, vi khuẩn quang dưỡng tía sử dụng cơ chế quang hợp anoxygenic, không sinh ra oxy. Chúng chứa các cấu trúc màng gọi là thylakoid hoặc chromatophore nơi xảy ra phản ứng ánh sáng. Những vi khuẩn này có thể sử dụng các chất khác nhau làm electron donor, bao gồm H2S, S, hay các hợp chất hữu cơ, làm cho chúng vô cùng linh hoạt trong các môi trường đa dạng.

II. Khả năng hấp thu muối của vi khuẩn quang dưỡng tía

Một trong những ứng dụng tiềm năng nhất của vi khuẩn quang dưỡng tía là khả năng hấp thu muối NaCl từ nước mặn. Nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt Đới cho thấy rằng những chủng vi khuẩn này có cơ chế chuyên biệt để hấp thụ và tích lũy các ion Na+ và Cl-. Quá trình sàng lọc chủng vi khuẩn chịu mặn đã xác định được những dòng có khả năng hấp thu muối tối ưu. Điều này mở ra triển vọng ứng dụng trong xử lý nước nhiễm mặn ở các vùng bị xâm nhập mặn, đặc biệt là ở Đồng bằng sông Cửu Long. Các kỹ thuật định danh sinh học phân tử sử dụng PCR và trình tự gene 16S rDNA đã giúp xác định chính xác các loài vi khuẩn này.

2.1. Cơ chế hấp thu Na và Cl

Vi khuẩn quang dưỡng tía sở hữu các bơm ion chuyên biệt và cơ chế osmotic adjustment độc đáo. Chúng tích lũy các muối vô cơ bên trong tế bào thông qua các protein vận chuyển màng cục bộ. Quá trình này tiêu tốn năng lượng ATP nhưng cho phép chúng duy trì cân bằng nước và tồn tại trong nước mặn có nồng độ cao. Năng lượng từ quang hợp giúp cung cấp ATP cần thiết cho quá trình vận chuyển này.

2.2. Ứng dụng trong xử lý nước mặn

Sử dụng chủng vi khuẩn quang dưỡng tía có khả năng hấp thu muối cao là giải pháp sinh học tiềm năng cho vấn đề xâm nhập mặn. Các chủng này có thể được nuôi cấy trong các bể sinh học để loại bỏ muối từ nước nhiễm mặn. Phương pháp này thân thiện môi trường hơn so với các phương pháp hóa học truyền thống, không sinh ra chất thải nguy hại, và có chi phí vận hành thấp.

III. Phương pháp định danh sinh học phân tử

Định danh sinh học phân tử là kỹ thuật hiện đại để xác định chính xác các loài vi khuẩn quang dưỡng tía. Phương pháp này dựa trên phân tích trình tự DNA, đặc biệt là gene 16S rDNA, một vùng gen có độ bảo thủ cao giữa các loài khác nhau. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để nhân bản và khuếch đại các đoạn gene này. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick và kiểm tra trên gel agarose. Trình tự DNA thu được được so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST để xác định loài. Phương pháp này đảm bảo độ chính xác cao và là tiêu chuẩn quốc tế trong định danh vi sinh vật.

3.1. Quy trình tách chiết DNA

Tách chiết DNA vi khuẩn bắt đầu bằng lysis tế bào sử dụng dung dịch CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide). DNA được tách từ các chất khác bằng phương pháp hóa học, sau đó rửa sạch với ethanol và hòa tan trong nước cất. Chất lượng DNA được kiểm tra bằng quang phổ UV để đảm bảo độ tinh sạch A260/A280 ≥ 1.8. DNA lưu trữ ở -20°C để bảo vệ khỏi suy thoái.

3.2. Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh loài

Sau khi thu được trình tự 16S rDNA, các nhà khoa học sử dụng công cụ BLAST của NCBI để tìm kiếm các trình tự tương tự trong ngân hàng dữ liệu toàn cầu. Căn cứ trên độ tương đồng, loài vi khuẩn được xác định. Xây dựng cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ tiến hóa giữa các chủng khác nhau, giúp nhóm chúng thành các nhóm phân loại thích hợp.

IV. Ứng dụng thực tiễn và triển vọng phát triển

Vi khuẩn quang dưỡng tía có khả năng hấp thu muối mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn quan trọng cho Việt Nam. Ở các vùng xâm nhập mặn như Đồng bằng sông Cửu Long, nước chứa muối cao gây tổn hại nghiêm trọng đến nông nghiệp và cấp nước sinh hoạt. Sử dụng chủng vi khuẩn quang dưỡng tía để xử lý nước là giải pháp thân thiện môi trường và bền vững. Các chủng này có thể được nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng mặt trời, làm giảm chi phí năng lượng. Ngoài ra, có thể sử dụng chúng trong hệ thống xử lý nước thải có nồng độ muối cao từ các công nhân hoạt động nuôi trồng thủy sản. Triển vọng phát triển bao gồm tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, cải thiện khả năng hấp thu muối thông qua công nghệ di truyền, và áp dụng quy mô công nghiệp.

4.1. Ứng dụng trong nông nghiệp và cấp nước

Vi khuẩn quang dưỡng tía có thể giúp xử lý nước nhiễm mặn cho sử dụng nông nghiệp ở các vùng xâm nhập mặn. Với khả năng hấp thu muối cao, chúng làm giảm nồng độ Na+ và Cl- trong nước. Nước được xử lý có thể tái sử dụng cho tưới tiêu, giảm tác động của xâm nhập mặn đến đất canh tác. Phương pháp này giá rẻ hơn khử muối bằng thẩm thấu nghịch đảo truyền thống.

4.2. Công nghệ tương lai và hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo tập trung vào tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để tăng tốc độ hấp thu muối của vi khuẩn. Công nghệ biến đổi di truyền có thể tạo ra các chủng vi khuẩn có khả năng hấp thu muối vượt trội. Xây dựng bioreactor hiệu quả để sản xuất quy mô lớn là bước tiến quan trọng tiếp theo cho ứng dụng công nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Theo báo cáo của Tổ chức Phát triển Nƣớc Thế giới của Liên Hiệp Quốc (The United Nations World Water Development) có khoảng 22% nƣớc dùng cho công nghiệp, 8% nƣớc dùng cho sinh hoạt và 70% nƣớc dùng cho nông nghiệp. Tuy nhiên, có tới 90% nƣớc dùng cho nông nghiệp ở các nƣớc kém phát triển (FAO, 2011) mà không có các biện pháp sử dụng hiệu quả hay tiết kiệm, bên cạnh đó, dự kiến tiêu thụ nƣớc cho nông nghiệp sẽ tăng khoảng 20% toàn cầu vào năm 2050 (WWAP, 2012). Rất nhiều nguyên nhân gây ra sự ô nhiễm nƣớc nông nghiệp, trong đó ô nhiễm trầm trọng nhất hiện nay là sự xâm nhiễm mặn do biến đổi khí hậu và nƣớc biển dâng.

Với số liệu thống kê cho thấy rằng, có ba phần tƣ diện tích bề mặt Trái Đất đƣợc bao phủ bởi nƣớc, trong đó, hơn 97% lƣợng nƣớc ở dạng nƣớc mặn không sử dụng trực tiếp cho sinh hoạt hoặc nông nghiệp; 3% lƣợng nƣớc ngọt còn lại thì có khoảng 0,5% đƣợc sử dụng trực tiếp nhƣng không phân bố đều trên toàn thế giới. Hiện nay, sự xâm nhập mặn từ nƣớc biển là mối quan tâm hàng đầu tại các vùng lãnh thổ ven biển nhƣ Bắc Phi, Trung Đông, Bờ biển Địa Trung Hải, Trung Quốc, Mexico, Đại Tây Dƣơng, Hoa Kỳ và Việt Nam. Mặc khác, việc gia tăng dân số, sản xuất nông nghiệp và công nghiệp phát triển ồ ạt cũng đã gây ra nhiều vấn đề ô nhiễm môi trƣờng. Để giải quyết bài toán giảm mặn trong đất và nƣớc nông nghiệp là rất quan trọng và cần thiết.

Cụ thể, các vi khuẩn quang dƣỡng nhờ năng lƣợng mặt trời để khử muối đây là một cơ hội tìm năng để khai thác mục đích này. Trong hàng triệu năm qua, một số vi sinh vật đã thích ứng, sống sót trên trái đất mà không sử dụng quá nhiều năng lƣợng và tài nguyên cũng nhƣ không ảnh hƣởng đến môi trƣờng sống. Các vi khuẩn quang dƣỡng đặc biệt có thể sinh ra một lƣợng sinh khối lớn ttrong nƣớc lợ, nƣớc biển và đƣợc sử dụng nhƣ bộ trao đổi 8 Đồ án tốt nghiệp ion thông qua các kênh protein màng. Do vậy, đồ án này sẽ là bƣớc đầu “Sàng lọc chủng vi khuẩn quang dƣỡng tía có khả năng hấp thu muối.

Tình hình nghiên cứu 2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Những năm gần đây đã và đang có những nghiên cứu tập trung về nhóm vi khuẩn quang dƣỡng có khả năng loại bỏ muối nhƣ nghiên cứu mới nhất và hiệu quả nhất theo công bố của Kei Sasaki (2017) [24], kết quả đạt đƣợc từ nghiên cứu này là việc loại bỏ Na+ từ nƣớc biển bằng cách sử dụng hai chủng vi khuẩn quang hợp Rhodobacter sphaeroides SSI và Rhodovulum sp, cả hai chủng này đều phát triển tốt trong môi trƣờng GM (glutamate - malate) có 3% NaCl. Trong đó chủng Rhodobacter sphaeroides SSI đƣợc chứng minh là tăng trƣởng tốt, khả năng loại bỏ Na+ tối đa là 39,3% trong điều kiện ánh sáng và 36,7% trong điều kiện tối. Chủng Rhodovulum sp có tỷ lệ loại bỏ Na+ tối đa khoảng 64,9% trong cả hai điều kiện sáng và tối sau hai ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, trong 2 - 3 ngày nuôi cấy tiếp theo thì xảy ra hiện tƣợng Na+ quay lại môi trƣờng do quá trình chuyển điện tử và trao đổi chất [24].

Theo khảo sát ứng dụng chủng Rhodopseunomonas palustris TK103, Rhodopseunomonas palustris PP803, Rhodopseunomonas palustris P1 của [17], phối trộn rơm và than trấu để làm phân bón cho ruộng lúa với nồng độ gây stress muối khoảng 0,25% NaCl và làm giảm khí gây hiệu ứng nhà kính nhƣ CH4 và CO2 sinh ra từ ruộng lúa. Kết quả cho thấy chủng Rhodopseunomonas palustris PP803 làm cho hạt lúa nảy mầm, phát triển tốt trong môi trƣờng đất bị stress muối so với mẫu đối chứng là nƣớc. Ngoài ra, trong mô hình nghiên cứu đồng ruộng dƣới điều kiện ánh sáng 10 ngày, ƣớc lƣợng nồng độ tế bào chủng Rhodopseunomonas palustris PP803 dao động từ 6,7 - 6,8 cfu/ml và làm giảm 100% CH4 và 47% CO2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Hiện nay, đã có những nghiên cứu thích ứng với hiện tƣợng nhiễm mặn là chủ động chọn lọc giống cây trồng, chuyển đổi vật nuôi và thay đổi mục đích sử dụng đất.

Trong đó, kết quả nghiên cứu về giống lúa đạt tiêu chuẩn chịu mặn và phẩm chất tốt nhƣ giống lúa OM5464, OM5166 đã đƣợc công nhận và đƣa vào sản xuất thử nghiệm (Trần Thị Cúc Hòa và cộng sự, 2000). Một nghiên cứu khác đã đƣợc tiến hành để kiểm tra khả năng chịu mặn theo phƣơng pháp của IRRI, 1997. Kết quả đánh giá cấp độ chống chịu mặn của 5 giống lúa trong 16 ngày thí nghiệm nhƣ sau: hầu hết các giống lúa đều có khả năng chịu mặn ở cấp độ 5 (chống chịu trung bình); trong đó giống Đốc Phụng, Lúa Sỏi, Nàng Qƣớt Biển ở độ mặn 12,5‰; giống Một Bụi Hồng ở độ mặn 10‰; giống CTUS1 ở độ mặn 12.5‰, hàm lƣợng amylose đạt 20,43%; hàm lƣợng protein đạt 7,33%; giống CTUS17 ở độ mặn 12,5‰; hàm lƣợng amylose đạt 26,20%; hàm lƣợng protein đạt 7,3%; giống CTUS4 ở độ mặn 10‰, hàm lƣợng amylose đạt 18,00% hàm lƣợng protein đạt 9,5% [4]. Theo kết quả công bố của Đieu Thị Mai Hoa và cộng sự, đánh giá theo tiêu chuẩn của IRRI 1997, giống lúa OM6976 - Saltol có khả năng chịu mặn ở mức khá (điểm 3) trong khi giống gốc 0M6976 mẫn cảm mặn (điểm 7).

Ở nồng độ muối cao (NaCl 150mM), dòng lúa mang gen chịu mặn OM6976 - Saltol có khả năng sinh trƣởng mầm, cây con tốt hơn so với giống gốc OM6976 [28]. Tuy có nhiều nghiên cứu về giống lúa chịu mặn để thích ứng kịp thời trong sản xuất lúa gạo, phù hợp với sự biến đổi khí hậu và xâm nhiễm mặn trong vùng đất sản xuất nông nghiệp nhƣng hiện nay vẫn chƣa có công bố khoa học nào liên quan tới quá trình loại Na+ từ nhóm vi sinh vật nói chung và nhóm vi khuẩn quang dƣỡng nói riêng đƣợc phân lập và nghiên cứu tại Việt Nam. Do vậy, đồ án này sẽ là bƣớc đầu “Sàng lọc chủng vi khuẩn quang dƣỡng tía có khả năng hấp thu muối” nhằm hƣớng tới ứng dụng giảm mặn cho những vùng đất nông nghiệp bị xâm nhiễm mặn. Mục đích nghiên cứu Sàng lọc chủng vi khuẩn quang dƣỡng tía có khả năng hấp thu muối.

Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập một số chủng vi khuẩn quang dƣỡng tại các tỉnh: Ngọc Hiển/Cà Mau, Gò Công Đông/Tiền Giang, Cần Giờ/TpHCM/, Trần Đề/Sóc Trăng. Khảo sát sàng lọc khả năng chịu mặn và hấp thu mặn. Định danh vi khuẩn quang dƣỡng dựa theo hình thái học và sinh học phân tử. Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp phân lập và làm thuần.

Phƣơng pháp nhuộm Gram. Phƣơng pháp bảo quản giống. Phƣơng pháp sàng lọc chủng vi khuẩn chịu mặn. Phƣơng pháp sàng lọc chủng vi khuần hấp thu mặn.

Phƣơng pháp định danh sinh học phân tử. Phƣơng pháp giải trình tự gene và so sánh dữ liệu trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST. Các kết quả đạt đƣợc Kết quả phân lập và làm thuần. Kết quả nhuộm Gram và hình thái học.

Kết quả sàng lọc chủng vi khuẩn chịu mặn. Kết quả sàng lọc chủng vi khuần hấp thu mặn. Kết quả định danh sinh học phân tử. Kết quả giải trình tự gene và so sánh dữ liệu trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST.

Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Đề tài gồm 4 chƣơng Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. Chƣơng 3: Kết quả và biện luận Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị 12 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam và các hƣớng giải quyết 1. Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam Theo dữ liệu đánh giá trong năm 2015 so với 2016 của Viện Khoa Học Thủy Lợi Miền Nam (VKHTLMN 2017) cho thấy rằng hiện tƣợng xâm nhập mặn vùng cửa sông Cửu Long nhƣ sau: Khu vực sông Vàm Cỏ có độ mặn năm 2016 lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 4,7 - 7,4g/l, xâm nhập mặn sâu vào đất liền khoảng 90 - 93km.

Khu vực các cửa sông thuộc sông Tiền, năm 2016 có độ mặn lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 1,5 - 8,2g/l, sự xâm nhập mặn vào khoảng 45 - 65km. Khu vực các cửa sông thuộc sông Hậu có độ mặn lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 2,8 - 6,4g/l, độ nhiễm mặn vào sâu khoảng 55 - 60km. Khu vực trên sông Cái Lớn, độ mặn lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 4,8 - 7,6g/l, chiều sâu xâm nhập mặn lớn nhất khoảng 60 - 65km. Trong năm 2017, tại một số trạm điển hình vùng cửa sông Cửu Long đƣợc khảo sát nhƣ sau: Tại Vàm Kênh, Vàm Giồng và Xuân Hòa trên sông Cửa Tiểu có độ mặn 23,5g/l; 3,6g/l; 0,6g/l thấp hơn so với cùng kỳ năm 2016 từ 0,1 - 3,9g/l.

Tại Bình Đại, Lộc Thuận và Giao Hòa trên sông Cửa Đại có độ mặn 25,6g/l; 14,2g/l và 3,2g/l thấp hơn so với năm 2016 từ 1,4 - 2,6g/l. Tại Bến trại, Trà Vinh trên sông Cổ Chiên có độ mặn 9,6g/l - 25,2g/l. Tại An Thuận, Sơn Đốc trên sông Hàm Luông có độ mặn là 13,1g/l - 29,0g/l. Tại Trần Đề, Đại Ngãi trên sông Hậu có độ mặn 20,3g/l và so với cùng kỳ năm 2016 thấp hơn 7,0g/l - 7,2g/l.

Bên cạnh đó những kết quả công bố cũng nhƣ dự báo cho thấy tỷ lệ dân số nông thôn bị ảnh hƣởng bởi xâm nhập mặn tăng từ 39,5% tại thời điểm 2012 lên đến 41,4% ; 45,3% và 47,6% vào các năm 2020, 2030 và 2050. Nguyên nhân gây ra xâm nhập mặn Trái đất ngày càng nóng lên bởi hàng loạt các khí gây hiệu ứng nhà kính phát sinh từ các hoạt động công nghiệp, giao thông và sinh hoạt của con ngƣời (trong đó nguyên nhân từ các hoạt động của tự nhiên chỉ chiếm 1 phần nhỏ, bao gồm: hoạt động của núi lửa, cháy rừng…). Theo nghiên cứu của các nhà khoa học đăng tải trên tạp chí Scientific Reports, biến đổi khí hậu đang khiến mực nƣớc biển dâng trung bình 4mm mỗi năm. Theo các chuyên gia đánh giá, Việt Nam là quốc gia có mực nƣớc dâng cao hơn mức trung bình toàn cầu, điều này đồng nghĩa với việc mức độ phì nhiêu của vùng châu thổ lớn nhất giảm dần diện tích.

Nguyên nhân là do phần lớn các tỉnh, thành phố khu vực đồng bằng sông Cửu Long có cao độ tự nhiên thấp, đây là điểm yếu để lũ lụt và ngập mặn xâm nhập.