Khóa luận Dược sĩ: Khảo sát và tối ưu hóa quy trình nuôi cấy dịch lỏng nấm Cordyceps militaris

Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy dịch lỏng nấm Cordyceps militaris hiệu quả, tối ưu điều kiện môi trường và thành phần dinh dưỡng để tăng năng suất.

• Tác giả: Đỗ Thị Kim Anh
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Quỳnh Hoa
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Khảo sát tối ưu hóa quy trình nuôi cấy dịch lỏng nấm Cordyceps militaris
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về nấm Cordyceps militaris và ý nghĩa nghiên cứu

Nấm Cordyceps militaris là một loài nấm đông trùng hạ thảo quý giá, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và dân gian. Nấm này chứa nhiều hoạt chất sinh học quan trọng như cordycepin và adenosin, có tác dụng tăng cường miễn dịch, chống mệt mỏi và cải thiện sức khỏe tổng thể. Ngoài các hoạt chất chính, nấm còn chứa các polysaccharide, protein và micronutrient hữu ích. Trong những năm gần đây, nhu cầu về Cordyceps militaris gia tăng đáng kể trên thị trường quốc tế, tuy nhiên sản lượng tự nhiên bị hạn chế. Do đó, nuôi cấy nhân tạo trở thành giải pháp khả thi nhất, với phương pháp nuôi cấy dịch lỏng mang lại hiệu quả cao hơn so với các phương pháp truyền thống.

1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của nấm Cordyceps militaris

Cordyceps militaris là nấm sống ký sinh trên ấu trùng bướm họ Hepialidae. Nấm này phân bố ở các vùng núi cao, khí hậu lạnh ở Châu Á, Châu Âu và Bắc Mỹ. Ở Việt Nam, nấm được tìm thấy ở các vùng miền núi cao phía Bắc. Chu trình sống của nấm bao gồm giai đoạn ký sinh, giai đoạn sinh sản kinh dị và hình thành chiến quả. Nấm có vai trò điều hòa hệ miễn dịch và chống oxy hóa đối với ấu trùng chủ.

1.2. Hoạt chất chính và tác dụng dược lý

Cordycepin và adenosin là hai hoạt chất sinh học chính của Cordyceps militaris. Cordycepin (3'-deoxyadenosine) có tác dụng chống ung thư, kháng viêm và tăng năng lượng tế bào. Adenosin hỗ trợ lưu thông máu, cải thiện chức năng tuần hoàn và giảm stress. Các polysaccharide trong nấm có khả năng kích thích hệ miễn dịch mạnh mẽ. Ngoài ra, nấm còn chứa amino acid thiết yếu, vi khoáng chất như kẽm, đồng, sắt góp phần tăng sức đề kháng.

II. Quy trình nuôi cấy dịch lỏng và các yếu tố ảnh hưởng

Phương pháp nuôi cấy dịch lỏng là kỹ thuật hiệu quả để tối ưu hóa sinh khối và sản lượng hoạt chất của Cordyceps militaris. Phương pháp này cho phép kiểm soát chính xác các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, độ ẩm và thành phần dinh dưỡng. Môi trường dịch lỏng giúp tăng tốc độ tăng trưởng nấm so với nuôi cấy trên vật chất rắn. Để tối ưu quy trình, cần khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như nguồn carbohydrate, nitrogen, ion kim loại và điều kiện lắc nuôi cấy. Việc lựa chọn đúng điều kiện tối ưu sẽ nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

2.1. Ảnh hưởng của pH và thời gian nuôi cấy

pH ban đầu của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tăng trưởng nấm Cordyceps militaris. Nấm thường phát triển tốt nhất ở pH 5,5-6,5, vì đây là môi trường axit yếu phù hợp với sinh lý nấm. Thời gian nuôi cấy tối ưu thường kéo dài 14-21 ngày, trong đó nấm tăng trưởng theo chiều mũ và tích lũy hoạt chất đạt cao nhất. Kiểm soát pH định kỳ có thể duy trì điều kiện tối ưu cho toàn bộ chu kỳ nuôi cấy.

2.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitrogen

Glucose là nguồn carbon chính được lựa chọn cho nuôi cấy Cordyceps militaris, với nồng độ tối ưu khoảng 20-30 g/L. Các nguồn nitrogen như peptone, yeast extract và (NH₄)₂SO₄ đóng vai trò quan trọng trong hình thành sinh khối. Tỷ lệ C/N hợp lý (khoảng 10:1) giúp tối ưu hóa sản lượng cordycepin và adenosin. Thiếu nitrogen dẫn đến chậm phát triển, trong khi thừa nitrogen có thể ức chế tích lũy hoạt chất.

III. Ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng trong tối ưu hóa

Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) là công cụ thống kê mạnh mẽ để tối ưu hóa đồng thời nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quy trình nuôi cấy dịch lỏng Cordyceps militaris. RSM cho phép xây dựng mô hình toán học mô tả mối quan hệ giữa các biến đầu vào và sản lượng hoạt chất. Thiết kế thí nghiệm D-optimal hoặc Box-Behnken được sử dụng để giảm số lượng thí nghiệm cần thiết, tiết kiệm thời gian và chi phí. Kết quả từ RSM giúp xác định điều kiện tối ưu chính xác, tăng hiệu quả sản xuất lên 20-40%.

3.1. Thiết kế thí nghiệm và phân tích dữ liệu

Thiết kế thí nghiệm D-optimal được áp dụng để chọn lựa các mức độ yếu tố cần khảo sát. Các yếu tố chính bao gồm pH, nồng độ glucose, nồng độ peptone, tỷ lệ thể tích lắc. Phần mềm Design-Expert được sử dụng để phân tích dữ liệu thực nghiệm và xây dựng các phương trình hồi quy. Giá trị p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Khảo sát sự tương tác giữa các yếu tố giúp hiểu rõ hơn cơ chế tác động lên sản lượng hoạt chất.

3.2. Điều kiện tối ưu và xác thực mô hình

Sau khi phân tích RSM, các điều kiện tối ưu được dự đoán thông qua mô hình toán học. Xác thực mô hình được thực hiện bằng các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần ở điều kiện tối ưu dự đoán. Sai số giữa giá trị dự đoán và thực tế nên dưới 10% để mô hình được coi là chính xác. Điều kiện tối ưu cuối cùng là cơ sở cho quy trình sản xuất thương mại của nấm Cordyceps militaris.

IV. Ảnh hưởng của ion kim loại và điều kiện lắc nuôi cấy

Ion kim loại như Zn²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺ đóng vai trò cofactor quan trọng trong các enzyme liên quan đến tích lũy cordycepin và adenosin. Nồng độ ion kim loại tối ưu giúp tăng hoạt tính enzyme, tăng tốc độ chuyển hóa sinh học. Điều kiện nuôi cấy lắc (với tốc độ 150-200 rpm) giúp tăng sự lưu thông khí, cung cấp oxygen cho nấm, từ đó tăng sinh khối và hoạt chất so với nuôi cấy tĩnh. Sự kết hợp giữa ion kim loại và nuôi cấy lắc mang lại hiệu quả tối đa.

4.1. Ảnh hưởng riêng biệt của các ion kim loại

Zn²⁺ ở nồng độ 10-50 μM kích thích tổng hợp cordycepin bằng cách tham gia vào các phiến enzyme kinase. Cu²⁺ ở nồng độ 5-20 μM tăng hoạt động cytochrome oxidase, cải thiện hô hấp aerobic của nấm. Fe²⁺ ở nồng độ 50-100 μM tham gia vào quá trình tạo heme và cytochrome, tăng khả năng trao đổi chất. Mn²⁺ ở nồng độ 5-15 μM hỗ trợ hoạt động photolyase và peroxidase, giảm stress oxy hóa cho nấm.

4.2. Ảnh hưởng của điều kiện lắc và kết hợp tối ưu

Nuôi cấy lắc với tốc độ 150-200 rpm tăng diện tích tiếp xúc giữa nấm và môi trường lỏng, cung cấp oxygen liên tục, tăng sinh khối nấm lên 60-80% so với nuôi cấy tĩnh. Kết hợp giữa nuôi cấy lắc, ion kim loại (Zn²⁺ 30 μM + Cu²⁺ 10 μM + Fe²⁺ 75 μM), pH 6,0 và thời gian 18 ngày cho sản lượng cordycepin cao nhất (khoảng 500-600 mg/L).

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về nấm Cordyceps militaris 1. Vị trí phân loài, phân bố, ký chủ, chu trình sống nấm Cordyceps militaris a. Vị trí phân loài Theo Sung và các cộng sự năm 2007 [6], trang web Species Fungorum [7], trang dữ liệu của Tổ chức bảo vệ Thực vật Châu Âu và Địa Trung Hải (EPPO Global Database) [8] và sách Thực vật Dược [9], nấm Cordyceps militaris được sắp xếp theo thứ tự phân loại như sau: Giới: Nấm (Fungi) Ngành: Ascomycota Phân ngành: Pezizomycotina Lớp: Sordariomycetes Phân lớp: Hypocreomycetidae Bộ: Hypocreales Họ: Cordycipitaceae Chi: Cordyceps Tên khoa học: Cordyceps militaris (L.

Tên đồng nghĩa: Cordyceps militaris (L.; Clavaria squamosa Lam.; Clavaria granulosa Bull. Tên thường gọi: Nấm nhộng trùng thảo, nấm bắc trùng thảo, nấm cam sâu bướm, dõng trùng thảo,. Phân bố và ký chủ Chi Cordyceps có tới 750 loài đã được xác định phân bố trên toàn thế giới, chủ yếu được tìm thấy ở Châu Á, Châu Âu và Bắc Mỹ [10].) là một loài Cordyceps phổ biến, phân bố trên toàn thế giới từ 0 đến >2.000 m trên mực nước biển [2]. Sự đa dạng về hình thái và khả năng thích nghi với nhiều loại côn trùng chủ có thể góp phần vào sự hiện diện của loài này ở nhiều vùng địa lý và vùng sinh thái khác nhau trên thế giới.

Các vật chủ phổ biến nhất của loài này trong tự nhiên bao gồm ấu trùng 2 cánh vảy (Caterpillars) và nhộng; các vật chủ ít gặp khác là côn trùng thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh màng (Hymenoptera) và bộ hai cánh (Diptera) [2]. Tại Việt Nam đã thu được các mẫu của Cordyceps ở những vùng rừng nhiệt đới với độ cao 800-2000m. Cho đến năm 2022, đã có 13 loài của chi Cordyceps được ghi nhận ở Việt Nam [11]. Cordyceps militaris được tìm thấy ở khu vực Vườn Quốc Gia Hoàng Liên, Lào Cai [12], khu bảo tồn thiên nhiên Copia [11], và Vườn Quốc Gia Vũ Quang, Hà Tĩnh [13].

Chu trình sống của Cordyceps militaris C. militaris mọc trên nhiều loài côn trùng và giá thể khác nhau. Các bào tử được giải phóng khỏi túi trong những tháng mùa hè. Bào tử nấm theo gió dính vào bên ngoài ký chủ, hình thành các ống nảy mầm khi đậu trên vật chủ thích hợp.

Các ống này tiết ra các enzym như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhâp vào bên trong cơ thể. Mùa đông, nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi để chịu được mùa đông. Hệ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh chiếm toàn bộ cơ thể, các cơ quan bên trong của ấu trùng bị phá hủy, để lại lớp vỏ ngoài nguyên vẹn và gây chết ký chủ. Đến cuối hè hoặc thu, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính quả thể nhô ra ngoài để phát tán bào tử vào không khí [14], [15].

Hoạt chất sinh học C. militaris chứa các nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học như nhóm nucleosid, các polysaccharid, sterol, statin, hợp chất phenolic, vitamin và khoáng chất,… [16] a. Các nucleosid Nucleosid là một trong những thành phần chính trong Cordyceps. Cho đến nay, hơn 20 nucleosid và các chất tương tự đã được tìm thấy trong Cordyceps tự nhiên và nuôi cấy [17].

Adenosin và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm C. Adenosin chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm. Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối (0,97% so với 0,36%) [18]. Các nucleosid khác được phát hiện trong C.

militaris như: cytidin, cytosin, guanin, guanosin, uracil, uridin, hypoxanthin, inosin, thymin, thymidin, 2`-deoxyuridin, 2`- deoxya-denosin, N-6-methyladenosin và 6-hydroxyethyl-adenosin,. Carbohydrat Carbohydrat chủ yếu trong đông trùng hạ thảo gồm mannitol (9%), trehalose (3%) và polysaccharid (3–8%) tương ứng tổng trọng lượng khô [17]. D-Mannitol là một trong những sản phẩm quan trọng nhất của quá trình chuyển hóa C. militaris có vai trò như chất dự trữ carbohydrat, vận chuyển các hợp chất khác 3 trong quá trình điều hòa thẩm thấu và kiểm soát các con đường chuyển hóa của C.

D-mannitol cho thấy hoạt động thẩm thấu, do đó nó có thể được sử dụng trong thực hành lâm sàng như một loại thuốc lợi tiểu và chống phù nề [3], [19]. Polysaccharid là carbohydrat có cấu trúc phức tạp. Tùy thuộc vào vị trí tổng hợp polysaccharid trong tế bào nấm của C. militaris có thể chia thành hai dạng: chất chuyển hóa thứ cấp nội bào hoặc ngoại bào.

Polysaccharid được phân lập từ sợi nấm của C. militaris có cấu trúc hóa học khác nhau. Cấu trúc hóa học được xác định bởi loại monosaccharid tạo nên polysaccharid, trình tự monosacarid, cấu hình không gian, vị trí của các liên kết glycosid và mức độ phân nhánh (liên kết ngang) của chuỗi, độ hòa tan và tính chất lưu biến. Mannose, glucose và galactose là những monosaccharid quan trọng nhất tạo thành polysaccharid với tỷ lệ mol khác nhau.

Ngoài ra, các monosaccharid khác của polysaccharid đã được phát hiện: arabinose, rhamnose và xylose [20]. Acid amin Trong C. militaris, các acid amin dồi dào nhất là lysin, acid glutamic, prolin và threonin [18]. Ngoài acid amin protein, thể quả còn chứa acid amin không phải protein, chẳng hạn như GABA và ergothionein [21].

GABA có tác dụng điều hòa giấc ngủ, trí nhớ, học tập, cảm xúc như lo lắng và căng thẳng và hoạt động giãn cơ, chống co giật. Tuy nhiên, GABA đường uống có sinh khả dụng thấp khó đi qua hàng rào máu não, thời gian bán hủy ngắn [22]. Ergothionein được tìm thấy với hàm lượng cao trong thể quả của Cordyceps militaris. Ergothionein có khả năng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào, đặc biệt chống lão hóa và các tình trạng liên quan đến stress oxy hóa [16].

militaris chứa lovastatin – một hợp chất thuộc nhóm statin có tác dụng hạ cholesterol máu [23]. Cơ chế hoạt động của lovastatin là ức chế enzym HMG-CoA reductase, từ đó ngăn quá trình tổng hợp cholesterol nội sinh. Lovastatin giúp giảm cholesterol, bảo vệ mạch máu và được dùng điều trị tăng cholesterol máu cũng như ngăn ngừa xơ vữa động mạch vành [24]. militaris rất giàu acid béo không bão hòa (khoảng 70% tổng số acid béo).

Acid bão hòa chiếm lượng nhiều nhất là acid palmitic. Acid không bão hòa nhiều nhất là acid linoleic [18]. Acid béo không chỉ là thành phần dinh dưỡng thiết yếu mà còn là chất điều chỉnh nhiều chức năng tế bào thông qua các thụ thể của chúng, là đích điều trị mới cho bệnh tiểu đường và rối loạn lipid máu, đặc biệt là bệnh tiểu đường typ 2 [17]. Các nhóm hoạt chất khác 4 C.

militaris chứa nhiều vitamin tan trong nước (B2, B3, C) và tan trong chất béo (A, E). Vitamin B2 (riboflavin) và vitamin B3 (niacin) làm giảm cảm giác mệt mỏi, có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất tạo năng lượng. Vitamin C bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa và tăng cường miễn dịch, hỗ trợ hình thành collagen và tăng hấp thu sắt từ đường tiêu hóa. Vitamin A giúp tăng cường thị lực.

Vitamin E bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa [16]. militaris cũng chứa các khoáng chất thiết yếu như magie, kali, selen và lưu huỳnh với hàm lượng cao, giúp bổ sung khoáng chất cho chế độ ăn uống. Đặc biệt, selen trong C. militaris tồn tại dưới dạng hữu cơ, góp phần tăng hàm lượng hoạt chất sinh học như nucleosid, polysaccharid và cordycepin [25].

Tác dụng dược lý nấm Cordyceps militaris Hiện nay, nhiều nghiên cứu chứng minh nấm C. militaris có nhiều tác dụng dược lý khác nhau có khả năng ứng dụng trên lâm sàng bao gồm chống ung thư, chống khối u, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng nguyên sinh, kháng virus, điều hòa miễn dịch, chống viêm, v. militaris được coi là nấm dược liệu quý giá cải thiện sức khỏe con người. • Hoạt tính chống oxy hóa C.

militaris có nhiều hoạt chất chống oxy hóa như ergothionein, hợp chất phenolic, carotenoid, selen, các polysaccharid và cordycepin. Trong đó, hoạt tính chống oxy hóa chủ yếu đến từ các polysaccharid. Các polysaccharid P70–1 và CBP-1 trong nấm C. militaris có khả năng trung hòa các gốc hydroxyl [4].

Tác dụng chống oxy hóa giúp bảo vệ tế bào và mô khỏi tổn thương oxy hóa, từ đó có thể góp phần vào việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý. • Hoạt tính chống khối u Năm 2004, tác dụng ức chế sự phát triển khối u từ dịch chiết C. militaris trong nghiên cứu in vitro được ghi nhận [26]. Dịch chiết nước C.

militaris có thể ức chế các tế bào ung thư vú [27], ức chế sự tăng sinh và di căn tế bào ung thư bàng quang ở người [28], hạn chế sự hình thành mạch máu mới của các tế bào u ác tính ở người [29], [30]. Cordycepin và ergosterol được phân lập từ C. militaris chống tăng sinh các tế bào ung thư ruột kết ở người [31], polysaccharide CMPS-II ức chế tế bào ung thư phổi [32] và cordycepin ức chế tế bào ung thư gan [33]. militaris gây ra apoptosis trong các tế bào ung thư buồng trứng thông kích hoạt TNF-α, TNFR1, NF-κB, caspase-3 và caspase-9, và giảm mức độ Bcl-2 và BclxL [34].

Trong một nghiên cứu in vivo, C. militaris làm giảm khối lượng và thể tích của khối u và kéo dài thời gian sống sót của chuột bị ung thư phổi [35]. • Hoạt tính chống viêm 5 Trong thí nghiệm in vitro chuột bị gây viêm bởi lipopolysaccharid, C. militaris ức chế sản xuất các chất trung gian gây viêm: NO, TNF-α, IL-6 ở đại thực bào [36].

Bên cạnh đó, trong thí nghiệm in vivo, C. militaris được chứng minh ức chế hoạt động của iNOS và TNF-α và làm giảm giải phóng hạt của tế bào mast [37]. Một thí nghiệm được tiến hành trên chuột, polysaccharid ức chế hoạt động của COX-2, TNF-α, IL-1β giúp chống viêm giảm đau [38]. Các cerebrosid ức chế biểu hiện của COX-2, iNOS, NF-κB, IL-1β, IL-6 [39].

• Tác dụng hạ đường huyết Các hoạt chất có tính sinh học như polysaccharid LCMPs-II ức chế enzyme α- glucosidase [40], cerebrosid ức chế hoạt động PTP1B (protein tyrosin phosphatase 1B) [41], exopolysaccharid đối kháng với enzyme trên α-glucosidase [42]. Từ đó cho thấy C.militaris ảnh hưởng đến việc sử dụng glucose của các mô và cải thiện tình trạng kháng insulin. • Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus Năm 2020, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) đã đưa cordycepin vào danh sách các cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng virus bao gồm HIV, virus herpes simplex (HSV), virus Epstein-Barr (EBV) và virus cúm. Hiệu quả kháng virus của cordycepin có liên quan đến khả năng ức chế RNA polymerase và phiên mã ngược của virus [4].

Dịch chiết metanol của C. militaris cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với Bacillus cereus và Pseudomonas aeruginosa. Filipa và cộng sự, cũng đã chỉ ra khả năng chống nấm mạnh của dịch chiết metanol C.