Sàng Lọc và Tuyển Chọn Xạ Khuẩn Chống Nấm Fusarium Oxysporum Trên Cây Cà Phê

Khóa luận nghiên cứu sàng lọc và tuyển chọn chủng xạ khuẩn đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây cà phê, hướng đến giải pháp bảo vệ cây trồng hiệu quả.

• Tác giả: Nguyễn Lan Nhi
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Giang
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây cà phê
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC BẢNG
• 3. DANH MỤC HÌNH
• 4. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 5. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 6. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 6.1. Tổng quan về xạ khuẩn
• 6.1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn
• 6.1.2. Đặc điểm về hình thái, cấu trúc
• 6.1.3. Đặc điểm sinh hóa lý
• 6.1.4. Ứng dụng của xạ khuẩn
• 6.2. Tổng quan về nấm gây bệnh trên cây cà phê
• 6.2.1. Tổng quan về cây cà phê
• 6.2.2. Tổng quan về tình hình sản xuất cà phê ở trên thế giới và Việt Nam
• 6.2.3. Các bệnh thường gặp trên cây cà phê
• 6.2.4. Tổng quan về chủng nấm Fusarium oxysporum
• 7. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 7.1. Nội dung nghiên cứu
• 7.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 7.3. Vật liệu nghiên cứu
• 7.3.1. Các chủng vi sinh vật
• 7.3.2. Hóa chất và thiết bị
• 7.4. Phương pháp nghiên cứu
• 7.4.1. Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng xạ khuẩn
• 7.4.2. Bảo quản giống
• 7.4.3. Đặc điểm sinh học
• 7.4.4. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn
• 7.4.5. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 7.4.6. Định danh chủng xạ khuẩn được tuyển chọn
• 7.4.7. Sàng lọc khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh cây của các chủng xạ khuẩn
• 7.4.8. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn
• 7.4.8.1. Đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng XK16 và XK88H trên môi trường Gause và ISP
• 7.4.8.2. Đặc điểm hệ sợi và cuống sinh bào tử
• 7.4.8.3. Đặc điểm hóa sinh
• 7.4.8.4. Khả năng sinh sắc tố Melanin
• 7.4.8.5. Ảnh hưởng của pH
• 7.4.8.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 7.4.8.7. Khả năng đồng hóa nguồn Carbon
• 7.4.8.8. Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ
• 7.4.8.9. Ảnh hưởng của nồng độ muối
• 7.4.8.10. Khả năng phân giải Citrate
• 7.4.8.11. Khả năng sinh Enzyme ngoại bào
• 7.4.9. Định danh chủng xạ khuẩn XK16
• 7.4.9.1. Tách chiết DNA
• 7.4.9.2. Khuếch đại trình tự 16S rRNA bằng phản ứng PCR
• 7.4.9.3. Định danh và phân tích bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA
• 8. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật quan trọng trong đất, thuộc chi Streptomyces, có khả năng sản xuất chất kháng sinh và phân giải các chất hữu cơ. Chúng phân bố rộng rãi trong môi trường đất, nước, và các chất hữu cơ khác. Xạ khuẩn có cấu trúc dạng sợi, sinh sản bằng bào tử và có khả năng chịu đựng điều kiện môi trường khắc nghiệt như pH, nhiệt độ, và độ mặn. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh học các bệnh thực vật, đặc biệt là bệnh do nấm Fusarium oxysporum gây ra.

1.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc

Xạ khuẩn có cấu trúc phức tạp với hai loại sợi chính: sợi khí sinh và sợi cơ chất. Sợi khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường, tạo bào tử, trong khi sợi cơ chất hấp thụ chất dinh dưỡng. Chúng có thành tế bào dày, chứa các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất. Bào tử của xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide, giúp chúng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi.

1.2. Đặc điểm sinh hóa lý

Xạ khuẩn phát triển tốt trong điều kiện pH từ 5 đến 11, nhiệt độ từ 20°C đến 40°C, và chịu được nồng độ muối lên đến 10%. Chúng có khả năng phân giải cellulose, lignin, và cố định nitơ. Ngoài ra, xạ khuẩn còn sản xuất các enzyme ngoại bào như cellulase, xylanase, và amylase, giúp chúng thích nghi với nhiều môi trường khác nhau.

II. Bệnh cà phê và nấm Fusarium oxysporum

Bệnh cà phê do nấm Fusarium oxysporum gây ra là một trong những vấn đề nghiêm trọng trong sản xuất cà phê. Nấm này xâm nhập vào rễ cây, gây thối rễ và làm giảm năng suất cây trồng. Fusarium oxysporum là loại nấm đất, có khả năng tồn tại lâu dài trong đất và lây lan nhanh chóng. Các biện pháp kiểm soát bệnh hiện nay chủ yếu dựa vào hóa chất, nhưng việc sử dụng xạ khuẩn như một biện pháp sinh học đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi.

2.1. Tác hại của Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum gây ra các bệnh như thối cổ rễ, thối nứt thân, và thối rễ tơ trên cây cà phê. Cây bị bệnh thường có biểu hiện lá vàng, rễ thối đen, và chết dần. Bệnh này làm giảm năng suất và chất lượng cà phê, gây thiệt hại lớn cho ngành sản xuất.

2.2. Biện pháp phòng trừ bệnh

Hiện nay, việc sử dụng xạ khuẩn như Streptomyces để kiểm soát Fusarium oxysporum đang được ưa chuộng do tính thân thiện với môi trường và hiệu quả cao. Xạ khuẩn tiết ra các chất kháng sinh ức chế sự phát triển của nấm bệnh, giúp bảo vệ cây trồng một cách bền vững.

III. Tuyển chọn xạ khuẩn chống Fusarium oxysporum

Nghiên cứu tập trung vào việc tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với Fusarium oxysporum. Từ 16 chủng xạ khuẩn được lưu trữ, 6 chủng có hoạt tính kháng nấm, trong đó chủng XK16 và XK88H được đánh giá cao nhất. Các chủng này có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện pH và nhiệt độ khác nhau, đồng thời sản xuất các enzyme ngoại bào có lợi.

3.1. Đặc điểm của chủng XK16 và XK88H

Chủng XK16 sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 35°C, pH 6-7, và chịu được độ mặn lên đến 7%. Chủng XK88H phát triển tốt ở nhiệt độ 30°C, pH 7-8, và chịu được độ mặn đến 3%. Cả hai chủng đều có khả năng sinh enzyme ngoại bào như cellulase, xylanase, và amylase, giúp chúng thích nghi với nhiều môi trường khác nhau.

3.2. Ứng dụng trong phòng trừ bệnh

Kết quả nghiên cứu cho thấy XK16 và XK88H có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát Fusarium oxysporum trên cây cà phê. Việc sử dụng các chủng xạ khuẩn này như một biện pháp sinh học không chỉ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh mà còn góp phần bảo vệ môi trường và nâng cao chất lượng sản phẩm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cà phê là một trong những cây công nghiệp nhiệt đới quan trọng nhất tại Việt Nam. Về cơ cấu canh tác, diện tích cà phê vối (Coffea canephora) chiếm khoảng 90% diện tích cả nước, tập trung chủ yếu ở khu vực Tây Nguyên; cà phê chè (Coffea arabica) chiếm khoảng 9%, phân bố tập trung ở vùng Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ; diện tích còn lại là cà phê mít (Coffea liberica, 1%). Trong cán cân kinh tế nông nghiệp, cà phê đóng góp khoảng 3% GDP quốc gia, duy trì kim ngạch xuất khẩu nhân hàng năm đạt trên 3 tỷ USD (chiếm 15% tổng giá trị xuất khẩu nông sản cả nước, đứng thứ hai thế giới sau Brazil). Định hướng phát triển đến năm 2030 của chính phủ là nâng giá trị xuất khẩu cà phê lên mức 6 tỷ USD.

Tuy nhiên, vùng chuyên canh cà phê nước ta thường xuyên chịu tổn thất nghiêm trọng do các loại bệnh hại có nguồn gốc từ đất, điển hình là bệnh thối cổ rễ, bệnh thối nứt thân, bệnh lở cổ rễ và bệnh thối rễ tơ. Các bệnh này do phức hợp nấm đất gây ra, trong đó loài nấm Fusarium oxysporum là tác nhân phổ biến và nguy hiểm nhất (bệnh thối rễ tơ còn có sự kết hợp của Rhizoctonia bataticola). Nấm bệnh xâm nhập vào hệ thống mao mạch dẫn hoặc làm thối đen rễ cọc và rễ tơ, khiến phần cổ rễ teo nhỏ, khô gỗ, cản trở khả năng hấp thụ nước và dinh dưỡng, làm cây vàng lá nhanh chóng và chết hàng loạt. Các biện pháp hóa học (như xử lý đất bằng methyl bromide hay thuốc bảo vệ thực vật) gây ô nhiễm môi trường đất, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và làm mất cân bằng hệ vi sinh vật bản địa. Do đó, việc ứng dụng biện pháp đấu tranh sinh học bằng các nhóm vi sinh vật đối kháng có nguồn gốc tự nhiên, đặc biệt là xạ khuẩn chi Streptomyces, đang là xu hướng cấp thiết để quản lý bệnh hại bền vững.

Đề tài đặt ra hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Sàng lọc và tuyển chọn, khảo sát một số đặc điểm của các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và đối kháng với nấm Fusarium oxysporum của các chủng xạ khuẩn được chọn.

Nội dung và phạm vi nghiên cứu được xác lập như sau:

• Đối tượng nghiên cứu: 16 chủng xạ khuẩn thuộc bộ sưu tập lưu trữ tại Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; 03 chủng nấm kiểm định Fusarium oxysporum (ký hiệu: Foc1, Foc2, Foc3) do TS. Phạm Hồng Hiển (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) cung cấp.
• Không gian nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 01/10/2021 đến ngày 30/04/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Về mặt lý luận và phân loại vi sinh vật, xạ khuẩn (Actinomycetes) là nhóm vi khuẩn Gram dương hoại sinh, hiếu khí, nhân sơ, phân loại thuộc bộ Actinomycetales, họ Streptomycetaceae, trong đó chi Streptomyces chiếm ưu thế lớn nhất trong đất (khoảng 95% các chủng phân lập). Tỷ lệ Guanine - Cytosine (G + C) trong phân tử DNA của xạ khuẩn đạt từ 69% đến 78%. Xạ khuẩn phát triển thành hệ khuẩn ty dạng sợi phân nhánh gồm khuẩn ty cơ chất (KTCC) ăn sâu vào môi trường và khuẩn ty khí sinh (KTKS) phát triển trên bề mặt để sinh cuống và chuỗi bào tử vô tính. Xạ khuẩn có khả năng chuyển hóa thứ cấp rất cao, sản sinh hơn 60% các hợp chất kháng sinh tự nhiên đã được phát hiện, cùng các enzyme ngoại bào phân giải cơ chất (cellulase, xylanase, amylase, protease, chitinase) giúp ức chế và làm tan vách tế bào nấm gây bệnh. Đối tượng nấm đối kháng là Fusarium oxysporum, loài nấm hoại sinh và ký sinh gây héo mạch dẫn, sinh sản vô tính với ba dạng bào tử: bào tử nhỏ (microconidia: 5 - 7 × 2 - 3 µm), bào tử lớn (macroconidia hình liềm: 22 - 36 × 4 - 5 µm) và bào tử hậu vách dày (chlamydospores: 7 - 9 µm).

Khóa luận triển khai các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm tiêu chuẩn trong vi sinh vật học:

• Phương pháp đồng nuôi cấy in vitro (Dhanasekaran et al., 2012): Đánh giá hoạt tính kháng nấm trên đĩa môi trường thạch PDA (Potato Dextrose Agar). Xạ khuẩn được cấy ria cách mép đĩa 1 cm, nuôi 3 ngày ở 30°C; sau đó cấy miếng thạch nấm đường kính 5 mm ở vị trí đối diện (cách mép 1 cm). Đĩa đối chứng cấy nấm ở trung tâm. Sau 7 ngày, hiệu suất ức chế (PI) được tính theo công thức: $$\text{PI} = \frac{C - T}{C} \times 100$$ Trong đó $C$ là bán kính nấm đối chứng (mm), $T$ là bán kính nấm phần tiếp giáp xạ khuẩn (mm).
• Phương pháp khảo sát đặc điểm sinh học và hình thái: Quan sát màu sắc KTCC và KTKS theo hệ thống môi trường chuẩn ISP (Shirling & Gottlieb, 1966) gồm ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 và môi trường Gause I, Gause II sau 7, 14 và 21 ngày nuôi cấy ở 30°C. Quan sát cuống sinh bào tử bằng kỹ thuật găm lamen nghiêng 45° trên môi trường Gause I dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần.
• Phương pháp đánh giá đặc tính sinh lý và hóa sinh:
  • Khả năng sinh sắc tố melanin: Đánh giá trên môi trường ISP6 ở 30°C qua 21 ngày theo dõi đổi màu môi trường.
  • Ảnh hưởng của nhiệt độ (30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C), pH môi trường (từ pH 4 đến 12) và nồng độ muối NaCl (0% đến 7%) trên môi trường Gause I.
  • Khả năng đồng hóa nguồn carbon: Môi trường cơ bản ISP9 bổ sung 1% các loại đường (maltose, D-xylose, dextrin, lactose, D-glucose, sucrose).
  • Khả năng đồng hóa nguồn nitơ: Môi trường ISP9 bổ sung 0,1% các hợp chất nitơ ($\text{NaNO}_3$, $\text{KNO}_3$, $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$, urea, cao thịt - meat extract, peptone).
  • Khả năng phân giải citrate: Nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng Simmons Citrate Agar (SCA) ở 30°C trong 5 - 7 ngày, ghi nhận sự đổi màu chỉ thị.
  • Hoạt tính enzyme ngoại bào: Thu dịch chiết enzyme từ môi trường lỏng Gause I sau 7 ngày nuôi lắc (200 vòng/phút), ly tâm 8.000 vòng/phút trong 15 phút. Nhỏ 100 µl dịch enzyme vào lỗ thạch chứa cơ chất tương ứng: casein (protease), tinh bột tan (amylase), xylan (xylanase), CMC (cellulase). Đánh giá qua hiệu số $D - d$ (mm), với $D$ là đường kính vòng phân giải và $d$ là đường kính lỗ thạch.
• Phương pháp định danh sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA tổng số: Áp dụng phương pháp của Farhad Masoomi-Aladizgeh và cộng sự (2016) có cải tiến, sử dụng hệ dung môi Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25:24:1) và Chloroform : Isoamylalcohol (24:1), tủa DNA bằng ethanol lạnh và hòa tan trong đệm TE.
  • Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA: Sử dụng cặp mồi phổ biến 27F và 1492R. Thành phần phản ứng (tổng thể tích 20 µl) gồm: 10 µl PCR Master mix 2X, 1 µl mồi xuôi 27F (10 µM), 1 µl mồi ngược 1492R (10 µM), 1 µl DNA khuôn, 7 µl nước cất PCR. Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; tiếp theo là 29 chu kỳ gồm (94°C trong 30 giây, 53°C trong 30 giây, 72°C trong 1 phút); kéo dài chuỗi ở 72°C trong 10 phút; giữ mẫu tại 4°C.
  • Phân tích trình tự: Kiểm tra sản phẩm qua điện di gel agarose 1,5%, giải trình tự gen, so sánh độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên GenBank và thiết lập cây phân loại chủng loài bằng phần mềm MEGA X.

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về xạ khuẩn và nấm gây bệnh thực vật:

• Giới thiệu chi tiết vị trí phân loại, cấu tạo thành tế bào peptidoglycan dày 10 - 20 nm gồm $N$-acetylglucosamine và acid $N$-acetylmuramic, đặc tính không chứa cellulose hay chitin. Phân tích chức năng sinh thái của xạ khuẩn trong đất, khả năng sinh chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học, chiếm gần 70% các loại thuốc kháng sinh vi sinh thương mại (blasticidin-S, kasugamycin, polyoxin, validamycin, streptomycin).
• Đánh giá hiện trạng sản xuất cà phê thế giới (khoảng 75 quốc gia, sản lượng trên dưới 6 triệu tấn/năm) và Việt Nam (xuất khẩu trên 3 tỷ USD/năm, thị trường EU chiếm 40% sản lượng).
• Phân tích bệnh học bốn hội chứng bệnh chính trên cà phê: bệnh lở cổ rễ (do Rhizoctonia sp., Fusarium oxysporum, Pythium sp.), bệnh thối cổ rễ (chủ yếu do Fusarium spp.), bệnh thối nứt thân (do Fusarium spp. làm tắc mạch dẫn) và bệnh thối rễ tơ (do Rhizoctonia bataticola kết hợp Fusarium oxysporum). Trình bày đặc điểm hình thái, cơ chế xâm nhiễm xylem của nấm Fusarium oxysporum và các hạn chế của việc dùng hóa chất xông hơi đất.

Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này thiết lập chi tiết toàn bộ vật tư, trang thiết bị và các bước thực nghiệm:

• Liệt kê đầy đủ 16 chủng xạ khuẩn của Bộ môn Công nghệ Vi sinh và 3 chủng nấm Fusarium oxysporum (Foc1, Foc2, Foc3).
• Chi tiết hóa chất dinh dưỡng (các loại đường, muối vô cơ, peptone, cao thịt, cao nấm men, agar) và hệ thống thiết bị phòng thí nghiệm (máy đo pH, máy ly tâm lạnh, tủ cấy vô trùng, máy khuấy từ, buồng chụp gel BioDoc-It).
• Cung cấp chính xác công thức điều chế các loại môi trường dinh dưỡng chuẩn: PDA, Gause I, Gause II, ISP1 đến ISP7, ISP9 và các dung dịch muối khoáng vi lượng.
• Quy chuẩn hóa các thao tác thực nghiệm: bảo quản giống trong ống thạch nghiêng Gause I ở 4 - 6°C (cấy chuyền sau 2 - 3 tháng) hoặc lưu trữ trong paraffin lỏng, glycerin lạnh sâu và đông khô; quy trình sàng lọc đối kháng in vitro; khảo sát đặc điểm sinh lý - hóa sinh; quy trình chiết xuất DNA và phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương kết quả thể hiện các số liệu thực nghiệm thu thập được qua các nội dung chính:

1. Sàng lọc khả năng đối kháng nấm Fusarium oxysporum: Thử nghiệm trên 16 chủng xạ khuẩn ban đầu xác định được 6 chủng có hoạt tính ức chế nấm kiểm định gồm: XK16, XKC9, XKC10, XK4, XK88H, XK61. Chủng XK16 có phổ ức chế rộng nhất, đối kháng với cả 3 chủng nấm Fusarium oxysporum (Foc1, Foc2, Foc3) và một số chủng nấm khác (Trichoderma, Diaporthe sp.). Chủng XK88H đối kháng mạnh với Foc1. Hai chủng ưu tú nhất được chọn để nghiên cứu chuyên sâu là XK16 và XK88H.

Bảng tổng hợp hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn (%):

Chủng xạ khuẩn	Đối kháng nấm Foc1 (%)	Đối kháng nấm Foc2 (%)	Đối kháng nấm Foc3 (%)
XK16	43,4	Có hoạt tính	Có hoạt tính
XKC9	Có hoạt tính	-	-
XKC10	Có hoạt tính	-	-
XK4	Có hoạt tính	-	-
XK88H	Hoạt tính mạnh	-	-
XK61	Có hoạt tính	-	Có hoạt tính

(Ghi chú: "-" là không thể hiện hoạt tính đối kháng).

2. Đặc điểm hình thái và nuôi cấy của chủng XK16 và XK88H: Màu sắc khuẩn ty của hai chủng có sự khác biệt rõ nét trên 9 môi trường nuôi cấy chuẩn sau 21 ngày:

• Chủng XK16: Khuẩn ty khí sinh (KTKS) và khuẩn ty cơ chất (KTCC) có màu chủ đạo là trắng và nâu. Trên môi trường ISP1, KTCC vàng nâu, KTKS nâu; trên ISP2, cả KTCC và KTKS đều có màu nâu; trên ISP3, KTCC trắng, KTKS nâu; trên ISP4, KTCC vàng nâu, KTKS nâu; trên ISP5, KTCC vàng, KTKS xám; trên ISP6, KTCC vàng, KTKS trắng; trên ISP7, KTCC be, KTKS nâu; trên Gause I, KTCC vàng nâu, KTKS nâu; trên Gause II, KTCC vàng, KTKS trắng. Hệ sợi khí sinh dạng uốn lượn, phân nhánh xuất hiện sau 48 giờ; cuống sinh bào tử dạng móc câu xuất hiện sau 96 giờ và bắt đầu phát tán bào tử sau 102 giờ nuôi cấy.
• Chủng XK88H: Màu sắc đặc trưng là vàng và hồng. Trên ISP1 và Gause I, KTCC màu vàng, KTKS màu hồng; trên ISP2, KTCC nâu, KTKS hồng; trên ISP3, cả KTCC và KTKS đều có màu hồng; trên ISP4, KTCC và KTKS màu nâu; trên ISP5, KTCC và KTKS màu vàng; trên ISP6, KTCC và KTKS màu nâu xám; trên ISP7 và Gause II, KTCC vàng, KTKS trắng. Hệ sợi khí sinh dạng thẳng, phân nhánh sau 24 giờ; cuống sinh bào tử dạng thẳng, phân đốt xuất hiện sau 36 giờ và phát tán bào tử mạnh sau 42 giờ.

3. Đặc điểm hóa sinh và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy:

• Khả năng sinh sắc tố melanin: Chủng XK88H có khả năng sinh sắc tố melanin trên môi trường ISP6 (làm đổi màu môi trường từ vàng nhạt sang nâu đen sau 7 ngày). Chủng XK16 hoàn toàn âm tính với khả năng sinh sắc tố melanin.
• Ảnh hưởng của pH môi trường: Chủng XK16 sinh trưởng được trong dải pH rất rộng từ pH 4 đến pH 12, sinh trưởng mạnh nhất ở pH 6 - 7. Chủng XK88H chỉ phát triển trong dải pH 6 - 12, sinh trưởng mạnh nhất ở pH 7 - 8. Về hoạt tính kháng nấm, XK88H ức chế mạnh nhất nấm Foc1 ở pH 7 sau 7 ngày nuôi cấy.

Bảng mức độ sinh trưởng của XK16 và XK88H theo thang pH:

Chủng xạ khuẩn	pH 4	pH 5	pH 6	pH 7	pH 8	pH 9	pH 10	pH 11	pH 12
XK16	+	++	+++	+++	++	++	+	+	+
XK88H	-	-	++	+++	+++	++	++	+	+

(Ghi chú: +++: sinh trưởng mạnh; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng yếu; -: không sinh trưởng).

• Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ muối: Chủng XK16 sinh trưởng tối ưu ở 35°C, có khả năng chịu mặn tốt, sinh trưởng được ở nồng độ NaCl lên đến 7%. Chủng XK88H sinh trưởng tối ưu ở 30°C, chịu được nồng độ NaCl tối đa 3%.
• Đồng hóa carbon và nitơ: Chủng XK16 sử dụng tốt các nguồn carbon gồm Dextrin, Sucrose và nguồn nitơ cao thịt (meat extract). Chủng XK88H đồng hóa tốt nguồn carbon Dextrin và các nguồn nitơ gồm cao thịt và Peptone. Cả hai chủng đều có khả năng phân giải citrate trên môi trường SCA (làm kiềm hóa môi trường, chuyển màu sang xanh lam).
• Hoạt tính enzyme ngoại bào: Chủng XK16 thể hiện hoạt tính sinh ba loại enzyme ngoại bào quan trọng gồm cellulase, xylanase và amylase (tạo vòng phân giải trong suốt trên đĩa thạch chứa CMC, xylan và tinh bột sau khi nhuộm thuốc thử Lugol).

4. Định danh sinh học phân tử chủng XK16: Tách chiết thành công DNA tổng số của chủng XK16. Phản ứng PCR với cặp mồi 27F/1492R khuếch đại phân đoạn gen 16S rRNA đặc hiệu. Kết quả giải trình tự nucleotide và đối sánh bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank cho thấy trình tự gen 16S rRNA của chủng XK16 có độ tương đồng đạt 98% với chủng Streptomyces krainskii RSU51. Trên cơ sở đối sánh phân loại và hình thái học, chủng XK16 được định danh khoa học là Streptomyces krainskii XK16.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã đạt được các kết quả thực nghiệm định lượng rõ ràng:

• Sàng lọc từ 16 chủng xạ khuẩn ban đầu, xác định được 6 chủng có hoạt tính đối kháng nấm bệnh, trong đó chọn lọc được 2 chủng có hoạt lực mạnh nhất là XK16 và XK88H.
• Xác định toàn diện các đặc tính sinh học, điều kiện sinh lý - hóa sinh tối ưu của hai chủng:

Bảng tổng hợp đặc tính sinh học của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn:

Chỉ tiêu sinh học / sinh lý	Chủng XK16	Chủng XK88H
Tỷ lệ đối kháng nấm Foc1	43,4% (kháng cả Foc2, Foc3)	Hoạt tính đối kháng mạnh Foc1
Thời gian hình thành bào tử	96 giờ (cuống dạng móc câu)	36 giờ (cuống dạng thẳng, phân đốt)
Sắc tố Melanin (ISP6)	Âm tính (không sinh)	Dương tính (môi trường chuyển nâu đen)
Khoảng pH sinh trưởng	4 - 12 (tối ưu: 6 - 7)	6 - 12 (tối ưu: 7 - 8)
Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu	35°C	30°C
Giới hạn chịu mặn (NaCl)	Đến 7%	Đến 3%
Nguồn carbon sử dụng tốt	Dextrin, Sucrose	Dextrin
Nguồn nitơ sử dụng tốt	Cao thịt	Cao thịt, Peptone
Enzyme ngoại bào	Cellulase, xylanase, amylase	Không xác định hoạt tính vượt trội
Tên định danh phân tử	Streptomyces krainskii XK16 (tương đồng 98%)	Chưa phân tích giải trình tự gen

Về mặt đóng góp khoa học và thực tiễn, đề tài bổ sung vào ngân hàng chủng giống vi sinh vật một chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học cao (Streptomyces krainskii XK16), cung cấp tập hợp số liệu về điều kiện nuôi cấy tối ưu (nguồn carbon, nitơ, pH, độ mặn, nhiệt độ). Các dữ liệu này là cơ sở trực tiếp phục vụ quy trình nhân giống, nuôi sinh khối và xây dựng chế phẩm vi sinh đối kháng sinh học để kiểm soát nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây cà phê.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận có các giới hạn nghiên cứu được xác định theo nội dung văn bản:

• Tất cả các thí nghiệm sàng lọc đối kháng và khảo sát đặc tính sinh học mới dừng lại ở quy mô thử nghiệm in vitro trong phòng thí nghiệm; chưa tiến hành đánh giá hiệu lực đối kháng của xạ khuẩn đối với nấm bệnh trên cây cà phê con trong điều kiện nhà lưới hay trên vườn ươm thực tế.
• Việc định danh sinh học phân tử bằng giải trình tự đoạn gen 16S rRNA mới chỉ được thực hiện trên chủng XK16, chưa triển khai giải trình tự phân tử để định danh loài cho chủng XK88H.
• Đề tài chưa tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất kháng sinh cụ thể được tiết ra trong dịch nuôi cấy của hai chủng xạ khuẩn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được mở rộng:

• Khảo sát các điều kiện lên men quy mô bán công nghiệp để thu nhận chất kháng sinh thứ cấp từ chủng Streptomyces krainskii XK16.
• Thực hiện thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo nấm Fusarium oxysporum và xử lý chế phẩm xạ khuẩn trên cây cà phê trong nhà lưới nhằm đánh giá tỷ lệ giảm bệnh thực tế.

Giá trị tham khảo

Công trình là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Nông nghiệp và Bảo vệ thực vật.

Các phần nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng cao bao gồm:

• Quy trình chuẩn đánh giá hình thái xạ khuẩn trên hệ thống môi trường ISP (ISP1 đến ISP7) và môi trường Gause.
• Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số từ hệ sợi xạ khuẩn bằng phương pháp Phenol : Chloroform cải tiến và các thông số chu trình nhiệt khuếch đại gen 16S rRNA bằng cặp mồi 27F/1492R.
• Phương pháp luận đồng nuôi cấy in vitro xác định phần trăm ức chế (PI) và quy trình thử nghiệm hoạt tính enzyme ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.

Câu hỏi thường gặp

1. Trong số các chủng khảo sát, những chủng xạ khuẩn nào thể hiện hoạt tính đối kháng với nấm Fusarium oxysporum? Trong số 16 chủng xạ khuẩn ban đầu từ bộ sưu tập của Bộ môn Công nghệ Vi sinh, có 6 chủng có hoạt tính đối kháng gồm: XK16, XKC9, XKC10, XK4, XK88H và XK61. Trong đó, chủng XK16 và XK88H có khả năng đối kháng mạnh nhất; XK16 ức chế được cả 3 chủng nấm kiểm định (Foc1, Foc2, Foc3), còn XK88H đối kháng mạnh với Foc1.

2. Điểm khác biệt rõ rệt nhất về mặt hình thái và chu vi phát triển bào tử giữa hai chủng XK16 và XK88H là gì? Chủng XK88H có khuẩn ty khí sinh dạng thẳng, phân nhánh sau 24 giờ nuôi cấy; hình thành cuống sinh bào tử thẳng phân đốt sau 36 giờ và phát tán bào tử sau 42 giờ. Ngược lại, chủng XK16 có khuẩn ty khí sinh dạng uốn lượn xuất hiện sau 48 giờ; hình thành chuỗi sinh bào tử dạng móc câu sau 96 giờ và phát tán bào tử chậm hơn, sau 102 giờ nuôi cấy.

3. Giới hạn chịu mặn và khoảng pH thích hợp cho sinh trưởng của hai chủng XK16 và XK88H được ghi nhận như thế nào? Chủng XK16 có dải thích nghi môi trường rộng hơn: sinh trưởng được ở dải pH từ 4 đến 12 (tối ưu ở pH 6 - 7) và chịu được nồng độ muối NaCl lên tới 7%. Chủng XK88H chỉ phát triển ở dải pH từ 6 đến 12 (tối ưu ở pH 7 - 8) và chỉ chịu được độ mặn tối đa là 3% NaCl.

4. Chủng xạ khuẩn XK16 sinh được những loại enzyme ngoại bào nào? Qua phương pháp khuếch tán đĩa thạch với các cơ chất chuyên biệt, chủng XK16 được xác định có khả năng sinh ba loại enzyme ngoại bào gồm: cellulase (phân giải cơ chất carboxymethyl cellulose - CMC), xylanase (phân giải xylan) và amylase (phân giải tinh bột).

5. Kết quả phân tích trình tự phân tử gen 16S rRNA của chủng XK16 cho biết thông tin gì về tên loài? Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA được khuếch đại bằng cặp mồi 27F/1492R và so sánh BLAST trên GenBank cho thấy chủng XK16 có độ tương đồng trình tự 98% với chủng Streptomyces krainskii RSU51. Do đó, chủng xạ khuẩn này được định danh và đặt tên là Streptomyces krainskii XK16.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Lan Nhi đã thực hiện thành công việc sàng lọc 16 chủng xạ khuẩn, tuyển chọn được hai chủng XK16 và XK88H có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây cà phê. Nghiên cứu đã xác lập hệ thống dữ liệu chi tiết về đặc điểm hình thái, đặc tính hóa sinh, khả năng thích ứng nhiệt độ, pH, độ mặn, phổ sử dụng carbon - nitơ và hoạt tính enzyme ngoại bào của hai chủng tuyển chọn. Bằng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự vùng gen 16S rRNA, đề tài đã định danh chính xác chủng XK16 là Streptomyces krainskii XK16 với độ tương đồng 98%. Các kết quả thu được là nguồn dẫn liệu thực nghiệm tin cậy, đóng góp vật liệu sinh học quan trọng cho định hướng nghiên cứu và phát triển chế phẩm sinh học bảo vệ cây cà phê.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------------------***------------------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÀ PHÊ Hà Nội, 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------------------***------------------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÀ PHÊ Họ và tên sinh viên : Nguyễn Lan Nhi Mã sinh viên : 637161 Lớp : K63CNSHB Giảng viên hƣớng dẫn : PGS. Nguyễn Văn Giang Hà Nội, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực và chƣa hề sử dụng trong bất kỳ công bố nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Lan Nhi i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Thầy PGS.TS Nguyễn Văn Giang đã quan tâm, chỉ bạo, dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm đề tài tốt nghiệp. Cảm ơn các bạn, các anh chị đang học tập và làm việc tại Bộ môn Công nghệ vi sinh đã đồng hành cùng tôi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong công việc. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ và gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại Học viện. Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Lan Nhi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC BẢNG. vi DANH MỤC HÌNH. vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.

Mục tiêu nghiên cứu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về xạ khuẩn. Giới thiệu về xạ khuẩn.

Đặc điểm về hình thái, cấu trúc. Đặc điểm sinh hóa lý. Ứng dụng của xạ khuẩn. Tổng quan về nấm gây bệnh trên cây cà phê.

Tổng quan về cây cà phê. Tổng quan về tình hình sản xuất cà phê ở trên thế giới và Việt Nam. Các bệnh thƣờng gặp trên cây cà phê. Tổng quan về chủng nấm Fusarium oxysporum.

NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nội dung nghiên cứu. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Các chủng vi sinh vật. Hóa chất và thiết bị. Phƣơng pháp nghiên cứu. Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng xạ khuẩn.

Bảo quản giống. Đặc điểm sinh học. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn. Khả năng sinh enzyme ngoại bào.

Định danh chủng xạ khuẩn đƣợc tuyển chọn. Sàng lọc khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh cây của các chủng xạ khuẩn. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn. Đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng XK16 và XK88H trên môi trƣờng Gause và ISP.

Đặc điểm hệ sợi và cuống sinh bào tử. Đặc điểm hóa sinh. Khả năng sinh sắc tố Melanin. Ảnh hƣởng của pH.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ. Khả năng đồng hóa nguồn Carbon. Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ. Ảnh hƣởng của nồng độ muối.

Khả năng phân giải Citrate. Khả năng sinh Enzyme ngoại bào. Định danh chủng xạ khuẩn XK16. Tách chiết DNA.

Khuếch đại trình tự 16S rRNA bằng phản ứng PCR. Định danh và phân tích bằng phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. TÀI LIỆU THAM KHẢO.

62 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4. Hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn với một số nấm gây bệnh(%). Đặc điểm hình thái của chủng XK16 và chủng XK88H trên các môi trƣờng khác nhau. Ảnh hƣởng của pH tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. Ảnh hƣởng của nguồn carbon tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. Nồng độ muối thích hợp của 2 chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình ảnh xạ khuẩn. Sự hình thành hai loại khuẩn ty sau khi bào tử xạ khuẩn nẩy mầm.

Một số dạng cuống sinh bào tử của xạ khuẩn. Cây cà phê. Cây cà phê bị lở cổ rễ (https://www.vn/ca-phe). Cây cà phê bị thối cổ rễ (https://www.vn/ca-phe).

Cây cà phê bị thối nứt thân. Cây cà phê bị thối rễ tơ (https://www.vn/ca-phe). Bào tử nấm Fusarium oxysporum. Khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum 3 của chủng XK16 sau 10 ngày nuôi cấy.

Khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum 1 của chủng XK88H sau 14 ngày nuôi cấy. Đặc điểm hình thái của chủng XK16 trên các môi trƣờng khác nhau sau 21 ngày nuôi cấy. Khuẩn ty khí sinh (A), cuống sinh bào tử (B) của xạ khuẩn XK88H. Đặc điểm khuẩn ty khí sinh (A) và cuống sinh bào tử (B) của xạ khuẩn XK16.

Xạ khuẩn XK88H(A) và XK16(B) trên môi trƣờng ISP6 sau 7 ngày nuôi cấy. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng kháng nấm sau 7 ngày nuôi cấy của chủng XK88H. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng kháng nấm sau 6 ngày nuôi cấy của chủng XK16. Khả năng sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn XK16(A) và XK88H(B) tƣơng ứng với nồng độ muối 0,5 %.

Khả năng phân giải Citrate của hai chủng XK16 và XK88H. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn XK16. Kết quả điện di tổng số của chủng XK16. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại với đoạn mồi thuộc vùng 16S rRNA của chủng xạ khuẩn XK16.

Xác định loài của chủng XK16 nhờ so sánh trình tự nucleotide trên GenBank. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rRNA của chủng XK16. 49 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT µl : Microliter CMC : Carboxymethyl cellulose Cs : Cộng sự DNA : Deoxyribonucleic acid KTCC : Khuẩn ty cơ chất KTKS : Khuẩn ty khí sinh ISP : International Streptomyces Project PDA : Potato dextrose agar RNA : Ribonucleic acid XK : Xạ khuẩn mm : Milimet g : Gram ml : Mililit G + C : Guanine + Cytosine ix TÓM TẮT Fusarium oxysporum có khả năng gây bệnh cho các loài thực vật khác nhau đặc biệt là trên cây cà phê, chúng xâm nhập vào rễ gây thối rễ hoặc nhiễm trùng hô hấp khi chúng xâm nhập vào hệ thống mao mạch. Trong số các tác nhân sinh học thƣờng đƣợc sử dụng để ức chế vi sinh vật gây bệnh, xạ khuẩn là một trong những nguồn tác nhân sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm.

Với mục đích phát hiện thêm nhiều nguồn vật liệu sinh học có thể đối kháng với các tác nhân gây bệnh hại cà phê, tôi đã sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây cà phê. Kết quả, từ 16 chủng xạ khuẩn đƣợc lƣu trữ tại bộ môn, có 6 chủng có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum. Trong số đó, chủng XK16 và XK88H có khả năng đối kháng mạnh nhất. XK88H sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 30℃, pH 7–8, chịu đƣợc độ mặn đến 3%, sử dụng tốt nguồn carbon: Dextrin, nguồn nitơ: Cao thịt, Peptone.

Chủng XK16 sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 35℃, pH 6 – 7, chịu đƣợc độ mặn đến 7%, sử dụng tốt các nguồn carbon: Dextrin, Sucrose, nguồn nitơ: Cao thịt và có khả năng sinh enzyme ngoại bào: cellulase, xylanase và amylase. Kết quả so sánh và phân tích trình tự nucleotide 16S rRNA của chủng xạ khuẩn với trình tự nucleotide trên GenBank cho thấy chủng xạ khuẩn XK16 có quan hệ họ hàng gần gũi với chủng Streptomyces krainskii RSU51 với sự giống nhau về trình tự là 98. Vì vậy, chủng này đƣợc đặt tên là: Streptomyces krainskii XK16. Cà phê là một loại cây nhiệt đới mọc ở độ cao 600 - 1800 m trên mực nƣớc biển.

Nó có nguồn gốc từ Ethiopia, lan rộng đầu tiên đến Ấn Độ và sau đó đến Indonesia, Brazil, Colombia và Trung Mỹ (Roberto et al. Hai giống cà phê đƣợc trồng phổ biến nhất trên thế giới là cà phê chè, và cà phê vối. Ở Việt Nam, cà phê thƣờng có 3 loài : cà phê vối , cà phê chè, cà phê mít. Cà phê chè (9%) và cà phê vối (90%) đƣợc trồng khá phổ biến trong khi đó cà phê mít (1%) đƣợc trồng rất ít.

Cây cà phê chè đƣợc trồng nhiều ở khu vực Bắc Bộ, đặc biệt là khu vực Bắc Trung Bộ, trong khi Tây Nguyên trở thành khu vực có diện tích trồng cà phê vối lớn nhất nƣớc ta (https://vori.vn/nguon-goc-va-su-phan-bo- cay-ca-phe-o-viet-nam). Cà phê là mặt hàng chủ lực có giá trị xuất khẩu lớn, và là mặt hàng năng suất đứng thứ hai về kim ngạch sau gạo, góp phần đẩy mạnh quá trình chuyển dịch cơ cấu kinh tế ở các địa phƣơng trồng nhiều cà phê. Trong những năm qua, cà phê luôn là một trong số ít những mặt hàng trọng yếu của nền kinh tế quốc dân. Hiện nay Việt Nam là quốc gia có sản lƣợng xuất khẩu cà phê nhân đứng thứ 2 trên thế giới, chỉ sau Brazil, duy trì đều đặn giá trị trên 3 tỷ USD/năm.

Ngành hàng này đang đƣợc chính phủ hƣớng đến nâng giá trị xuất khẩu lên mức 6 tỷ USD vào năm 2030 (Nguyễn Bá Thanh, 2020). Tuy nhiên, cây cà phê ở nƣớc ta thƣờng mắc phải một số bệnh phổ biến nhƣ bệnh thối cổ rễ và thối nứt thân (do Fusarium spp.), thối rễ tơ (do Rhizoctonia bataticola và Fusarium oxysporum), lở cổ rễ. Các bệnh này chủ yếu do các chủng nấm gây ra, đặc biệt là chủng nấm Fusarium oxysporum, làm giảm năng suất và chất lƣợng cây trồng. Cây mắc bệnh thƣờng biểu hiện nhƣ cây phát triển chậm, lá vàng dần, rễ tơ bị thối đen từ chóp rễ vào.

Cây bị bệnh nặng, rễ lớn cũng bị thối đen từ lớp vỏ ngoài vào làm cho cây bị kiệt sức vì không hấp thu đƣợc dinh dƣỡng nuôi cây, gốc bị long, phần cổ rễ thối đen, nhỏ lại so với thân, gỗ bên trong bị khô, bệnh phát triển và lây lan rất nhanh làm lá 1 héo vàng và cây bị chết. Hiện nay, thế giới đang hƣớng đến một nền nông nghiệp bền vững. Do đó, việc sử dụng các chủng vi sinh vật trong đấu tranh sinh học và phòng, trị bệnh đƣợc ƣa chuộng bởi vì tính thân thiện với môi trƣờng, không ảnh hƣởng tới chất lƣợng sản phẩm.