Tổng hợp dẫn chất propanamid thơm ức chế IDO1 - Khóa luận tốt nghiệp

Khóa luận Dược sĩ nghiên cứu tổng hợp, thử tác dụng ức chế enzym IDO1 của một số dẫn chất propanamid thơm mang khung 6-amino-1H-indazol.

• Tác giả: Nguyễn Hữu Long
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Phương Thảo
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa dược
• Đề tài: Tổng hợp và thử tác dụng ức chế indoleamin-2,3-dioxygenase 1 của một số dẫn chất propanamid thơm mang khung 6-amino-1H-indazol
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. IDO1 và vai trò trong bệnh ung thư

Indoleamin-2,3-dioxygenase 1 (IDO1) là một enzyme quan trọng trong con đường trao đổi chất kynurenin, đóng vai trò then chốt trong việc điều hòa hệ miễn dịch. Enzyme này xúc tác quá trình phân hủy tryptophan, một axit amin thiết yếu, thành các sản phẩm kynurenin. Sự giảm nồng độ tryptophan và tăng các chuyển hóa sản phẩm kynurenin tạo nên môi trường "dung nạp miễn dịch", cho phép tế bào ung thư "trốn thoát" khỏi giám sát của hệ miễn dịch. Cơ chế này là một trong những chiến lược chủ yếu mà các khối u sử dụng để phát triển và di căn. Do đó, ức chế IDO1 được coi là một chiến lược tiềm năng trong điều trị ung thư miễn dịch.

1.1. Cơ chế tác dụng của IDO1 trong miễn dịch

IDO1 hoạt động thông qua con đường kynurenin để tạo ra dung nạp miễn dịch. Enzyme này làm giảm tryptophan toàn cục, kích hoạt GCN2 kinase trên các tế bào T, dẫn đến tiêu huỷ tế bào T hiệu ứng và hỗ trợ sự phát triển của tế bào T điều hòa. Các sản phẩm kynurenin, đặc biệt là kynurenine và quinolinic acid, hoạt động như các chất tính hiệu qua aryl hydrocarbon receptor (AhR), thúc đẩy phân biệt tế bào T thành các phenotype kháng viêm.

1.2. Mối liên hệ giữa IDO1 và sự tiến triển ung thư

Sự biểu hiện cao IDO1 trong các tế bào ung thư và đại thực bào liên quan đến khối u (TAM) là chỉ dấu xấu tiên lượ cho bệnh nhân ung thư. Quá trình ức chế miễn dịch do IDO1 gây ra cho phép các tế bào ung thư phát triển mà không bị tấn công bởi các tế bào miễn dịch. Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy ức chế IDO1 có thể tăng cường phản ứng miễn dịch chống ung thư.

II. Cấu trúc dẫn chất Indazol ức chế IDO1

Indazol là một khung xương bất dị vòng gồm một vòng benzene nối liền với một vòng pyrazol, tạo ra một cấu trúc 5-6 vòng. Khung 6-amino-1H-indazol được sử dụng trong nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng mạnh mẽ trong việc ức chế IDO1. Các dẫn chất propanamid thơm mang khung indazol được thiết kế để tương tác hiệu quả với vị trí hoạt động của enzyme IDO1. Cấu trúc này cho phép các tương tác hydrophobic và hydrogen bonding với các axit amin trong IDO1, tạo nên sự ái lực cao và tính chọn lọc tốt. Việc bổ sung các nhóm chức năng khác nhau trên khung indazol có thể tinh chỉnh hoạt tính ức chế.

2.1. Khung indazol và tính chất hóa học

Khung indazol sở hữu tính chất bán hữu cơ-bán vô cơ, cho phép nó hình thành liên kết hydrogen vì có cả tính donor và acceptor. Sự linh hoạt của khung indazol trong các phản ứng hoá học làm cho nó trở thành lựa chọn lý tưởng cho tổng hợp các dẫn chất dược phẩm. Amino-indazol đặc biệt có tính alkalinity cao, cho phép nó tương tác mạnh với các nhóm acid trong IDO1.

2.2. Thiết kế dẫn chất propanamid thơm

Các dẫn chất propanamid được thiết kế với các nhóm thơm khác nhau (benzene, tolyl, imidazol) để tăng cường tương tác hydrophobic với túi xác định của IDO1. Chuỗi propanamid hoạt động như một linker linh hoạt, cho phép các nhóm thơm định vị chính xác trong vị trí hoạt động. Chiến lược SAR (Structure-Activity Relationship) được áp dụng để tối ưu hóa hoạt tính ức chế.

III. Phương pháp tổng hợp dẫn chất Indazol

Tổng hợp các dẫn chất propanamid-indazol được thực hiện thông qua một chuỗi các phản ứng hóa học cụ thể. Bước đầu tiên liên quan đến khử hóa nhóm nitro thơm bằng cách sử dụng các tác nhân khử như palladium on carbon (Pd/C) trong hydrogen hydrogenation. Tiếp theo là phản ứng amid hóa, nơi các amin thơm được hoạt hóa và liên kết với propanamid carboxylic acid hoặc các dẫn chất propionic acid bằng các tác nhân như EDC/HOBt hoặc DCC/DMAP. Cuối cùng, liên kết các sản phẩm trung gian với khung 6-amino-1H-indazol qua phản ứng amidation hoặc esterification. Các sản phẩm được tinh khiết bằng sắc ký cột và xác định bằng NMR, MS và HPLC.

3.1. Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm

Khử hóa nhóm nitro là bước tiên quyết trong tổng hợp các dẫn chất amin-indazol. Phương pháp này sử dụng Pd/C và H₂ dưới áp suất, cho phép chuyển đổi nhóm nitro (-NO₂) thành amin một cấp (-NH₂). Phản ứng được thực hiện trong ethanol hoặc methanol ở nhiệt độ phòng. Độ chuyển hóa thường đạt trên 95% và sản phẩm được tách chiết dễ dàng.

3.2. Phản ứng amid hóa và liên kết propanamid

Phản ứng amid hóa được thực hiện bằng cách hoạt hóa axit propionic với EDC hoặc DCC, tiếp theo là tương tác với các amin thơm trong DMF hoặc DCM ở nhiệt độ phòng. Tác nhân DMAP hoặc HOBt được thêm để tăng tốc độ phản ứng. Sản phẩm propanamid thơm sau đó được liên kết với khung indazol qua phản ứng amidation thứ cấp. Hiệu suất tổng hợp đạt 60-85% với độ tinh khiết cao.

IV. Hoạt tính ức chế IDO1 và triển vọng ứng dụng lâm sàng

Các dẫn chất propanamid-indazol được tổng hợp đã được đánh giá hoạt tính ức chế IDO1 bằng phương pháp enzymatic assay in vitro. Kết quả cho thấy một số hợp chất (đặc biệt là Amg-1) có giá trị IC₅₀ nằm trong phạm vi nanomolar, cho thấy hoạt tính ức chế rất mạnh. Các hợp chất này không chỉ ức chế IDO1 mà còn có độ chọn lọc tốt đối với IDO2 và TDO (tryptophan-2,3-dioxygenase). Dữ liệu về độ độc tính tế bào và tương hợp hóa học cho thấy các dẫn chất này có tiềm năng phát triển thành các chất ức chế IDO1 mới. Những phát hiện này mở ra hướng đi mới cho phát triển các thuốc chống ung thư dựa trên ức chế con đường kynurenin.

4.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế IDO1

Các dẫn chất indazol được đánh giá qua fluorometric assay, đo lường khả năng ức chế quinolinic acid tạo bởi IDO1 recombinant. Hợp chất Amg-1 đạt IC₅₀ = 0.85 μM, vượt trội so với thuốc 1-MT tiêu chuẩn (IC₅₀ = 2.1 μM). Các dẫn chất khác cũng cho hoạt tính tốt, với IC₅₀ trong phạm vi 0.5-3.5 μM. Độ selectivity so với IDO2 đạt trên 10 lần.

4.2. Triển vọng phát triển thành thuốc ức chế IDO1

Các dẫn chất propanamid-indazol có tiềm năng phát triển thành các inhibitor IDO1 thuế generation sử dụng trong immunotherapy ung thư. Độ bioavailability và pharmacokinetics của các hợp chất này cần được nghiên cứu thêm. Các thử nghiệm in vivo trên mô hình chuột u sẽ giúp xác nhận hiệu quả chìm chế miễn dịch và khả năng trị liệu. Nếu thành công, những hợp chất này có thể trở thành candidates cho các thử nghiệm lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh ung thư hiện vẫn đang là một gánh nặng cho toàn cầu bởi số ca mắc lớn cùng với tỉ lệ tử vong cao. Theo ước tính của của GLOBOCAN năm 2020, trên thế giới có khoảng 19,3 triệu ca ung thư mới và gần 10,0 triệu ca tử vong [35]. Ở Việt Nam, thống kê năm 2018 có 164671 ca ung thư mới (0,17% dân số), trong đó số ca tử vong là 114871 (0,12% dân số) [27]. Từ đó, việc tìm ra các thuốc mới điều trị ung thư luôn là một trong những mục tiêu hàng đầu trong lĩnh vực y tế nói chung.

Nghiên cứu về tương tác giữa khối u và hệ miễn dịch đã mở đường cho việc tìm kiếm các thuốc điều trị ung thư mới với đích và cơ chế khác hoàn toàn với các thuốc hóa trị liệu thông thường [36]. Ngoài sự thành công của các thuốc theo hướng ức chế các “chốt” kiểm soát miễn dịch như program cell death 1 (PD-1) và cytotoxic T- lymphocyte-associated protein 4 (CTAL-4), các chất ức chế hướng đích indoleamin- 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) đang cho thấy tiềm năng phát triển lớn trong điều trị ung thư thông qua quá trình phục hồi đáp ứng miễn dịch của cơ thể với khối u. Do đó việc sàng lọc các hợp chất phân tử nhỏ theo hướng ức chế IDO1 đang thu hút sự quan tâm mạnh mẽ của nhiều nghiên cứu trong khoảng một thập kỉ gần đây [9, 39]. Indazol là khung cấu trúc có mặt trong nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đa dạng trong đó có cả kháng ung thư [45].

Nghiên cứu gần đây cho thấy sự kết hợp khung indazol vào cấu trúc các chất ức chế IDO1 cho kết quả hoạt tính ức chế IDO1 và cả hoạt tính kháng tế bào ung thư cao [28, 29]. Trên cơ sở đó, nhằm mục đích tìm kiếm và phát triển thêm các hợp chất có hoạt tính ức chế IDO1 mạnh, đồng thời góp phần làm phong phú thêm vào ngân hàng các hoạt chất mang khung indazol, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng ức chế indoleamin-2,3-dioxygenase 1 của một số dẫn chất propanamid thơm mang khung 6-amino-1H-indazol” với 2 mục tiêu chính, đó là: 1. Tổng hợp một số dẫn chất propanamid thơm mang khung 6-amino-1H-indazol. Thử tác dụng ức chế IDO1 của các dẫn chất tổng hợp được.

MỐI LIÊN QUAN GIỮA IDO1 VÀ BỆNH UNG THƯ 1. Indoleamin-2,3-dioxygenase và con đường kynurenin Indoleamin-2,3-dioxygenase hay còn gọi là IDO là một enzym nội bào trong cơ thể kiểm soát quá trình giáng hóa tryptophan theo con đường kynurenin [3, 11, 44]. Enzym này được mã hóa bởi gen IDO nằm trên nhiễm sắc thể số 8 [3, 41]. Cơ thể động vật không tự tổng hợp được tryptophan mà phụ thuộc toàn bộ vào thực phẩm [20].

Các phân tử tryptophan được hấp thu tiếp đó tham gia vào quá trình tổng hợp protein ở các tế bào khắp cơ thể hoặc đi theo con đường tổng hợp serotonin [11, 44]. Ngoài ra, một phần lớn tryptophan bị giáng hóa thông qua con đường kynurenin (hình 1. Con đường kynurenin Bước đầu tiên trong quá trình giáng hóa tryptophan theo con đường kynurenin là sự tạo thành N-formylkynurenin (hình 1. Đây đồng thời là bước kiểm soát sự giáng hóa tryptophan theo con đường này.

Quá trình này có thể được xúc tác bởi 2 enzym: tryptophan-2,3-dioxygenase (TDO) và IDO. Đối với TDO, enzym này có mặt trong nhiều loài sinh vật, chỉ chuyển hóa được L-tryptophan và chỉ tồn tại trong tế bào gan ở cơ thể người [3, 16, 33]. Trong khi đó IDO chỉ phân bố ở động vật và nấm và chuyển hóa được cả 2 dạng D và L-tryptophan [3, 16]. IDO có 2 loại enzym là IDO1 và IDO2, trong đó IDO2 được biểu hiện ít hơn IDO1 (đặc biệt là trong tế bào đuôi gai (DC)) và hoạt tính chỉ từ 3-5% so với IDO1 [3].

Trong cơ thể, IDO1 có mặt ở nhiều các tế bào, cơ quan trong cơ thể (đặc biệt là ở các cơ quan thuộc hệ bạch huyết ngoại vi) bao gồm: tế bào nội mô, tế bào trình diện kháng nguyên (APC), nguyên bào sợi, đại thực bào, tế bào đuôi gai (DC) và cả ở các tế bào ung thư [31, 33]. Nghiên cứu chỉ ra rằng có sự chênh lệch giữa biểu hiện của IDO1 2 ở các mô ung thư và các mô khỏe mạnh [3, 38]. Gần đây, tỉ lệ kynurenin/tryptophan được coi như một dấu hiệu dự đoán tiên lượng và tiến triển của ung thư [11, 21]. Dung nạp miễn dịch Các tế bào ung thư biểu hiện các kháng nguyên bề mặt khác với các tế bào thông thường vì thế hệ miễn dịch của cơ thể có thể nhận biết các kháng nguyên lạ này và khởi động các phản ứng miễn dịch [25].

Ngược lại, các khối u cũng tạo ra những đáp ứng đối với hệ miễn dịch của cơ thể [7]. Ban đầu, IDO1 được cho là có tác dụng chống ung thư. IDO1 sinh ra bởi các tế bào trình diện kháng nguyên làm cạn kiệt tryptophan trong các tế bào ung thư và ức chế sự phát triển của chúng [11]. Tuy nghiên các bằng chứng cho thấy IDO1 gây ra sự phát triển của ung thư dần xuất hiện vào khoảng một thập kỉ trước [44].

Người ta thấy rằng IDO1 được biểu hiện quá mức ở 50% các khối u và biểu hiện khác nhau giữa các loại ung thư. Ví dụ trong ung thư cổ tử cung, sự phiên mã mARN và sự biểu hiện của IDO1 nhiều hơn rất nhiều so với cổ tử cung bình thường và so với các loại ung thư khác [11]. Người ta cho rằng IDO1 có liên quan đến một quá trình gọi là thay đổi đáp ứng miễn dịch (hình 1.2), là một trong số các yếu tố gây ra ung thư [31]. Sự phát triển ung thư bởi quá trình thay đổi đáp ứng miễn dịch Hệ miễn dịch trong giai đoạn đầu của quá trình thay đổi đáp ứng miễn dịch có khả năng loại bỏ hoàn toàn các tế bào bị đột biến, ngăn chặn nguy cơ gây ung thư [7, 11].

Trong giai đoạn này, các tế bào NK và tế bào T sinh ra các cytokin, ví dụ như IFN- γ, dẫn đến sự kích hoạt tế bào DC làm chúng sinh ra IDO1 ở nồng độ thấp. Thông qua con đường kynurenin, IDO1 làm cạn kiệt tryptophan ở các tế bào ung thư từ đó ức chế 3 sự phát triển của chúng [11]. Giai đoạn tiếp theo là sự cân bằng giữa số lượng các tế bào ác tính sinh ra và bị tiêu diệt. Tế bào ung thư vẫn bị kiểm soát nhưng dần tích lũy các đột biến, làm mất khả năng sinh miễn dịch và cuối cùng một số tế bào trốn thoát khỏi hệ thống miễn dịch của cơ thể [13].

Giai đoạn cuối cùng, tế bào ung thư thoát khỏi hệ miễn dịch của cơ thể hay còn gọi là dung nạp miễn dịch, IDO1 được biểu hiện rõ ở giai đoạn này, chủ yếu được sinh ra từ các tế bào ung thư và các tế bào miễn dịch khác (ví dụ như tế bào DC, tế bào ức chế có nguồn gốc dòng tủy (MDSC), đại thực bào liên quan đến khối u (TAM)) [11, 13]. Người ta cho rằng việc tăng biểu hiện của IDO1 và tích tụ kynurenin đã dẫn đến ức chế hoạt động của các tế bào diệt tự nhiên (NK) và các tế bào T, đồng thời biệt hóa tạo ra các tế bào T điều hòa, biệt hóa các tế bào DC thành các tế bào hỗ trợ dung nạp miễn dịch và hoạt hóa các tế bào ức chế có nguồn gốc dòng tủy (MDSC) [3, 11]: - Với tế bào T, IDO1 gây ra sự kiệt quệ tryptophan dẫn đến ức chế tăng trưởng của các tế bào này, bắt giữ tế bào ở pha G1 đồng thời gây ra apoptosis [33]. Trong khi đó các tế bào T CD4+ chưa trưởng thành được biệt hóa thành các tế bào T điều hòa [22, 41]. Người ta tìm thấy tỉ lệ lớn các tế bào T điều hòa ở các khối u, các hạch bạch huyết và trong máu của bệnh nhân ung thư có tiên lượng xấu [31].

- Với tế bào NK, mặc dù nghiên cứu về ức chế in vivo của IDO1 với các tế bào này còn hạn chế, các nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng L-kynurenin có khả năng ức chế tăng trưởng của tế bào NK in vitro thông qua ức chế sản sinh IL-2 [16, 31]. - Tế bào MDSC cũng được hoạt hóa. Tương tự như tế bào T điều hòa, các tế bào MDSC có chức năng ức chế các đáp ứng miễn dịch với khối u của các tế bào T hoạt động và đã được chứng minh có liên quan đến ung thư, bao gồm thúc đẩy sử phát triển và di căn. Nhiều bằng chứng cho thấy IDO gây tích lũy các tế bào MDSC và từ đó gây ra dung nạp miễn dịch [11, 17, 31].

Cơ chế phân tử IDO1 cùng với con đường kynurenin kiểm soát nồng độ tryptophan, từ đó gây ra dung nạp miễn dịch thông qua hai con đường chính được chỉ ra trên hình 1.3: Con đường thứ nhất, IDO1 làm cạn kiệt tryptophan, là một acid amin thiết yếu để tổng hợp protein. Khi nồng độ tryptophan nhỏ hơn 1 µM dẫn đến sự tích tụ các tARN tự do trong tế bào T gây ra kích hoạt tín hiệu trong điều kiện thiếu amino acid và dư thừa tARN [44]. GCN2 là một protein kinase gắn trên các tARN sẽ được kích hoạt và 4 xúc tác quá trình phosphoryl hóa yếu tố khởi phát dịch mã eIF2-α khiến cho các quá trình dịch mã không được thực hiện trong các tế bào T [30, 33]. Sự thiếu hụt amino acid tryptophan cũng ức chế con đường mTOR trong các tế bào T, là con đường chủ đạo điều hòa sự tổng hợp protein, phát triển và sống sót của tế bào [3].

Con đường thứ hai, sự tích tụ các sản phẩm chuyển hóa của tryptophan gây ra apoptosis tế bào T có chức năng miễn dịch và sự biệt hoá tạo các tế bào T điều hòa từ đó dẫn đến ức chế miễn dịch [11]. L-kynurenin đặc biệt gây độc đối với các bạch cầu và thúc đẩy quá trình biệt hóa trên thông qua gắn với receptor AhR ở các tế bào T [16, 22]. Tín hiệu từ AhR sẽ khởi động quá trình tổng hợp tạo protein FOXP3 tạo ra các tế bào FOXP3+ T điều hòa [21, 22, 41]. Nghiên cứu của Mezrich và cộng sự công bố năm 2010 chỉ ra khi xử lý các tế bào T chưa trưởng thành với với L-kynurenin với nồng độ 50 µM đã gây ra biểu hiện của FOXP3 [19].

Tuy vậy, cũng trong năm 2010, nghiên cứu của Nguyen và cộng sự lại cho thấy kynurenin ức chế quá trình biệt hóa tế bào T chưa trường thành thành tế bào FOXP3+ T điều hòa [23]. Tóm lại, kynurenin và AhR không hoàn toàn dẫn đến sự biệt hóa tạo các tế bào T điều hòa ở các bệnh nhân ung thư.