Tài liệu: Tối ưu quy trình phân tích gen nphs2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi

Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình phân tích gen NPHS2 ở trẻ em mắc hội chứng thận hư tiên phát, góp phần chẩn đoán sớm và điều trị hiệu quả.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thùy Linh
• Người hướng dẫn: ThS. Phạm Thị Hồng Nhung
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Y Dược
• Chuyên ngành: Y Đa Khoa
• Đề tài: Tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm và tầm quan trọng của tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2

Gen NPHS2 là một trong những gen quan trọng nhất liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát ở trẻ em. Quy trình phân tích gen này đòi hỏi tối ưu hóa nhiều bước để đảm bảo độ chính xác cao nhất. Tối ưu quy trình phân tích không chỉ giúp phát hiện các đột biến di truyền mà còn cải thiện hiệu quả chẩn đoán và điều trị bệnh. Việc nắm vững các kỹ thuật phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu là nền tảng quan trọng cho các nhân viên y tế và nhà nghiên cứu. Khóa luận tốt nghiệp của Nguyễn Thị Thùy Linh từ Đại học Quốc gia Hà Nội đã đóng góp đáng kể vào lĩnh vực này với các giải pháp thực tiễn.

1.1. Vai trò của gen NPHS2 trong bệnh thận hư

Gen NPHS2 mã hóa protein podocin, một thành phần thiết yếu của màng đáy cầu thận. Các đột biến gen NPHS2 gây nên những thay đổi cấu trúc protein, dẫn đến suy giảm chức năng lọc của thận. Nghiên cứu chỉ ra rằng các đa hình di truyền trên gen này có liên quan mật thiết đến hội chứng thận hư tiên phát ở bệnh nhân nhi.

1.2. Ý nghĩa lâm sàng của phân tích chính xác

Phân tích chính xác quy trình phân tích gen NPHS2 giúp xác định nguyên nhân di truyền của bệnh, từ đó hỗ trợ chẩn đoán sớm và tối ưu điều trị hiệu quả hơn. Việc phát hiện các SNP và đột biến trên gen này là cơ sở để dự đoán tiên lượng bệnh và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

II. Phương pháp và kỹ thuật tối ưu quy trình phân tích

Tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2 đòi hỏi áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại. Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) là kỹ thuật cơ bản để nhân dòng gen NPHS2 từ mẫu máu bệnh nhân. Quá trình tối ưu bao gồm điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN để đạt hiệu suất PCR tối đa. Phân tích DHPLC (Sắc kí lỏng cao áp biến tính) và giải trình tự gen được sử dụng để phát hiện các đa hình đơn nucleotit (SNP) và đột biến trên 6 exon đầu tiên của gen. Các nghiên cứu từ Đại học Quốc gia Hà Nội đã chứng minh hiệu quả của những phương pháp này.

2.1. Tối ưu điều kiện phản ứng PCR

Việc tối ưu nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi là yếu tố quan trọng trong quy trình PCR. Thí nghiệm điều chỉnh từng tham số giúp tăng độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng. Kết quả từ các khóa luận nghiên cứu cho thấy các thành phần và điều kiện PCR tối ưu có thể nâng cao chất lượng sản phẩm nhân dòng.

2.2. Phương pháp phát hiện đột biến và SNP

Phân tích đa hình di truyền sử dụng DHPLC và giải trình tự DNA để xác định chính xác vị trí các đột biến sai nghĩa và đột biến vô nghĩa. Những phương pháp này cho phép phát hiện các biến thể di truyền với độ chính xác cao, hỗ trợ chẩn đoán hội chứng thận hư tiên phát hiệu quả.

III. Kết quả và những phát hiện chính trong nghiên cứu

Nghiên cứu về tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2 đã phát hiện ra nhiều SNP và đột biến quan trọng trên 6 exon đầu tiên của gen. Dữ liệu từ 149 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát cho thấy tần số kiểu gen và tần số alen khác nhau ở những bệnh nhân có các biến thể di truyền. Các đột biến sai nghĩa và đột biến vô nghĩa trên gen NPHS2 đã được ghi nhận, giúp làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh. Những phát hiện này có giá trị lâm sàng cao trong việc chẩn đoán và tiên lượng bệnh, đồng thời mở ra hướng nghiên cứu mới cho các gen khác liên quan đến bệnh thận hư.

3.1. Tần số xuất hiện của các biến thể di truyền

Nghiên cứu ghi nhận số lượng đột biến khác nhau trên các exon của gen NPHS2. Tần số alen của các SNP xuất hiện trong quần thể bệnh nhân được phân tích chi tiết, giúp xác định các biến thể phổ biến và hiếm gặp. Dữ liệu này cung cấp thông tin quý báu về đa dạng di truyền trong hội chứng thận hư tiên phát.

3.2. Ứng dụng kết quả vào thực tiễn lâm sàng

Các phát hiện từ phân tích gen NPHS2 có thể được áp dụng để dự đoán phản ứng với liệu pháp corticosteroid và xác định nguy cơ bệnh. Hiểu rõ cơ chế bệnh lý dựa trên di truyền giúp bác sĩ lựa chọn chiến lược điều trị phù hợp nhất cho từng bệnh nhân nhi.

IV. Hướng phát triển và ứng dụng tương lai của kỹ thuật phân tích gen

Tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2 đã mở ra nhiều hướng phát triển trong lĩnh vực chẩn đoán di truyền bệnh thận hư. Công nghệ giải trình tự gen toàn bộ (Whole Genome Sequencing) và giải trình tự exome (Exome Sequencing) đang trở thành những công cụ mạnh mẽ để phát hiện các đột biến mới. Sự kết hợp giữa phân tích gen NPHS2 với các gen liên quan khác như gen NPHS1 sẽ cung cấp cái nhìn toàn diện hơn về bệnh thận hư tiên phát. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu các biến thể di truyền và mối liên hệ với tiên lượng lâm sàng là bước tiến quan trọng. Những đóng góp từ các khóa luận tốt nghiệp sẽ là nền tảng để phát triển các ứng dụng y tế cá nhân hóa.

4.1. Công nghệ giải trình tự mới trong phân tích gen

Công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) cho phép phân tích toàn bộ gen NPHS2 và các vùng liên quan một cách nhanh chóng và chi phí thấp. Phương pháp này vượt trội hơn so với PCR truyền thống trong việc phát hiện các đột biến ít phổ biến và biến thể cấu trúc. Ứng dụng NGS có thể nâng cao độ chính xác của chẩn đoán di truyền.

4.2. Xây dựng nền tảng y tế cá nhân hóa dựa trên gen

Việc tích lũy dữ liệu về biến thể gen NPHS2 và mối liên hệ với lâm sàng sẽ giúp xây dựng mô hình dự đoán tiên lượng bệnh. Trong tương lai, phân tích di truyền sẽ trở thành phần không thể thiếu trong chẩn đoán và điều trị bệnh thận hư, mở ra kỷ nguyên y tế cá nhân hóa mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT 1. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học Hội chứng thận hư là biểu hiện thường gặp của bệnh cầu thận nguyên phát, diễn biến kéo dài nhiều năm với các đợt bột phát, xen lẫn những thời kỳ thuyên giảm.

Đây là một hội chứng lâm sàng và sinh hóa xuất hiện ở nhiều bệnh do tổn thương ở cầu thận đặc trưng bởi phù, protein niệu cao, protein máu giảm, rối loạn lipid máu và có thể đái ra mỡ [6]. Hội chứng thận hư tiên phát là HCTH không có nguyên nhân rõ ràng, khởi phát sớm nhất trên 3 tháng tuổi, với 3 hình thái bệnh lí tổn thương cầu thận: tổn thương tối thiểu, xơ cứng hoặc hyalin hoá cục bộ hoặc một phần và tăng sinh gian mạch lan toả. Bệnh hay gặp ở tuổi tiền học đường hoặc học đường (5 – 10 tuổi) [8]. Hội chứng thận hư kháng steroid (Steroid-resistant nephrotic syndrome - SRNS) được định nghĩa là một tình trạng bệnh nhân mắc hội chứng thận hư không đạt được sự thuyên giảm sau điều trị đầy đủ theo liệu pháp corticosteroid tiêu chuẩn.

Hội chứng thận hư kháng corticosteroid chiếm khoảng 10% - 15% hội chứng thận hư ở trẻ em và có xu hướng tiến triển đến giai đoạn cuối của bệnh thận trong vòng 10 năm [44]. Khi đó bệnh nhân cần được điều trị bằng lọc máu và ghép thận với chi phí cao. Tỷ lệ mắc HCTHTP thay đổi theo tuổi, giới, chủng tộc, địa dư và cơ địa. Tuổi mắc bệnh trung bình ở trẻ em Việt Nam là 8,7 ± 3,5 (tuổi đi học) trong khi đó một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy tuổi mắc bệnh thấp hơn thường gặp ở trẻ em trước tuổi đi học.

Trẻ nam gặp nhiều hơn trẻ nữ (tỷ lệ 2:1). Về chủng tộc, trẻ em Châu Á bị bệnh nhiều hơn Châu Âu (với tỷ lệ 6:1); trẻ em Châu Phi ít mắc HCTHTP, nhưng nếu trẻ em da đen mắc HCTHTP thì thường bị kháng corticosteroid [52]. Ở Mỹ, tỉ lệ mắc mới hàng năm ước tính 2,0 – 2,7/100.000 ca, tỉ lệ hiện mắc là 16/100. Tại Anh, hàng năm tỉ lệ mới mắc của trẻ em gốc Á (Đông Nam Á, Nhật, Ấn Độ) cao gấp 6 lần trẻ em châu Âu (Hình 1.1 thể hiện tỉ lệ mắc HCTH ở một số nước trên thế giới).

Ở nước ta, tại các khoa Nhi 3 Toi.phat bệnh viện đa khoa tỉnh, số trẻ em mắc hội chứng thận hư (HCTH) chiếm khoảng 0.5 – 1% tổng số bệnh nhi điều trị nội trú và chiếm 10 – 30% tổng số bệnh nhi bị các bệnh thận. Tại Bệnh viện Nhi Trung Ương số bệnh nhân bị thận hư chiếm gần 2% tổng số bệnh nhân và chiếm 40% tổng số bệnh nhân của khoa thận [1, 10]. Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư ở một số nước trên thế giới [27] 1. Cơ chế sinh bệnh học Cơ chế sinh bệnh học của HCTHTP đến nay vẫn chưa được biết đầy đủ.

Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có sự rối loạn chức năng của tế bào lympho T dẫn đến sự rối loạn đáp ứng miễn dịch. Các protein đặc biệt là các Albumin xuất hiện trong nước tiểu là do biến đổi cấu trúc màng lọc, mở rộng lỗ lọc và mất điện tích âm màng đáy. Một số bệnh nhân mang điện tích dương trong huyết tương và các phân tử protein này có thể trung hòa điện tích âm trên thành mao mạch cầu thận. Ngoài ra một số nghiên cứu còn cho thấy có vai trò của yếu tố di truyền trong cơ chế sinh bệnh học HCTHTP.

Gần đây người ta thấy rằng sự thay đổi của các phân tử creatin bộc lộ trên chân lồi của các tế bào biểu mô có chân, đặc biệt là nephrin, podocin và α-actin cũng có vai trò gây xuất hiện protein niệu [4].2 mô tả cơ chế gây mất albumin từ máu ra nước tiểu trong HCTH. Cơ chế bệnh học HCTH [53] Hầu hết các bệnh nhân bị HCTH kháng corticosteroid không rõ nguyên nhân. Tuy nhiên 1/4 đến 1/3 trường hợp HCTH kháng corticosteroid ở trẻ em hoặc HCTH bẩm sinh được chứng minh trong các nghiên cứu có nguyên nhân do gen làm ảnh hưởng tới sự biệt hóa và chức năng của tế bào podocyte [33]. Biến chứng của liệu pháp corticosteroid trong điều trị HCTHTP Những bằng chứng về rối loạn miễn dịch là cơ sở để sử dụng corticosteroid và các thuốc ức chế miễn dịch khác trong điều trị HCTHTP.

Khi chưa có corticosteroid, một tỉ lệ lớn bệnh nhân bị HCTH chết hoặc tiến triển đến bệnh thận giai đoạn cuối nhanh chóng. Từ năm 1950, corticosteroid đã được sử dụng trong điều trị HCTH giúp giảm tỉ lệ tử vong trẻ em bị HCTH xuống còn khoảng 3%. Corticosteroid có tác dụng giảm viêm ở cầu thận trong điều trị HCTHTP, từ đó các triệu chứng bệnh sẽ giảm hoặc mất hoàn toàn. Với những trẻ bị HCTH giai đoạn đầu, 90% trẻ đáp ứng với liệu pháp corticosteroid [45].

Tuy nhiên, bệnh có khả năng tái phát cao, vì vậy cần theo dõi lâu dài và tuân thủ phác đồ một cách chính xác. Mặt khác, điều trị bằng corticosteroid trong thời gian dài cũng gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như [12, 45]: - Thần kinh, tâm thần: rối loạn tâm thần, trầm cảm. - Tim mạch: tăng huyết áp, suy tim mất bù. - Tiêu hóa: bệnh lý dạ dày – tá tràng (loét, chảy máu, thủng), viêm tụy.

- Nội tiết: hội chứng Cushing, chậm phát triển ở trẻ em. - Chuyển hóa: tăng glucose máu, đái tháo đường, mất kali.phat - Cơ xương khớp: loãng xương, hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi, yếu cơ, nhược cơ. - Mắt: Glaucoma, đục thủy tinh thể dưới bao. - Da: trứng cá, teo da, ban, tụ máu, đỏ mặt, chậm liền sẹo.

- Tai biến do ngừng thuốc đột ngột: suy thượng thận cấp. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu về HCTHTP đã được thực hiên cho thấy tỉ lệ bệnh nhân HCTH kháng thuốc là 10 – 20% và có xu hướng ngày càng tăng [11, 31]. Theo kết quả nghiên cứu của Lê Nam Trà và cộng sự trên 42 trẻ bị HCTHTP kháng corticosteroid được điều trị bằng methylprenisolon liều cao truyền tĩnh mạch, tỉ lệ thuyên giảm hoàn toàn là 33,3%, thuyên giảm một phần là 30,9% và không đáp ứng là 35,7% [8]. Những nghiên cứu mới về phân tích đột biến gen mã hóa tổng hợp các protein tham gia cấu trúc màng lọc cầu thận đã phần nào chứng minh giả thiết nguyên nhân gây kháng thuốc do gen.

Bằng chứng là sự di truyền khả năng đáp ứng và không đáp ứng với corticosteroid ở các bệnh nhân mắc hội chứng thận hư đang ngày càng được công nhận [30]. Vấn đề cơ chế nào dẫn đến việc những bệnh nhân này ban đầu đáp ứng với corticosteroid nhưng sau đó lại kháng với corticosteroid (hiện tượng kháng corticosteroid muộn) cũng được đặt ra. Vì vậy, xét nghiệm gen di truyền đang ngày càng trở thành một công cụ có giá trị trong việc xác định các đột biến gen có liên quan đến hội chứng thận hư và sự di truyền tính kháng steroid, từ đó có được hướng điều trị hiệu quả và trong tương lai có thể tránh những trường hợp sinh thiết thận không phù hợp [13]. Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát Hơn hai thập kỉ qua, cơ sở phân tử của HCTH kháng corticosteroid đã được nghiên cứu trên cả trường hợp mắc HCTH kháng corticosteroid có tính chất gia đình và những trường hợp ngẫu nhiên.

Các đột biến trên gen mã hóa cho các protein ở tế bào biểu mô có chân (podocyte) được mô tả như là nguyên nhân của HCTH kháng corticosteroid di truyền. Đến nay, các đột biến ở 10 gen (NPHS1, NPHS2, PLCE1, CD2AP, ACTN4, TRPC6, INF2, MYO1E, PTPRO và ARHGDIA) liên quan đến các dạng khác nhau của HCTH kháng corticosteroid đã được mô tả và 11 gen khác cũng được xác định là có liên 6 Toi. Kết quả của các nghiên cứu đã thực hiện trên thế giới chỉ ra các gen sau đây là nguyên nhân phổ biến nhất trong HCTH kháng corticosteroid: - Đột biến gen NPHS1 mã hóa nephrin của tế bào podocyte, thường gặp ở lứa tuổi nhỏ, đặc biệt trong HCTH bẩm sinh thể Phần Lan [31, 36]. - Đột biến gen NPHS2 mã hóa protein podocin của tế bào podocyte, thường gặp ở lứa tuổi lớn và HCTH kháng thuốc có tính chất gia đình.

Đột biến gen NPHS2 gặp khoảng từ 10 – 30 % trẻ bị HCTH kháng thuốc ở Châu Âu và Trung Đông, ngược lại tỉ lệ này lại ít ở trẻ em Mỹ gốc Phi [37, 54, 60, 69]. - WT1 mã hóa cho sự di truyền ức chế protein của khối u liên quan đến phát triển thận và hệ sinh dục. Đột biến gen WT1-Wilm’tumor có thể gặp ở tất cả các trường hợp bị HCTH tiên phát kháng corticosteroid [36, 59]. - Gen ít gặp hơn là LAMB2 mã hóa lamin beta 2, PLCE1 mã hóa phospholipase C epsilon và TRP6 mã hóa cho kênh dẫn truyền canxi nằm trên màng lipid tạo thành một phức hệ với podocin quy định cơ chế cảm nhận của màng lọc cầu thận [36].

- Đột biến gen NPHS3 và đột biến ở gen epsilon phospholipase C (PLCE1 hay NPHS3) thường kết hợp với HCTH bẩm sinh và xơ hóa gian mạch lan tỏa [35]. - Các gen khác gồm ACTN4 mã hóa alpha-actinine 4, TRPC6 mã hóa cho kênh dẫn truyền canxi nằm trên màng lipid và INF2 mã hóa protein điều hòa actin, các gen này gây HCTH di truyền trội với xơ hóa cầu thận cục bộ thường xuất hiện ở trẻ vị thành niên và người trẻ tuổi [68]. Trên cơ sở các nghiên cứu này, các đột biến của gen NPHS2 được mô tả là một trong các nguyên nhân quan trọng trong cơ chế kháng thuốc ở bệnh nhân mắc HCTHTP và được tìm thấy ở các quần thể khác nhau với tần số và mức độ biểu hiện khác nhau [20, 25]. Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi lựa chọn phân tích gen NPHS2 là bước đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về mối liên quan giữa các đột biến tìm thấy với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, đáp ứng điều trị và tiên lượng ở bệnh nhân người Việt Nam mắc HCTHTP.

TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 1. Vị trí, cấu trúc, vai trò của gen NHPS2 Gen NPHS2 ở người được xác định vị trí vào năm 2000, có độ dài khoảng 25 kb trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 (1q25-q31) và bao gồm 8 exon [21] (Hình 1. Gen NPHS2 và protein podocin. Vị trí của gen NPHS2 trên nhiễm sắc thể số 1.

Cấu trúc các đoạn exon và intron của gen NPHS2 mã hóa protein Podocin. Các exon được kí hiệu bằng hình chữ nhật màu đen, các intron được thể hiện bằng đường gạch nối giữa các exon. UTR là vùng không dịch mã. Cấu trúc protein podocin.