Khóa luận tốt nghiệp Y tế: Trần thị hường nghiên cứu tổng hợp 7 cloro n 3

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ 2019 của Trần Thị Hường về tổng hợp 7-cloro-N-3-cloro-4-fluorophenyl-6-nitroquinazolin-4-amin tại Hà Nội.

• Tác giả: Trần Thị Hường
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Đình Luyện
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Tổng Hợp 7-Cloro-N-(3-Cloro-4-Fluorophenyl)-6-Nitroquinazolin-4-Amin
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tổng hợp của Trần Thị Hường

Khóa luận tốt nghiệp của Trần Thị Hường tại Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2019 tập trung vào nghiên cứu tổng hợp 7-cloro-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitroquinazolin-4-amin, một hợp chất có tiềm năng trong điều trị bệnh ung thư. Công trình này được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. Nguyễn Đình Luyện và NCS. Nguyễn Thị Ngọc tại Bộ môn Công nghiệp Dược. Mục tiêu chính của nghiên cứu là tổng hợp hóa học hợp chất AFAT-014a thông qua một loạt các phản ứng hóa học có kiểm soát, đồng thời xác định cấu trúc và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng bằng các phương pháp phổ hiện đại.

1.1. Bối cảnh và ý nghĩa của nghiên cứu

Afatinib dimaleat là thuốc điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) hiệu quả, nhưng việc tổng hợp các tiền chất của nó vẫn là thách thức lớn. Khóa luận của Trần Thị Hường nhằm phát triển quy trình tổng hợp tối ưu cho một tiền chất quan trọng, góp phần vào việc sản xuất dược phẩm nội địa và giảm chi phí thuốc cho bệnh nhân Việt Nam.

1.2. Cấu trúc và nội dung chính

Công trình gồm 4 chương chính: (1) tổng quan lý thuyết về ung thư phổi và afatinib; (2) nguyên liệu, thiết bị và phương pháp; (3) thực nghiệm, kết quả và bàn luận chi tiết các bước tổng hợp; (4) kết luận và kiến nghị. Mỗi phần được xây dựng logic để từng bước tiếp cận mục tiêu tổng hợp chất AFAT-014a.

II. Quy trình tổng hợp hóa học chi tiết

Quy trình tổng hợp được thực hiện thông qua bốn bước chính, bắt đầu từ 7-cloroquinazolin-4-(3H)-on (AFAT-011) và kết thúc tại 7-cloro-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitroquinazolin-4-amin (AFAT-014a). Mỗi bước được thiết kế để tối ưu hóa hiệu suất phản ứng và độ tinh khiết sản phẩm. Trần Thị Hường đã sử dụng các chất tương tác hóa học như acid acetic, dicloromethan và các chất xúc tác phù hợp. Kiểm tra độ tinh khiết được thực hiện bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) sau mỗi bước, đảm bảo chất lượng sản phẩm trung gian trước khi tiến hành phản ứng tiếp theo.

2.1. Bước 1 2 Tổng hợp các tiền chất ban đầu

Bước đầu tiên tạo ra AFAT-011 thông qua phản ứng xyclization, tiếp theo là nitration để tạo AFAT-012. Các phản ứng này yêu cầu điều kiện nhiệt độ và thời gian phản ứng chính xác. Hiệu suất của các bước này đạt 60-75%, cho thấy quy trình tối ưu hóa tốt mặc dù còn có nhiều cơ hội cải thiện.

2.2. Bước 3 4 Tổng hợp hợp chất cuối cùng

Bước 3 chuyển đổi AFAT-012 thành AFAT-013 thông qua phản ứng chlorination. Bước 4 thực hiện phản ứng thế nucleophilic với 3-cloro-4-fluoroanilin để tạo AFAT-014a. Những bước này đòi hỏi điều kiện kiểm soát chặt chẽ và purification cẩn thận để đạt được sản phẩm tinh khiết cao.

III. Xác định cấu trúc và phân tích kết quả

Xác định cấu trúc các chất tổng hợp được thực hiện bằng ba phương pháp phổ hiện đại: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạn nhân (NMR). Kỹ thuật 1H-NMR và 13C-NMR cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử, số lượng và vị trí của các nguyên tử hydro và carbon. Phổ IR xác nhận sự hiện diện của các nhóm chức năng quan trọng như nhóm nitro, amin và halogen. Phổ MS xác định khối lượng phân tử chính xác của sản phẩm cuối cùng. Các kết quả phân tích thể hiện rằng AFAT-014a đã được tổng hợp thành công với độ tinh khiết cao.

3.1. Phân tích phổ IR và MS

Phổ IR cho thấy các dải hấp thụ đặc trưng của nhóm C=O, C-Cl, C-F và N-H. Phổ khối lượng xác nhận khối lượng phân tử đúng của AFAT-014a, với các mảnh vỡ ion nhất quán với cấu trúc đề xuất. Sự phù hợp giữa các kết quả thực nghiệm và giá trị lý thuyết chứng minh tính chính xác của quy trình tổng hợp.

3.2. Phân tích phổ NMR

1H-NMR hiển thị độ chuyển dịch hóa học phù hợp với các nhóm chức năng. 13C-NMR cung cấp con số carbon đầy đủ, xác nhận cấu trúc đơn vị được tổng hợp. Tích phân các tín hiệu NMR cho thấy tỷ lệ nguyên tử đúng, khẳng định độ tinh khiết và cấu trúc hóa học của sản phẩm cuối cùng AFAT-014a.

IV. Kết luận và hướng phát triển trong tương lai

Khóa luận của Trần Thị Hường đã thành công trong việc tổng hợp chất AFAT-014a, một tiền chất quan trọng của afatinib dimaleat. Quy trình tổng hợp được phát triển cho thấy tính khả thi và hiệu suất hợp lý, mặc dù còn có cơ hội để tối ưu hóa các bước phản ứng nhằm tăng hiệu suất tổng thể và giảm chi phí sản xuất. Công trình này có ý nghĩa thực tiễn cao cho ngành dược phẩm Việt Nam, mở đường cho việc sản xuất nội địa các thuốc ung thư hiệu quả. Những kiến nghị trong tương lai bao gồm việc quy mô hóa quy trình, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng và khảo sát tác dụng sinh học của sản phẩm.

4.1. Những thành tựu chính của nghiên cứu

Thành công chính là việc phát triển một quy trình tổng hợp hoàn chỉnh cho tiền chất AFAT-014a với độ tinh khiết cao. Kết quả phân tích phổ IR, MS và NMR xác nhận cấu trúc chính xác. Công trình cũng đóng góp vào cơ sở dữ liệu khoa học Việt Nam về tổng hợp hóa dược và chuẩn bị phẩm chất.

4.2. Hướng phát triển tiếp theo

Kiến nghị tương lai bao gồm: (1) tối ưu hóa hiệu suất từng bước phản ứng; (2) quy mô hóa từ laborator lên sản xuất; (3) kiểm tra hoạt tính sinh học của sản phẩm; (4) phát triển phương pháp phân tích cho kiểm quality control. Các hướng này sẽ giúp commercialize thành công các sản phẩm dược phẩm từ nghiên cứu này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, ung thư là gánh nặng cho ngành Y tế toàn cầu, trong đó ung thư phổi là loại ung thư thường gặp nhất. Ung thư phổi là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do ung thư ở nam giới và là nguyên nhân thứ 2 gây tử vong do ung thư ở nữ giới. Theo thống kê cuối năm 2018, mỗi năm có gần 24.000 ca mắc mới ung thư phổi và tử vong trên 20.000 trường hợp, đủ thấy sự nguy hiểm của căn bệnh này. Trong đó, ung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm 85% và 80% bệnh nhân trong số đó không thể chữa trị do phát hiện muộn, dẫn đến tỷ lệ tử vong rất cao [1].

Afatinib (biệt dược: Gilotrip, Giotrif - hãng Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc.) là thuốc chống ung thư tác dụng tại đích, ức chế không thuận nghịch đối với họ thụ thể ErbB của tyrosin-kinase (TKI), được ứng dụng trong lâm sàng lần đầu tại Mỹ và châu Âu vào năm 2013, sau đó tại Nhật năm 2014. Afatinib dimaleat hiện được chỉ định như liệu pháp đầu tiên để điều trị bệnh ung thư phổi dạng không tế bào nhỏ (NSCLC) có thể di căn đến các cơ quan khác trong cơ thể [9], [16], [21]. Các thuốc ức chế TKI đã được sử dụng ở Việt Nam và đóng vai trò quan trọng trong phác đồ điều trị ung thư. Đây là loại thuốc mới, có tác động rất lớn đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư.

Nguyên liệu afatinib để sản xuất thuốc thành phẩm chúng ta vẫn chưa tổng hợp được, mặt khác các nghiên cứu về tổng hợp afatinib được công bố còn rất hạn chế. Do vậy, để góp phần nghiên cứu quy trình tổng hợp afatinib, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tổng hợp một trung gian của afatinib với đề tài: “ Nghiên cứu tổng hợp 7-cloro-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitroquinazolin- 4-amin ”. Với mục tiêu như sau: Nghiên cứu các phản ứng để tổng hợp 7-cloro-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6- nitroquinazolin-4-amin. Tổng quan về bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ: Ung thư phổi là một trong 3 ung thư thường gặp nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do ung thư ở phạm vi toàn cầu.

Theo GLOBOCAN 2012 (dự án của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế - IACR), tại Việt Nam, ung thư phổi đứng hàng thứ nhì chỉ sau ung thư gan với tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi ở cả hai giới là 25,2. Ung thư phổi được chia thành hai loại chính, tuỳ thuộc vào hình dạng tế bào dưới kính hiển vi là ung thư phổi tế bào nhỏ (small cell lung cancer) - chiếm khoảng 10 - 15% và ung thư phổi không tế bào nhỏ (non small cell lung cancer): chiếm khoảng 85%. Ung thư phổi không tế bào nhỏ được gây ra bởi nhiều nguyên nhân và yếu tố nguy cơ như: thuốc lá, tiếp xúc amian, bụi phóng xạ, nhiễm khuẩn, di truyền,…[1]. Tổng quan về afatinib dimaleat: Afatinib dimaleat là dược chất được phát triển bởi tập đoàn Boehringer- Ingelheim (Đức) được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt sử dụng lần đầu vào tháng 7 năm 2013, sau đó cơ quan quản lý Dược phẩm châu Âu (EMA) - vào tháng 9 năm 2013, và Cục Dược phẩm và Thiết bị Y tế Nhật Bản (PMDA) - vào tháng 1 năm 2014 để điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC).

Afatinib dimaleat thuộc nhóm thuốc chống ung thư tác dụng tại đích, ức chế không thuận nghịch các thụ thể tyrosin-kinase họ ErbB (EGFR) thế hệ II. Cấu trúc hóa học: • Công thức hóa học: Hình 1. Công thức cấu tạo của afatinib dimaleat • Tên khoa học: (E)-N-[4-(3-cloro-4-fluoroanilino)-7-[(3S)-oxolan-3-yl] oxyquinazolin-6-yl]-4-(dimethylamino)but-2-enamid, (2Z)-2-butendioat. 2 • Công thức phân tử : C32H33 ClFN5 O11 (C24 H25ClFN5O3.

• Khối lượng phân tử: 718,09 đvC. • Thành phần khối lượng các nguyên tố: C 53,48%, H 4,60%, Cl 4,94%, F 2,65%, N 9,75%, O 24,58%. Tính chất lý hóa và một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm của afatinib dimaleat 1. Tính chất lý hóa • Cảm quan: bột kết tinh màu trắng đến vàng nâu [8].

• Nhiệt độ nóng chảy: dạng base 100-1020C [10]. • Độ tan: dạng muối tan tốt trong nước. Với dung môi hữu cơ, tan tốt trong DMSO (>50 mg/mL), sau đó đến methanol (10-25 mg/mL). Đối với hầu hết các dung môi hữu cơ khác, độ hòa tan < 1 mg/mL.

Độ tan phụ thuộc vào pH, tan tốt trong môi trường đệm pH<6 ( >50 mg/mL) [8] • Afatinib có hai nhóm là dimethylamine (pKa 8,2) và quinazolin (pKa 5,0). Một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm • Định tính: Nhà sản xuất đã đưa ra một số tiêu chuẩn như: [16] - Đo phổ IR và so sánh với phổ chuẩn. - Đo phổ hấp thụ UV và so sánh với phổ chuẩn. - Pha tĩnh: Cột 2 mm x 50 mm chứa silicagel RP Luna®-PFP100 kích thước hạt 3 µm.

Nồng độ tuyến tính: 0,5 - 500 ng/mL. - Các thông số trong quá trình triển khai sắc kí: + Nhiệt độ cột : 40C. + Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút. + Thể tích tiêm: 5 µL.

- Yêu cầu: Hàm lượng afatinib dimaleat phải đạt từ 85,0% đến 115,0%.  Ngoài ra, nhà sản xuất còn đưa ra các tiêu chuẩn định lượng nồng độ các tạp ( bao gồm các tạp chất liên quan đến thuốc, ion kim loại, tồn dư dung môi, nước) và chuẩn độ acid maleic. Dược động học Hấp thu và phân bố Sau khi uống, thời gian đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương (Tmax) là 2-5 giờ. Sinh khả dụng tương đối của viên nén 20 mg đạt 92% so với dung dịch uống còn sinh khả dụng tuyệt đối thì chưa xác định được.

Khi dùng liều lặp lại, nồng độ afatinib trong huyết tương đạt trạng thái ổn định trong vòng 8 ngày [22]. Thuốc liên kết 95% với protein huyết tương (chủ yếu là hemoglobin). Thể tích phân bố thử trên người là 2770 lít sau khi uống, qua được hàng rào máu não và tích lũy khi dùng liều lặp lại [8], [22]. Chuyển hóa và thải trừ Thuốc bị chuyển hóa chủ yếu bằng con đường phi enzym thông qua phản ứng cộng Michael với glutathion.

Một lượng nhỏ chuyển hóa nhờ xúc tác enzym CYP450. Dạng liên kết cộng hóa trị afatinib-protein là các chất chính lưu thông trong máu. Thải trừ afatinib chủ yếu qua phân (85%), có 4% được tái hấp thu từ đường tiết niệu (sau khi dùng dung dịch uống đơn liều), dạng nguyên thể chiếm 88% lượng tái hấp thu. Nửa đời thải trừ: 37 giờ, chỉ số CL/F sau khi uống là 900 mL/phút [22].

Cơ chế tác dụng, chỉ định, liều dùng Cơ chế tác dụng Afatinib thuộc nhóm thuốc chống ung thư tác dụng tại đích, có tác dụng ức chế không thuận nghịch tyrosin-kinase họ thụ thể yếu tố tăng trưởng biể u bì (EGFR hay còn gọi là ErbB), bao gồm: ErbB1 (EGFR), ErbB2 (HER2), ErbB4 (HER4) , một số EGFR đột biến như: EGFR mất exon 19 (del19), EGFR thay thế exon 21 (L858R). EGFR, HER2 và HER4 là các thụ thể tyrosin-kinase có vai trò quan trọng trong sinh sản tế bào và tạo mạch của nhiều loại ung thư. Ngoài ra, afatinib còn có tác dụng ức chế EGFR T790M - dạng đột biến đã kháng với các chất ức chế EGFR thế hệ 1 [6]. Chỉ định Afatinib được chỉ định đầu tay cho đơn trị liệu bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) với các trường hợp sau: [8] - NSCLC tiến triển tại chỗ hoặc di căn có đột biến thu ̣ thể yế u tố tăng trưởng biể u bì EGFR (mất exon 19 hoặc đột biến thay thế exon 21, theo test của FDA).

- NSCLC tiến triển tại chỗ/di căn có phát triển mô vảy trong/sau hóa trị liệu platin. - NSCLC di căn đột biến EGFR dạng L861Q, G719X và S768I (theo test của FDA). 4 Liều lượng, cách dùng Liều dùng thông thường đối với người lớn mắc bệnh ung thư phổi không phải tế bào nhỏ là 40 mg, 1 lần/ngày cho điều trị bước một hoặc cho bệnh nhân chưa được điều trị trước đó bằng EGFR tyrosin-kinase [8], [22]. Nuốt trọn viên thuốc với nước.

Không uống cùng thức ăn (ít nhất 1 giờ trước hoặc 2 giờ sau bữa ăn). Không ăn ít nhất 3 giờ trước hoặc ít nhất 1 giờ sau khi uống. Liều dùng cho trẻ em chưa được nghiên cứu và quyết định [8]. Tác dụng không mong muốn và thận trọng Tác dụng không mong muốn Các tác dụng phụ rất phổ biến được báo cáo với afatinib là: viêm quanh móng, giảm ngon miê ̣ng, chảy máu cam, tiêu chảy, viêm miê ̣ng, buồ n nôn, nôn, phát ban, viêm da da ̣ng trứng cá, ngứa, khô da [11], [17].

Thận trọng Cần thận trọng trong các trường hợp: Bệnh nhân có tiền sử viêm giác mạc, viêm loét giác mạc, khô mắt nặng. Bê ̣nh nhân suy thận nặng có Clcr ≤ 30mL/phút, lo ̣c máu, suy gan nặng, không dung nạp galactose, thiếu Lapp-lactase, kém hấp thu glucose- galactose: không khuyế n cáo/không nên dùng. Tăng nguy cơ xuất hiện biến cố ngoại ý qua trung gian EGFR ở bệnh nhân nữ, nhẹ cân và có sẵn suy thận. Không cho con bú khi đang điều trị.

Thuốc có thể được hấp thu qua da và phổi, và có thể gây hại cho trẻ em trong bụng mẹ, nên những phụ nữ mang thai hoặc sắp có thai không nên cầm nắm hoặc hít phải bụi từ thuốc [8], [15]. Tương tác thuốc Không ức chế hoặc cảm ứng các isoenzym CYP 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19 hoặc 3A4. Các thuố c ức chế ma ̣nh glycoprotein P (P-gp) như ritonavir, cyclosporine A, ketoconazol, itraconazol, erythromycin, verapamil, quinidin, nelfinavir, amiodaron nên tố t nhấ t được dùng cách 6 hoă ̣c 12 giờ. Các thuố c cảm ứng ma ̣nh P-gp như rifampicin, carbamazepin, phenytoin, phenobarbital, thảo dươ ̣c St.

John’s (Hypericum perforatum) có thể làm giảm nồ ng đô ̣ afatinib. Uống cùng bữa ăn giàu chất béo làm giảm đáng kể nồng độ theo thời gian của afatinib. Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng afatinib là chất nền và là chất ức chế BCRP ( protein kháng ung thư vú) vận chuyển. Afatinib có thể làm tăng sinh khả dụng của các chất nền BCRP dùng đường uống (bao gồm rosuvastatin và sulfasalazine), nên thận trọng khi dùng chung [22].

Phương pháp tổng hợp afatinib dimaleat Afatinib có cấu tạo khung quinazolin và các nhóm thế: nhóm amin thơm chứa Clo, Flo ở vị trí số 4, nhóm ether bất đối ở vị trí số 6, nhóm amid chứa anken trans ở vị trí số 7. Các phương pháp tổng hợp xoay quanh việc xây dựng nhân quinazolin và các phương pháp tạo nhóm thế trên khung này. Ether bất đối Amin thơm Khung quinazolin Anken trans Hình 1. Sơ đồ phân tích tổng hợp ngược phân tử afatinib 1.

Phương pháp của Frank Himmelsbach và cộng sự (2002) Frank và cộng sự lần đầu tiên tổng hợp được afatinib theo Hình 1.