Luận án Tiến sĩ Y tế: Tống thị thanh vượng nghiên cứu xác định các độc tố

Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định độc tố acid okadaic, dinophysistoxin 1, 2 gây tiêu chảy trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khối phổ.

• Tác giả: Tống Thị Thanh Vượng
• Người hướng dẫn: TS. Lê Đình Chi
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc Và Độc Chất
• Đề tài: Nghiên Cứu Xác Định Các Độc Tố Gây Tiêu Chảy Acid Okadaic, Dinophysistoxin-1, Dinophysistoxin-2 Trong Một Số Nhuyễn Thể Hai Mảnh Vỏ Ở Biển Việt Nam Bằng Sắc Ký Lỏng Khối Phổ
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Luận án Tiến sĩ của Tống Thị Thanh Vượng

Tống Thị Thanh Vượng đã hoàn thành một luận án tiến sĩ dược học có giá trị cao tại Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2018. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các độc tố gây tiêu chảy trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam. Luận án được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Đình Chi và PGS. Lê Thị Hồng Hảo, hai chuyên gia hàng đầu trong lĩnh vực kiểm nghiệm độc chất. Công trình này có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng và an toàn vệ sinh thực phẩm tại Việt Nam, đặc biệt là các vùng biển ven bờ.

1.1. Đối tượng nghiên cứu và ý nghĩa

Luận án tập trung nghiên cứu ba loại độc tố chính: acid okadaic (OA), dinophysistoxin-1 (DTX1) và dinophysistoxin-2 (DTX2) trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Các độc tố này được tìm thấy trong các loài tôm, cua và các loài động vật biển khác ở vùng biển Việt Nam. Nghiên cứu này giúp xác định mức độ ô nhiễm và đánh giá rủi ro đối với người tiêu dùng.

1.2. Các chuyên gia hướng dẫn

TS. Lê Đình Chi, giảng viên bộ môn Hoá phân tích – Độc chất tại Đại học Dược Hà Nội và PGS. Lê Thị Hồng Hảo, Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã cung cấp hướng dẫn chuyên sâu. Hai cố vấn này có kinh nghiệm nhiều năm trong phân tích độc chất và kiểm nghiệm thực phẩm.

II. Phương pháp Sắc ký Lỏng Khối Phổ trong Nghiên cứu

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) là phương pháp phân析 chính được sử dụng trong luận án này. Công nghệ này cho phép xác định và định lượng đồng thời ba loại độc tố DSP trong mẫu nhuyễn thể. Phương pháp này cung cấp độ nhạy cao và độ chính xác tuyệt vời, giúp phát hiện các nồng độ độc tố thấp trong mẫu thực phẩm biển. Kỹ thuật ion hoá ESI được lựa chọn để chuyển đổi các phân tử độc tố thành ion dễ phát hiện. Phương pháp này đáp ứng tiêu chuẩn quốc tế và yêu cầu kiểm nghiệm kỹ thuật cao.

2.1. Nguyên lý của sắc ký lỏng khối phổ

LC-MS/MS kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao với phát hiện khối phổ串. Sắc ký phân tách các thành phần hỗn hợp dựa trên sự hấp phụ khác nhau, trong khi khối phổ xác định cấu trúc hoá học của từng phân tử độc tố. Quá trình ion hoá ESI chuyển đổi phân tử trung tính thành ion mang điện tích, cho phép phát hiện có chọn lọc cao.

2.2. Ưu điểm và ứng dụng trong phân tích độc tố DSP

Phương pháp LC-MS/MS cung cấp độ nhạy vượt trội so với phương pháp sinh học in vivo truyền thống. Phương pháp định lượng này có thể phát hiện nồng độ cực thấp của độc tố, giúp bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng hiệu quả. Thời gian phân tích ngắn và xử lý mẫu đơn giản làm cho nó là lựa chọn tối ưu cho kiểm nghiệm thực phẩm.

III. Độc Tố DSP và Ảnh Hưởng Sức Khỏe

Độc tố DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) là nhóm độc tố gây tiêu chảy từ động vật biển. Acid okadaic và dinophysistoxin là thành phần chính gây ngộ độc cho người. Những độc tố này tích tụ trong thịt nhuyễn thể khi chúng ăn tảo độc. Nạn nhân bị tiêu chảy, buồn nôn, và nôn sau vài giờ tiêu thụ. Các quy định quốc tế đặt ra giới hạn nồng độ tối đa cho độc tố DSP trong thực phẩm biển để bảo vệ sức khỏe công cộng. Việt Nam cũng áp dụng tiêu chuẩn kiểm soát này để đảm bảo an toàn thực phẩm.

3.1. Cấu trúc hoá học của độc tố acid okadaic

Acid okadaic (OA) là polyether phức tạp với cấu trúc độc tính cao. Phân tử này chứa nhiều vòng oxy và nhóm chức ester. Cấu trúc hoá học này cho phép nó tương tác với protein phosphatase trong các tế bào người. Dinophysistoxin là dẫn xuất ester của acid okadaic với độc tính tương tự hoặc cao hơn.

3.2. Cơ chế tác dụng và triệu chứng ngộ độc

Độc tố DSP ức chế protein phosphatase trong tế bào, gây mất cân bằng phosphoryl hoá và rối loạn chức năng tế bào. Hiệu ứng này dẫn đến tiêu chảy nặng, căng cơ và rối loạn dạ dày có thể kéo dài vài ngày. Không có thuốc giải độc cụ thể, chỉ có trị liệu triệu chứng.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu và Ý Nghĩa Thực Tiễn

Luận án của Tống Thị Thanh Vượng đã thiết lập phương pháp phân tích hiệu quả để phát hiện ba loại độc tố DSP trong mẫu nhuyễn thể Việt Nam. Kết quả thẩm định phương pháp chứng minh độ tin cậy cao với độ nhạy và độ đặc hiệu tuyệt vời. Công trình này cung cấp công cụ phân tích mạnh mẽ cho các cơ quan kiểm nghiệm quốc gia. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp này giúp giám sát an toàn thực phẩm biển, phòng chống ngộ độc tại cộng đồng, và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Luận án cũng góp phần nâng cao kỹ năng phân tích tại các phòng kiểm nghiệm Việt Nam.

4.1. Quá trình thẩm định phương pháp

Phương pháp phân tích được thẩm định toàn diện bao gồm đánh giá độ chính xác, độ lặp lại, độ nhạy và phạm vi đo lường. Các tiêu chí thẩm định tuân theo hướng dẫn quốc tế (ICH, FDA). Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đáp ứng hoàn toàn các yêu cầu kiểm nghiệm quốc tế và sẵn sàng ứng dụng trong kiểm nghiệm thực phẩm thương mại.

4.2. Đóng góp của luận án đối với an toàn thực phẩm

Luận án cung cấp phương pháp phân tích hiện đại cho Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia và các phòng kiểm nghiệm địa phương. Kỹ thuật LC-MS/MS giúp giám sát độc tố DSP hiệu quả trong các sản phẩm tôm, cua biển Việt Nam. Ứng dụng phương pháp này ngăn chặn sản phẩm độc vào thị trường tiêu dùng, bảo vệ sức khỏe người dân và nâng cao danh tiếng xuất khẩu hải sản Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN 1. Nguồn gốc Các loại hải sản đã từ lâu được con người coi là một nguồn thực phẩm lành mạnh và được tiêu thụ ngày càng nhiều trên phạm vi toàn cầu. Tuy nhiên, cũng từ rất sớm con người đã ghi nhận những trường hợp ngộ độc [64], thậm chí có thể dẫn tới tử vong sau khi ăn hải sản.

Cho tới nay, nguyên nhân gây ra ngộ độc cho người đã được xác định là do các độc tố tồn tại trong hải sản mà con người tiêu thụ, còn gọi là các độc tố sinh vật biển. Các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng bản thân các loại hải sản chứa độc tố gây ngộ độc cho người không sản xuất ra những độc tố này mà tích luỹ độc tố do ăn thực vật phù du biển, trong đó có tảo độc. Một số loài tảo có khả năng sinh độc tố, một số không sinh độc tố nhưng có khả năng phát triển mạnh gây ra hiện tượng “tảo nở hoa” – algal bloom, có thể làm thay đổi màu nước biển (hiện tượng “thuỷ triều đỏ”), làm chết hàng loạt sinh vật biển [56]. Những loài tảo mang một hoặc cả hai đặc tính này được gọi chung là tảo độc.

Trong các loài tảo độc, tảo đơn bào hai roi và tảo silic là nhóm tác nhân sản xuất ra nhiều loại độc tố có khả năng gây ngộ độc cho người nhất. Tảo đơn bào hai roi chính là tác nhân sản xuất ra độc tố gây tiêu chảy (hay hội chứng DSP) [148], độc tố gây liệt cơ (hay hội chứng PSP - paralytic shellfish poisoning) [72], độc tố gây độc thần kinh (hay hội chứng NSP - neurotoxic shellfish poisoning) [26], độc tố gây hội chứng AZP (azaspiracid shellfish poisoning) [120], độc tố gây ngộ độc khi ăn cá (hay hội chứng ciguatera) [146], và palytoxin analog [130]. Tảo silic là tác nhân sản xuất ra độc tố gây mất trí nhớ (hay hội chứng ASP - amnestic shellfish poisoning) [16]. Vi khuẩn lam là tác nhân gây ra các hội chứng PSP [15], hội chứng ngộ độc tảo biển (seaweed poisoning) [90] và hội chứng ngộ độc rùa biển (turtle poisoning) [99].

Một số loài vi khuẩn cũng đã được chứng minh là tác nhân sản xuất ra tetrodotoxin (TTX) [143], một độc tố thần kinh có độc tính rất mạnh. Độc tố do các tác nhân này sản xuất ra sẽ theo nhiều con đường khác nhau (chẳng hạn như qua chuỗi thức ăn, qua phơi nhiễm trong môi trường sống) xâm nhập và tích lũy vào trong cơ thể các loài hải sản mà con người tiêu thụ, qua đó gây ngộ độc cho người. Tùy thuộc tính chất của từng nhóm độc tố, sự phân bố của các loại hải sản theo khu vực địa lý cũng như đặc điểm hoạt động nuôi trồng, đánh bắt, 3 mỗi nhóm độc tố có thể gây phơi nhiễm trên người thông qua những loài hải sản khác nhau. Ngộ độc TTX đã được ghi nhận khi tiêu thụ cá nóc [143], con so biển [68].

Các hội chứng DSP [148], PSP [72], ASP [16], NSP [26] và AZP [120] xảy ra chủ yếu khi tiêu thụ các loài hải sản vỏ cứng không xương sống (NT2MV, giáp xác, v. Ngộ độc do hội chứng ciguatera xảy ra chủ yếu khi tiêu thụ một số loài cá biển vùng nhiệt đới [146]. Hội chứng ngộ độc do tảo biển xuất hiện khi tiêu thụ rau câu [90], trong khi hội chứng ngộ độc rùa biển xuất hiện khi ăn một số loài rùa biển [99]. Trên đây mới chỉ là những hội chứng ngộ độc và độc tố gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người nên được nghiên cứu, tìm hiểu kỹ.

Ngoài ra, còn nhiều trường hợp sinh vật biển bị ngộ độc ở quy mô khác nhau đã được ghi nhận, nhất là trong những đợt “tảo nở hoa” [56]. Hiện tượng “tảo nở hoa” là hiện tượng tự nhiên đã có từ thời xa xưa, khi con người chưa tác động nhiều đến các hệ sinh thái ven biển. Khi điều kiện môi trường thuận lợi như ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn của nước biển…, các quần thể tảo phát triển nhanh chóng, chứa hàng triệu tế bào tảo trong một lít nước biển và có thể đổi màu nước biển. Tuy nhiên các khảo sát mới đây cho thấy tần suất các đợt nở hoa tảo độc xuất hiện ngày càng thường xuyên trên khắp thế giới, khả năng phơi nhiễm của con người với độc tố sinh vật biển qua tiêu thụ hải sản, nhất là độc tố của tảo đơn bào, sẽ ngày càng tăng lên.

Điều này cũng dẫn tới việc kiểm soát độc tố của tảo đơn bào trong hải sản được cơ quan quản lý các nước trên thế giới quy định ngày càng chặt chẽ. Cũng vì lý do kể trên, luận án này lựa chọn các độc tố chính thuộc nhóm độc tố gây tiêu chảy (DSP), một nhóm độc tố của tảo đơn bào, làm đối tượng nghiên cứu. Tóm tắt quá trình nghiên cứu một số nhóm độc tố tảo đơn bào gây độc cho con người Tảo đơn bào (có kích thước 20 - 200 µm) là thức ăn chính của một số động vật nhuyễn thể như hàu, vẹm, trai, sò, ngao, ốc… Cho tới nay đã xác định được nhiều loại tảo đơn bào là tác nhân sản sinh ra các hợp chất có thể tích lũy trong những loại hải sản ăn tảo đơn bào và gây độc cho con người theo chuỗi thức ăn. Khi con người ăn hải sản nhiễm các độc tố này có thể gây nên tình trạng ngộ độc kèm thể hiện ra bằng các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, liệt cơ, suy hô hấp, nặng có thể mất trí nhớ, và có thể dẫn tới tử vong trong những trường hợp ngộ độc cấp nghiêm trọng.

4 Được biết đến sớm hơn cả trong các chứng ngộ độc do độc tố sinh vật biển là những tình trạng bệnh lý liên quan tới hệ thần kinh, do mức độ nghiêm trọng và triệu chứng điển hình của chúng. Nhiều tài liệu đã ghi nhận hội chứng “ciguatera” – được nhà sinh vật học Antonio Parra đặt tên năm 1787 khi ông nghiên cứu tình trạng ngộ độc do loài ốc biển Cittarium pica gây ra ở vùng biển Caribe [156] – với đặc điểm đặc trưng là các rối loạn về tiêu hóa, thần kinh và tim mạch xảy ra ở vùng Ấn Độ Dương (1601), Nam Thái Bình Dương (1774), Tân Caledonia (1774) và vùng Polynesia thuộc Pháp (1792). Từ đầu thế kỷ 19, người ta bắt đầu để ý ghi nhận hiện tượng thủy triều đỏ xuất hiện định kỳ ở vịnh Mexico và bờ biển phía đông Florida, được biết đến như hiện tượng “thủy triều đỏ Florida”. Trong thời gian diễn ra hiện tượng này, ăn nhuyễn thể có thể dẫn tới tình trạng được gọi là chứng ngộ độc thần kinh do thuỷ sinh vật vỏ cứng (NSP) với các triệu chứng thể hiện trên hệ tiêu hóa, thần kinh, tim mạch, và thậm chí phơi nhiễm với hơi nước biển cũng có thể gây một hội chứng đường hô hấp.

Tại châu Âu, từ năm 1689 đã có những mô tả khoa học về sự xuất hiện của chứng ngộ độc tê liệt do thuỷ sinh vật vỏ cứng (PSP) [54]. Tuy nhiên, tác nhân thực sự gây ra những hiện tượng ngộ độc đó mới chỉ bắt đầu được tìm ra và nghiên cứu một cách có hệ thống từ cuối thế kỷ 19, khi Taharain phát hiện ra TTX, một loại độc tố có quan hệ chặt chẽ với hiện tượng ngộ độc khi ăn một số loài cá nóc vào năm 1880 [64]. Sau đó, TTX cũng đã lần lượt được phân lập từ nhiều loài sinh vật biển khác [95]. Hiểu biết của con người về “hội chứng ciguatera” bắt đầu có những bước tiến đáng kể từ năm 1959, khi Randall đưa ra giả thiết tác nhân gây ngộ độc được đưa vào chuỗi thức ăn do các loài cá ăn thực vật đã tiêu thụ các loài vi tảo độc, rồi sau đó lại bị các loài cá ăn thịt lớn hơn ăn [103].

Những tiến bộ mang tính đột phá đạt được bao gồm việc phát hiện và phân lập được “ciguatoxin” (CTX) vào năm 1967 từ một loài tảo đơn bào hai roi Gambierdiscus toxicus [88] tiết ra độc tố, xác định cấu trúc hóa học và các dẫn xuất của CTX. Nhóm độc tố là nguyên nhân gây ra bệnh NSP được phân lập vào thập niên 1970, cấu trúc hóa học của chúng được xác định trong thập niên 1980. Nhóm độc tố này do các loài tảo Karenia brevis tiết ra và được đặt tên là các “brevetoxin” [13]. Trong trường hợp của bệnh PSP, mối liên hệ chính xác giữa tình trạng ngộ độc 5 với các loài trai chỉ được thiết lập năm 1927, sau khi một đợt bệnh bùng phát ở bờ biển miền trung California (Mỹ), làm 102 người mắc bệnh và 6 người tử vong.

Những nghiên cứu tiếp theo đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh là loài tảo đơn bào hai roi Alexandrium catenella và các độc tố chúng tiết ra. Những độc tố này sau đó cũng lần lượt được phân lập, xác định cấu trúc, trong đó chất đầu tiên được xác định là “saxitoxin”. Gần đây nhất, vào năm 1987, một chứng ngộ độc thần kinh mới được ghi nhận trên người sau khi ăn trai bị nhiễm acid domoic khai thác từ một khu nuôi ở bờ biển phía đông đảo Hoàng tử Edward, Canada, làm 150 người ngộ độc, trong đó có 4 trường hợp tử vong [144]. Căn bệnh này được gọi là mất trí nhớ do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (ASP).

Acid domoic ban đầu được phân lập từ loài tảo đỏ Chondria armata ở miền nam Nhật Bản. Sau đợt bùng phát ASP năm 1987, nghiên cứu cho thấy cả các loài tảo silic thuộc chi Pseudo-nitzschia cũng tiết ra acid domoic [101]. So với hiểu biết về các độc tố tác động lên hệ thần kinh, việc khám phá ra các độc tố gây nên triệu chứng tiêu chảy diễn ra gần đây hơn. Trường hợp tiêu chảy do ngộ độc đầu tiên được ghi nhận liên quan tới tiêu thụ trai có độc xảy ra ở vùng Easterscheldt tại Hà Lan năm 1961 [70].

Đợt bệnh tiếp theo bùng phát ở Easterscheldt xảy ra năm 1971 với 100 người mắc bệnh. Ngoài ra, cũng có những trường hợp tiêu chảy do ăn vẹm xanh lơ xảy ra ở Na Uy năm 1968. Đến năm 1976, Yasumoto và cộng sự [151] lần đầu tiên mô tả chứng tiêu chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (DSP) trong một đợt dịch ngộ độc thức ăn bùng phát do ăn trai và sò điệp ở vùng đông bắc Nhật Bản. Đồng thời, nhóm nghiên cứu của Yasumoto cũng thiết lập mối liên hệ giữa căn bệnh DSP với một nhóm độc tố thân lipid, sau này được gọi chung làđộc tố DSP, bao gồm OA và các dẫn xuất.