Sàng Lọc và Tuyển Chọn Xạ Khuẩn Chống Nấm Fusarium Oxysporum Trên Cây Cà Phê

Khóa luận nghiên cứu sàng lọc và tuyển chọn chủng xạ khuẩn đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây cà phê, hướng đến giải pháp bảo vệ cây trồng hiệu quả.

• Tác giả: Nguyễn Lan Nhi
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Giang
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây cà phê
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC BẢNG
• 3. DANH MỤC HÌNH
• 4. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 5. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 6. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 6.1. Tổng quan về xạ khuẩn
• 6.1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn
• 6.1.2. Đặc điểm về hình thái, cấu trúc
• 6.1.3. Đặc điểm sinh hóa lý
• 6.1.4. Ứng dụng của xạ khuẩn
• 6.2. Tổng quan về nấm gây bệnh trên cây cà phê
• 6.2.1. Tổng quan về cây cà phê
• 6.2.2. Tổng quan về tình hình sản xuất cà phê ở trên thế giới và Việt Nam
• 6.2.3. Các bệnh thường gặp trên cây cà phê
• 6.2.4. Tổng quan về chủng nấm Fusarium oxysporum
• 7. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 7.1. Nội dung nghiên cứu
• 7.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 7.3. Vật liệu nghiên cứu
• 7.3.1. Các chủng vi sinh vật
• 7.3.2. Hóa chất và thiết bị
• 7.4. Phương pháp nghiên cứu
• 7.4.1. Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng xạ khuẩn
• 7.4.2. Bảo quản giống
• 7.4.3. Đặc điểm sinh học
• 7.4.4. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn
• 7.4.5. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 7.4.6. Định danh chủng xạ khuẩn được tuyển chọn
• 7.4.7. Sàng lọc khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh cây của các chủng xạ khuẩn
• 7.4.8. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn
• 7.4.8.1. Đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng XK16 và XK88H trên môi trường Gause và ISP
• 7.4.8.2. Đặc điểm hệ sợi và cuống sinh bào tử
• 7.4.8.3. Đặc điểm hóa sinh
• 7.4.8.4. Khả năng sinh sắc tố Melanin
• 7.4.8.5. Ảnh hưởng của pH
• 7.4.8.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 7.4.8.7. Khả năng đồng hóa nguồn Carbon
• 7.4.8.8. Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ
• 7.4.8.9. Ảnh hưởng của nồng độ muối
• 7.4.8.10. Khả năng phân giải Citrate
• 7.4.8.11. Khả năng sinh Enzyme ngoại bào
• 7.4.9. Định danh chủng xạ khuẩn XK16
• 7.4.9.1. Tách chiết DNA
• 7.4.9.2. Khuếch đại trình tự 16S rRNA bằng phản ứng PCR
• 7.4.9.3. Định danh và phân tích bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA
• 8. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật quan trọng trong đất, thuộc chi Streptomyces, có khả năng sản xuất chất kháng sinh và phân giải các chất hữu cơ. Chúng phân bố rộng rãi trong môi trường đất, nước, và các chất hữu cơ khác. Xạ khuẩn có cấu trúc dạng sợi, sinh sản bằng bào tử và có khả năng chịu đựng điều kiện môi trường khắc nghiệt như pH, nhiệt độ, và độ mặn. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh học các bệnh thực vật, đặc biệt là bệnh do nấm Fusarium oxysporum gây ra.

1.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc

Xạ khuẩn có cấu trúc phức tạp với hai loại sợi chính: sợi khí sinh và sợi cơ chất. Sợi khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường, tạo bào tử, trong khi sợi cơ chất hấp thụ chất dinh dưỡng. Chúng có thành tế bào dày, chứa các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất. Bào tử của xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide, giúp chúng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi.

1.2. Đặc điểm sinh hóa lý

Xạ khuẩn phát triển tốt trong điều kiện pH từ 5 đến 11, nhiệt độ từ 20°C đến 40°C, và chịu được nồng độ muối lên đến 10%. Chúng có khả năng phân giải cellulose, lignin, và cố định nitơ. Ngoài ra, xạ khuẩn còn sản xuất các enzyme ngoại bào như cellulase, xylanase, và amylase, giúp chúng thích nghi với nhiều môi trường khác nhau.

II. Bệnh cà phê và nấm Fusarium oxysporum

Bệnh cà phê do nấm Fusarium oxysporum gây ra là một trong những vấn đề nghiêm trọng trong sản xuất cà phê. Nấm này xâm nhập vào rễ cây, gây thối rễ và làm giảm năng suất cây trồng. Fusarium oxysporum là loại nấm đất, có khả năng tồn tại lâu dài trong đất và lây lan nhanh chóng. Các biện pháp kiểm soát bệnh hiện nay chủ yếu dựa vào hóa chất, nhưng việc sử dụng xạ khuẩn như một biện pháp sinh học đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi.

2.1. Tác hại của Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum gây ra các bệnh như thối cổ rễ, thối nứt thân, và thối rễ tơ trên cây cà phê. Cây bị bệnh thường có biểu hiện lá vàng, rễ thối đen, và chết dần. Bệnh này làm giảm năng suất và chất lượng cà phê, gây thiệt hại lớn cho ngành sản xuất.

2.2. Biện pháp phòng trừ bệnh

Hiện nay, việc sử dụng xạ khuẩn như Streptomyces để kiểm soát Fusarium oxysporum đang được ưa chuộng do tính thân thiện với môi trường và hiệu quả cao. Xạ khuẩn tiết ra các chất kháng sinh ức chế sự phát triển của nấm bệnh, giúp bảo vệ cây trồng một cách bền vững.

III. Tuyển chọn xạ khuẩn chống Fusarium oxysporum

Nghiên cứu tập trung vào việc tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với Fusarium oxysporum. Từ 16 chủng xạ khuẩn được lưu trữ, 6 chủng có hoạt tính kháng nấm, trong đó chủng XK16 và XK88H được đánh giá cao nhất. Các chủng này có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện pH và nhiệt độ khác nhau, đồng thời sản xuất các enzyme ngoại bào có lợi.

3.1. Đặc điểm của chủng XK16 và XK88H

Chủng XK16 sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 35°C, pH 6-7, và chịu được độ mặn lên đến 7%. Chủng XK88H phát triển tốt ở nhiệt độ 30°C, pH 7-8, và chịu được độ mặn đến 3%. Cả hai chủng đều có khả năng sinh enzyme ngoại bào như cellulase, xylanase, và amylase, giúp chúng thích nghi với nhiều môi trường khác nhau.

3.2. Ứng dụng trong phòng trừ bệnh

Kết quả nghiên cứu cho thấy XK16 và XK88H có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát Fusarium oxysporum trên cây cà phê. Việc sử dụng các chủng xạ khuẩn này như một biện pháp sinh học không chỉ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh mà còn góp phần bảo vệ môi trường và nâng cao chất lượng sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------------------***------------------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÀ PHÊ Hà Nội, 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------------------***------------------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÀ PHÊ Họ và tên sinh viên : Nguyễn Lan Nhi Mã sinh viên : 637161 Lớp : K63CNSHB Giảng viên hƣớng dẫn : PGS. Nguyễn Văn Giang Hà Nội, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực và chƣa hề sử dụng trong bất kỳ công bố nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Lan Nhi i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Thầy PGS.TS Nguyễn Văn Giang đã quan tâm, chỉ bạo, dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm đề tài tốt nghiệp. Cảm ơn các bạn, các anh chị đang học tập và làm việc tại Bộ môn Công nghệ vi sinh đã đồng hành cùng tôi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong công việc. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ và gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại Học viện. Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Lan Nhi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC BẢNG. vi DANH MỤC HÌNH. vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.

Mục tiêu nghiên cứu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về xạ khuẩn. Giới thiệu về xạ khuẩn.

Đặc điểm về hình thái, cấu trúc. Đặc điểm sinh hóa lý. Ứng dụng của xạ khuẩn. Tổng quan về nấm gây bệnh trên cây cà phê.

Tổng quan về cây cà phê. Tổng quan về tình hình sản xuất cà phê ở trên thế giới và Việt Nam. Các bệnh thƣờng gặp trên cây cà phê. Tổng quan về chủng nấm Fusarium oxysporum.

NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nội dung nghiên cứu. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Các chủng vi sinh vật. Hóa chất và thiết bị. Phƣơng pháp nghiên cứu. Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng xạ khuẩn.

Bảo quản giống. Đặc điểm sinh học. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn. Khả năng sinh enzyme ngoại bào.

Định danh chủng xạ khuẩn đƣợc tuyển chọn. Sàng lọc khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh cây của các chủng xạ khuẩn. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn. Đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng XK16 và XK88H trên môi trƣờng Gause và ISP.

Đặc điểm hệ sợi và cuống sinh bào tử. Đặc điểm hóa sinh. Khả năng sinh sắc tố Melanin. Ảnh hƣởng của pH.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ. Khả năng đồng hóa nguồn Carbon. Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ. Ảnh hƣởng của nồng độ muối.

Khả năng phân giải Citrate. Khả năng sinh Enzyme ngoại bào. Định danh chủng xạ khuẩn XK16. Tách chiết DNA.

Khuếch đại trình tự 16S rRNA bằng phản ứng PCR. Định danh và phân tích bằng phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. TÀI LIỆU THAM KHẢO.

62 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4. Hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn với một số nấm gây bệnh(%). Đặc điểm hình thái của chủng XK16 và chủng XK88H trên các môi trƣờng khác nhau. Ảnh hƣởng của pH tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. Ảnh hƣởng của nguồn carbon tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. Nồng độ muối thích hợp của 2 chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình ảnh xạ khuẩn. Sự hình thành hai loại khuẩn ty sau khi bào tử xạ khuẩn nẩy mầm.

Một số dạng cuống sinh bào tử của xạ khuẩn. Cây cà phê. Cây cà phê bị lở cổ rễ (https://www.vn/ca-phe). Cây cà phê bị thối cổ rễ (https://www.vn/ca-phe).

Cây cà phê bị thối nứt thân. Cây cà phê bị thối rễ tơ (https://www.vn/ca-phe). Bào tử nấm Fusarium oxysporum. Khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum 3 của chủng XK16 sau 10 ngày nuôi cấy.

Khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum 1 của chủng XK88H sau 14 ngày nuôi cấy. Đặc điểm hình thái của chủng XK16 trên các môi trƣờng khác nhau sau 21 ngày nuôi cấy. Khuẩn ty khí sinh (A), cuống sinh bào tử (B) của xạ khuẩn XK88H. Đặc điểm khuẩn ty khí sinh (A) và cuống sinh bào tử (B) của xạ khuẩn XK16.

Xạ khuẩn XK88H(A) và XK16(B) trên môi trƣờng ISP6 sau 7 ngày nuôi cấy. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng kháng nấm sau 7 ngày nuôi cấy của chủng XK88H. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng kháng nấm sau 6 ngày nuôi cấy của chủng XK16. Khả năng sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn XK16(A) và XK88H(B) tƣơng ứng với nồng độ muối 0,5 %.

Khả năng phân giải Citrate của hai chủng XK16 và XK88H. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn XK16. Kết quả điện di tổng số của chủng XK16. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại với đoạn mồi thuộc vùng 16S rRNA của chủng xạ khuẩn XK16.

Xác định loài của chủng XK16 nhờ so sánh trình tự nucleotide trên GenBank. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rRNA của chủng XK16. 49 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT µl : Microliter CMC : Carboxymethyl cellulose Cs : Cộng sự DNA : Deoxyribonucleic acid KTCC : Khuẩn ty cơ chất KTKS : Khuẩn ty khí sinh ISP : International Streptomyces Project PDA : Potato dextrose agar RNA : Ribonucleic acid XK : Xạ khuẩn mm : Milimet g : Gram ml : Mililit G + C : Guanine + Cytosine ix TÓM TẮT Fusarium oxysporum có khả năng gây bệnh cho các loài thực vật khác nhau đặc biệt là trên cây cà phê, chúng xâm nhập vào rễ gây thối rễ hoặc nhiễm trùng hô hấp khi chúng xâm nhập vào hệ thống mao mạch. Trong số các tác nhân sinh học thƣờng đƣợc sử dụng để ức chế vi sinh vật gây bệnh, xạ khuẩn là một trong những nguồn tác nhân sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm.

Với mục đích phát hiện thêm nhiều nguồn vật liệu sinh học có thể đối kháng với các tác nhân gây bệnh hại cà phê, tôi đã sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây cà phê. Kết quả, từ 16 chủng xạ khuẩn đƣợc lƣu trữ tại bộ môn, có 6 chủng có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum. Trong số đó, chủng XK16 và XK88H có khả năng đối kháng mạnh nhất. XK88H sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 30℃, pH 7–8, chịu đƣợc độ mặn đến 3%, sử dụng tốt nguồn carbon: Dextrin, nguồn nitơ: Cao thịt, Peptone.

Chủng XK16 sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 35℃, pH 6 – 7, chịu đƣợc độ mặn đến 7%, sử dụng tốt các nguồn carbon: Dextrin, Sucrose, nguồn nitơ: Cao thịt và có khả năng sinh enzyme ngoại bào: cellulase, xylanase và amylase. Kết quả so sánh và phân tích trình tự nucleotide 16S rRNA của chủng xạ khuẩn với trình tự nucleotide trên GenBank cho thấy chủng xạ khuẩn XK16 có quan hệ họ hàng gần gũi với chủng Streptomyces krainskii RSU51 với sự giống nhau về trình tự là 98. Vì vậy, chủng này đƣợc đặt tên là: Streptomyces krainskii XK16. Cà phê là một loại cây nhiệt đới mọc ở độ cao 600 - 1800 m trên mực nƣớc biển.

Nó có nguồn gốc từ Ethiopia, lan rộng đầu tiên đến Ấn Độ và sau đó đến Indonesia, Brazil, Colombia và Trung Mỹ (Roberto et al. Hai giống cà phê đƣợc trồng phổ biến nhất trên thế giới là cà phê chè, và cà phê vối. Ở Việt Nam, cà phê thƣờng có 3 loài : cà phê vối , cà phê chè, cà phê mít. Cà phê chè (9%) và cà phê vối (90%) đƣợc trồng khá phổ biến trong khi đó cà phê mít (1%) đƣợc trồng rất ít.

Cây cà phê chè đƣợc trồng nhiều ở khu vực Bắc Bộ, đặc biệt là khu vực Bắc Trung Bộ, trong khi Tây Nguyên trở thành khu vực có diện tích trồng cà phê vối lớn nhất nƣớc ta (https://vori.vn/nguon-goc-va-su-phan-bo- cay-ca-phe-o-viet-nam). Cà phê là mặt hàng chủ lực có giá trị xuất khẩu lớn, và là mặt hàng năng suất đứng thứ hai về kim ngạch sau gạo, góp phần đẩy mạnh quá trình chuyển dịch cơ cấu kinh tế ở các địa phƣơng trồng nhiều cà phê. Trong những năm qua, cà phê luôn là một trong số ít những mặt hàng trọng yếu của nền kinh tế quốc dân. Hiện nay Việt Nam là quốc gia có sản lƣợng xuất khẩu cà phê nhân đứng thứ 2 trên thế giới, chỉ sau Brazil, duy trì đều đặn giá trị trên 3 tỷ USD/năm.

Ngành hàng này đang đƣợc chính phủ hƣớng đến nâng giá trị xuất khẩu lên mức 6 tỷ USD vào năm 2030 (Nguyễn Bá Thanh, 2020). Tuy nhiên, cây cà phê ở nƣớc ta thƣờng mắc phải một số bệnh phổ biến nhƣ bệnh thối cổ rễ và thối nứt thân (do Fusarium spp.), thối rễ tơ (do Rhizoctonia bataticola và Fusarium oxysporum), lở cổ rễ. Các bệnh này chủ yếu do các chủng nấm gây ra, đặc biệt là chủng nấm Fusarium oxysporum, làm giảm năng suất và chất lƣợng cây trồng. Cây mắc bệnh thƣờng biểu hiện nhƣ cây phát triển chậm, lá vàng dần, rễ tơ bị thối đen từ chóp rễ vào.

Cây bị bệnh nặng, rễ lớn cũng bị thối đen từ lớp vỏ ngoài vào làm cho cây bị kiệt sức vì không hấp thu đƣợc dinh dƣỡng nuôi cây, gốc bị long, phần cổ rễ thối đen, nhỏ lại so với thân, gỗ bên trong bị khô, bệnh phát triển và lây lan rất nhanh làm lá 1 héo vàng và cây bị chết. Hiện nay, thế giới đang hƣớng đến một nền nông nghiệp bền vững. Do đó, việc sử dụng các chủng vi sinh vật trong đấu tranh sinh học và phòng, trị bệnh đƣợc ƣa chuộng bởi vì tính thân thiện với môi trƣờng, không ảnh hƣởng tới chất lƣợng sản phẩm.