Luận văn: Phân lập Bacillus sp. từ rễ xoài ức chế nấm Colletotrichum sp.

Tài liệu nghiên cứu quá trình phân lập vi khuẩn Bacillus sp. từ đất rễ xoài, có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài.

• Tác giả: Trần Kim Hạnh
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Ánh Hồng
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Giới thiệu về bệnh thán thư xoài và nấm Colletotrichum

Bệnh thán thư xoài là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đe dọa sản xuất xoài tại Việt Nam và các quốc gia trồng xoài khác trên thế giới. Nấm Colletotrichum sp. là tác nhân gây bệnh chính, gây ra các tổn thương đốm đen trên quả, lá và cành xoài, dẫn đến giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Hiện nay, việc sử dụng các biện pháp kiểm soát sinh học thay thế cho hóa chất đã trở thành xu hướng mới trong nông nghiệp bền vững. Vi khuẩn Bacillus được xác định là một trong những tác nhân sinh học hiệu quả nhất có khả năng ức chế nấm bệnh này. Nghiên cứu về phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế Colletotrichum sp. sẽ mở ra những triển vọng mới cho quản lý bệnh thán thư một cách an toàn và hiệu quả.

1.1. Đặc điểm và tác hại của bệnh thán thư xoài

Bệnh thán thư xoài gây ra các đốm đen tròn trên quả, lá và cành xoài, có khả năng lây lan nhanh chóng trong điều kiện ẩm ướt. Nấm Colletotrichum sp. phát triển mạnh vào mùa mưa, làm giảm năng suất lên đến 50-70% ở những vùng trồng xoài nhiều mưa. Bệnh không chỉ gây tổn thất trực tiếp mà còn làm giảm giá trị thương mại của sản phẩm, ảnh hưởng đến thu nhập của nông dân.

1.2. Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong kiểm soát bệnh

Vi khuẩn Bacillus là một nhóm vi khuẩn có lợi, được tìm thấy phổ biến trong đất và vùng rễ cây trồng. Chúng có khả năng sản sinh các chất chuyên biệt có hoạt tính kháng nấm mạnh, đặc biệt là ức chế nấm gây bệnh. Bacillus sp. có khả năng ức chế Colletotrichum sp. thông qua cơ chế tạo ra lipopeptide và polysaccharide, làm ngăn chặn sự phát triển và sự lây lan của nấm bệnh.

II. Đặc điểm và cơ chế hoạt động của nấm Colletotrichum

Nấm Colletotrichum sp. là một dòng nấm hoàn toàn paraphyletic, với hơn 600 loài được mô tả, nhưng chỉ một số ít có liên quan đến bệnh thán thư xoài. Nấm này có khả năng tạo thành appressorium - một cơ quan đặc biệt giúp xâm nhập vào các mô bị nhiễm của bệnh chủ. Cơ chế gây bệnh của Colletotrichum bao gồm việc sản sinh các độc tố và các enzyme phân giải tế bào, giúp nấm xuyên qua lớp biểu bì của lá và quả. Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và các điều kiện dinh dưỡng khác. Hiểu rõ về cơ chế hoạt động của Colletotrichum sẽ giúp chúng ta phát triển các biện pháp kiểm soát hiệu quả hơn, bao gồm cả việc sử dụng vi khuẩn Bacillus để ức chế nấm bệnh này.

2.1. Đặc điểm hình thái và sinh thái của Colletotrichum

Nấm Colletotrichum có các đặc điểm hình thái rõ ràng bao gồm bào tử đơn bào, các acervuli với lông bào (setae), và khả năng tạo thành appressorium màu đen. Nấm này là mô phạm sinh sống trong ô môi trường ẩm ướt, nhiệt độ từ 20-28°C là tối ưu cho sự phát triển. Các bào tử di chuyển bằng nước mưa và nước tưới tiêu, lây lan từ cây bệnh sang cây lành.

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển của nấm bệnh

Sự phát triển của Colletotrichum sp. chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm tương đối cao (trên 80%), ánh sáng và chất lượng cây chủ. Mùa mưa là thời kỳ thuận lợi nhất cho bệnh phát triển. Các cây yếu, bị stress, hoặc thiếu dinh dưỡng dễ bị mắc bệnh hơn so với cây khỏe mạnh.

III. Vi khuẩn Bacillus và khả năng ức chế nấm bệnh

Vi khuẩn Bacillus là một nhóm vi khuẩn Gram dương, tạo bào tử, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt là trong đất và vùng rễ cây trồng. Các chủng Bacillus sp. có khả năng sản sinh nhiều loại chất chuyên biệt với hoạt tính kháng sinh mạnh, bao gồm peptide, polyketide, và các hợp chất khác. Bacillus có khả năng ức chế Colletotrichum thông qua nhiều cơ chế khác nhau: tiết ra các chất kháng nấm, cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian sống, cũng như kích thích các phản ứng miễn dịch của cây chủ. Ngoài khả năng kiểm soát bệnh, vi khuẩn Bacillus còn có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng thực vật, cải thiện sức khỏe của cây và tăng năng suất. Đây là những lý do chính khiến Bacillus trở thành một công cụ quan trọng trong nông nghiệp bền vững.

3.1. Cơ chế ức chế nấm bệnh của Bacillus

Vi khuẩn Bacillus ức chế Colletotrichum thông qua sản sinh lipopeptide, polyketide, và các enzyme phân giải. Các chất này có khả năng phá vỡ tường tế bào của nấm, ngăn chặn sự phát triển và quá trình lây lan. Bacillus cũng cạnh tranh với nấm về dinh dưỡng và không gian sống, làm yếu sức khỏe của Colletotrichum.

3.2. Ứng dụng Bacillus trong kiểm soát sinh học

Bacillus sp. được sử dụng rộng rãi làm chế phẩm kiểm soát sinh học để phòng trừ bệnh thán thư xoài và nhiều bệnh nông nghiệp khác. Các chế phẩm dạng bột, lỏng hoặc viên có thể được áp dụng bằng cách phun lên lá, tưới gốc hoặc nhúng hạt giống. Bacillus an toàn cho con người, động vật và môi trường, không gây kháng thuốc, và có thể được sử dụng lâu dài mà không ảnh hưởng tiêu cực.

IV. Phương pháp phân lập và tuyển chọn Bacillus ức chế Colletotrichum

Việc phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài là một quy trình phức tạp đòi hỏi nhiều bước khoa học chặt chẽ. Trước tiên, các mẫu đất được thu thập từ vùng rễ của cây xoài, sau đó phân lập Bacillus bằng các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật truyền thống. Sàng lọc nhanh các mẫu có khả năng ức chế Colletotrichum được thực hiện thông qua các thí nghiệm in vitro trên đĩa petri. Các chủng Bacillus được tuyển chọn sẽ được khảo sát các đặc tính sinh hóa và định danh bằng phương pháp sinh học phân tử, bao gồm giải trình tự gen 16S rRNA. Các thí nghiệm đối kháng in vitro giữa Bacillus sp. và Colletotrichum sẽ được tiến hành để đánh giá mức độ ức chế. Cuối cùng, những chủng Bacillus hoạt động tốt sẽ được thử nghiệm trong điều kiện nhà kính và ruộng để xác nhận hiệu quả kiểm soát bệnh thực tế.

4.1. Quy trình phân lập Bacillus từ đất vùng rễ xoài

Mẫu đất được thu thập từ lớp đất gần rễ xoài, sau đó pha loãng và nuôi cấy trên môi trường chứa Bacillus. Vi khuẩn Bacillus được xác định dựa vào đặc điểm hình thái: cơ quan hình thành bào tử, khả năng tạo độ nhớt. Các chủng được tuyển chọn được cơn sạch và bảo tồn cho các thí nghiệm tiếp theo.

4.2. Sàng lọc và đánh giá khả năng ức chế Colletotrichum

Thí nghiệm đối kháng in vitro được thiết lập bằng cách trồng Bacillus và Colletotrichum trên cùng một đĩa petri. Các chủng Bacillus có khả năng tạo vành cấm (inhibition zone) rõ ràng xung quanh vùng sinh trưởng của nó sẽ được tuyển chọn. Đo kích thước vành cấm là chỉ tiêu chính để đánh giá khả năng ức chế của Bacillus.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Xoài là một trong những loại cây ăn quả được trồng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, mang lại giá trị kinh tế cao ở thị trường trong nước và xuất khẩu, góp phần phát triển ngành nông sản của Việt Nam. Theo thống kê của Cục trồng trọt năm 2019, sản lượng xoài đạt 31.276 tấn, giúp Việt Nam đứng thứ 13 về sản xuất xoài trên thế giới [1]. Tuy nhiên, xoài bị ảnh hưởng rất lớn bởi dịch bệnh, đặc biệt bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum là bệnh phổ biến nhất ở xoài, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng xoài ở giai đoạn trước và sau thu hoạch.

Bệnh thán thư trên xoài có thể gây tổn thất năng suất lên đến 60%. Công tác phòng trừ dịch bệnh chưa thật sự hiệu quả do hiểu biết của người trồng còn hạn chế. Hiện nay, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ mỗi khi dịch bệnh xảy ra. Việc này góp phần gây ô nhiễm môi trường do một lượng lớn thuốc bảo vệ thực vật tồn dư trong đất và đi vào mạch nước ngầm và trên sản phẩm, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của con người và các loài sinh vật khác.

Vấn đề đặt ra hiện nay là tìm kiếm một biện pháp an toàn và hiệu quả để phòng trừ bệnh thán thư trên xoài. Xu hướng hiện nay để phát triển nền nông nghiệp bền vững và thân thiện với môi trường là biện pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng để phòng trừ bệnh hại. Trong số các vi sinh vật đối kháng, các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus spp. đã được nghiên cứu rất nhiều về khả năng đối kháng với nấm gây bệnh.

Ở Việt Nam, có một số nghiên cứu vi khuẩn Bacillus có hoạt tính đối kháng với nấm Colletotrichum spp. gây bệnh trên một số loại cây trồng như đu đủ, ớt và cà phê. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào về khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus với nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây xoài. Chính vì những thực tế trên, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp.

từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài” được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn được vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài.

Đồng thời, nghiên cứu góp phần tạo bộ chủng giống Bacillus có tiềm năng tạo chế phẩm sinh học phục vụ cho việc quản lý phòng kháng bệnh thán thư cho cây xoài. 2 Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn được vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài.

Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập và định danh nấm Colletotrichum sp. từ mẫu lá xoài nhiễm bệnh Nội dung 2: Phân lập và sàng lọc vi khuẩn Bacillus sp. có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. Nội dung 3: Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp.

có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. mạnh nhất Nội dung 4: Khảo sát đặc tính sinh hóa và định danh vi khuẩn Bacillus sp. được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử Cơ sở khoa học và thực tiễn của đề tài Cơ sở khoa học đề tài Kết quả nghiên cứu tuyển chọn được vi khuẩn Bacillus subtilis (PQ517027) phân lập từ đất vùng rễ xoài xoài thu thập tại vườn xoài Đồng Tháp (tọa độ 10.7259846) có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài.

Tính thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu góp phần tạo bộ chủng giống Bacillus có tiềm năng tạo chế phẩm sinh học phục vụ cho việc quản lý phòng kháng bệnh thán thư cho cây xoài. Những đóng góp của luận văn Đề tài phân lập được chủng Bacillus subtilis có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài, góp phần tạo bộ chủng giống Bacillus có tiềm năng tạo chế phẩm sinh học phục vụ cho việc quản lý phòng kháng bệnh thán thư cho cây xoài. Phân lập được 8 chủng nấm gây bệnh trên xoài.

Trong đó, xác định được loài Colletotrichum asianum gây bệnh thán thư trên lá xoài. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH THÁN THƯ XOÀI 1. Giới thiệu chung về bệnh thán thư xoài Xoài được trồng chủ yếu ở Châu Á, đặc biệt là ở Ấn Độ, chiếm khoảng 50% sản lượng xoài của thế giới, tiếp theo là Trung Quốc, Thái Lan, Pakistan và Indonesia.

Brazil và Mexico là những nước sản xuất xoài lớn nhất ở Mỹ, trong khi Nigeria và Ai Cập là những nước sản xuất lớn ở châu Phi [2]. Ở Việt Nam, xoài là cây ăn quả mang lại giá trị kinh tế cao, giúp Việt Nam đứng thứ 13 về sản xuất xoài trên thế giới với sản lượng đạt 31. Các giống xoài được trồng ở các nước đều dễ bị bệnh thán thư do nhiệt độ và độ ẩm cao đặc trưng của các vùng khí hậu nhiệt đới. Tỷ lệ mắc bệnh thán thư trên xoài xảy ra gần như 100% trong điều kiện ẩm ướt.

Bệnh thán thư xoài là bệnh phổ biến trên toàn thế giới, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng xoài trước và sau thu hoạch. Triệu chứng bệnh thán thư trên các bộ phận của xoài [3] (A). Quả xoài 4 Bệnh thán thư xoài biểu hiện trên lá, cành, cuống lá, chùm hoa và quả. Ở lá, vết bệnh bắt đầu từ những đốm nhỏ, góc cạnh, màu nâu đến đen, có thể lan rộng thành những vùng chết rộng.

Vết bệnh có thể rụng lá khi thời tiết khô ráo. Triệu chứng đầu tiên trên hoa là những đốm nhỏ màu đen hoặc nâu sẫm, có thể to ra, liên kết và làm chết hoa trước khi đậu quả, làm giảm năng suất đáng kể. Cuống lá, cành và thân cũng dễ bị nhiễm bệnh, phát triển các vết bệnh màu đen, lan rộng điển hình trên quả, lá và hoa. Những đốm hoại tử màu đen này có thể kết hợp lại để tạo thành các vùng nhiễm bệnh lớn hơn.

Các mô bị nhiễm bệnh trở nên khô, cuối cùng các bộ phận bị nhiễm bệnh của cây sẽ chết [4]. Quả chín nhiễm bệnh sẽ phát triển thành các đốm sâu trũng, nổi rõ, màu nâu sẫm đến đen trước hoặc sau khi hái. Quả có thể rụng khỏi cây sớm. Các vết đốm trên quả thường liên kết lại và xâm nhập sâu vào quả, dẫn đến quả bị thối trên diện rộng.

Hầu hết các bệnh nhiễm ở quả còn xanh đều ở dạng tiềm ẩn và phần lớn không thể nhìn thấy được cho đến khi chín. Vì vậy, những quả có vẻ khỏe mạnh khi thu hoạch có thể nhanh chóng phát triển các triệu chứng bệnh thán thư khi chín. Triệu chứng thứ hai trên quả bao gồm triệu chứng vết rách, trong đó là các vùng hoại tử trên quả, có thể có hoặc không liên quan đến vết nứt bề mặt của lớp biểu bì, tạo ra hiệu ứng da cá sấu và thậm chí khiến quả bị hư hại, phát triển các vết nứt rộng và sâu ở lớp biểu bì kéo dài vào bên trong quả. Các vết bệnh trên thân và quả có thể tạo ra các khối bào tử màu hồng cam dễ thấy trong điều kiện ẩm ướt.

Điều kiện thời tiết ẩm ướt, ấm áp tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh thán thư lây lan [3]. Tình hình nghiên cứu bệnh thán thư xoài trên thế giới Colletotrichum gloeosporioides sensu lato là tác nhân gây bệnh thán thư xoài phổ biến trên thế giới. Trong một số nghiên cứu, Colletotrichum acutatum sensu lato cũng đã được báo cáo là có liên quan đến bệnh thán thư xoài. Phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự vùng gen ITS cho thấy C.

gloeosporioides bao gồm các nhóm hoặc quần thể loài đa dạng và Colletotrichum spp. khác có thể liên quan đến bệnh thán thư xoài [5, 6]. Nghiên cứu Weir và cộng sự (2012) đã mô tả các phân tích phát sinh loài Colletotrichum bằng cách sử dụng nhiều dấu ấn sinh học, một số loài trong phức hợp C. acutatum được báo cáo là có liên quan đến bệnh thán thư xoài [7].

Ở Đông Bắc Brazil, năm loài Colletotrichum cụ thể là C. dianesei đã được tìm thấy là các tác nhân gây bệnh thán thư trên xoài và được báo cáo lần đầu tiên trên xoài ở Brazil [8]. Nhiều dấu ấn di truyền 5 (GAPDH, actin, β-tubulin, calmodulin, GS và vùng ITS) được sử dụng để xác định các loài. Ở Colombia, nghiên cứu Pardo-De la Hoz và cộng sự (2016) đã báo cáo một số mức độ xuất hiện của các loài Colletotrichum spp.

liên quan đến bệnh thán thư xoài, bao gồm C. Nhiều báo cáo được công bố ở Ấn Độ, quốc gia có sản lượng xoài lớn nhất thế giới, loài C. gloeosporioides là tác nhân gây bệnh chính của bệnh thán thư xoài. Dựa trên phân tích giới hạn và giải trình tự vùng gen ITS, Chowdappa và Kumar (2012) đã báo cáo rằng C.

gloeosporioides liên quan đến bệnh thán thư xoài ở Ấn Độ bao gồm các phân nhóm khác nhau. Các thử nghiệm khả năng gây bệnh cho thấy sự thay đổi về mức độ độc lực giữa các chủng C. gloeosporioides phân lập, cùng với sự tồn tại của nhiều hơn một loài gây bệnh [5]. Ở Trung Quốc, bệnh thán thư trên xoài cũng được báo cáo ở nhiều khu vực.

Nghiên cứu của Li và cộng sự (2019) đã công bố 13 loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh trên xoài ở miền Nam Trung Quốc [10]. Một nghiên cứu khác phân tích phát sinh loài đa gen được thực hiện bởi Mo và cộng sự (2018) ở các vùng khác nhau của Quảng Tây, miền Nam Trung Quốc, cho thấy ba loài thuộc phức hợp C. gloeosporioides gây bệnh cho quả và lá xoài bao gồm C.

Wu và cộng sự (2020) đã báo cáo về loài Colletotrichum spp. liên quan đến bệnh thán thư xoài ở Đài Loan. Nghiên cứu này đã xác định C. Trong số các loài trong phức hợp C.

asianum là loài gây bệnh thán thư phổ biến nhất ở xoài trên toàn thế giới. Loài này đã được báo cáo ở Brazil, Sri Lanka, Thành phố Tam Á và các khu vực khác của Trung Quốc, Nam Phi, Malaysia, Đài Loan, Mexico, Philippines và Indonesia [13]. Tình hình nghiên cứu bệnh thán thư xoài ở Việt Nam Ở Việt Nam, báo cáo đầu tiên về bệnh thán thư trên xoài phân lập được chủng Colletotrichum asianum trên lá xoài [14]. Loài này cũng được báo cáo là tác nhân phổ biến gây bệnh thán thư xoài ở nhiều nước trên thế giới.

Năm 2008, một nghiên cứu của Lê Hoàng Lệ Thủy và Phan Văn Kim đã phân lập được 73 chủng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.