Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái niệm Protease (peptide – hidrolase 3.4) là nhóm enzyme xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n, polypeptide trong phân tử protein đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển amino acid [1].
Sơ đồ enzyme protease thủy phân phân tử Protein [7] Protease hay các enzyme proteolytic xúc tác các phản ứng thuỷ phân protein và peptide. Protease có trong nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và trong các hạt ngũ cốc nảy mầm. Protease có 2 loại: proteinase và peptidase. Proteinase thuỷ phân protein thành các peptide và amino acid, peptidase thuỷ phân các peptide thành amino acid.
Sự phân chia protease thành hai loại enzyme ở đây là điều ước lệ vì protease cũng thuỷ phân peptide [6]. Protease được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa.) và động vật (có trong gan, dạ dày. Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu. Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại chế phẩm.
Quá trình này có thể được thực hiện nhờ các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình lên men thu protease để sản xuất chế phẩm [7]. download by : skknchat@gmail. Phân loại protease Theo ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử, protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme; Tuy nhiên, việc định tên cho các protease không dễ dàng tuân theo cách định tên phổ biến của hệ thống enzyme bởi sự đa dạng về cấu trúc và khả năng hoạt động. Phân loại dựa vào pH hoạt động tối ưu Trước đây, protease được phân loại một cách đơn giản dựa vào pH hoạt động tối ưu thành ba nhóm: Protease acid, protease trung tính và protease kiềm [1].
Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu Protease Đặc điểm Protease acid Hoạt động ở pH 2-6, gồm phần lớn là aspartic protease, một số cysteine protease và metalloprotease Protease trung Hoạt động ở pH 7-8, gồm cysteine protease, tính metalloprotease và một số serine protease Protease kiềm Hoạt động ở pH 8-13, chủ yếu là serine protease 1. Phân loại dựa vào các tiêu chí cơ bản Phân loại dựa trên ba tiêu chí cơ bản: loại phản ứng xúc tác, bản chất hóa học của trung tâm xúc tác và mối quan hệ giữa sự tiến hóa có liên quan đến cấu trúc, protease được chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase [1]. download by : skknchat@gmail. Sơ đồ phân loại protease [7] * Exopeptidase Phân loại dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide exopeptidase được phân chia thành hai loại: Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide; Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Endopeptidase Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin proteinase: Là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động download by : skknchat@gmail.com 6 xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN.
Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vài protein động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
Mô hình phân tử protease (papain) [11] Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. download by : skknchat@gmail.
Mô hình phân tử protease (renin) [17] Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Trong bốn nhóm protease kể trên, các cysteine proteinase và protease- tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn suất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn suất của amino acid.
Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về câu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đổi bé, nhất là các cysteine proteinase. Các cysteine proteinase có trọng lượng phân tử vào khoảng 20. Tuy nhiên, cũng có một số cysteine proteinase có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của Penicillium cyoneo’fulvum (44.
Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với cysteine proteinase (khoảng 33. Protease tiol và nhiều protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30. download by : skknchat@gmail. Cơ chế xúc tác Một chất xúc tác dù là hóa học hay sinh học đều có tác dụng làm tăng vận tốc của phản ứng.
Vận tốc của phản ứng enzyme là lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một đơn vị thời gian. Thông thường, lượng cơ chất hoặc lượng sản phẩm được biểu diễn bằng nồng độ phân tử (M) và đơn vị thời gian là giây [8]. Sự xúc tác của enzyme thường được thực hiện bằng cách tạo ra ít nhất một phức hợp tạm thời giữa enzyme và cơ chất. Mô hình đơn giản nhất là mô hình của Michaelis.
Mô hình này thừa nhận rằng phản ứng chỉ xảy ra với một cơ chất và tạo thành chỉ một sản phẩm [8]: E + S → ES → P + E Trong đó: E là Enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là sản phẩm (Product) * Giai đoạn đầu: phức hợp enzyme cơ chất dược tạo thành một cách nhanh chóng và thuận nghịch nhờ các tương tác phi đồng hóa trị giữa cơ chất và các amino acid nhận biết của tâm hoạt động của enzyme [8]. Rồi trạng thái quá độ này sẽ tự chuyển hóa thành phức enzyme - sản phẩm và cuối cùng phức enzyme - sản phẩm sẽ phân ly thành enzyme tự do và sản phẩm [8]. Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học của enzyme người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất thành hợp chất trung gian [2]. E (enzyme) + S (cơ chất)→ ES (hợp chất trung gian) download by : skknchat@gmail.
Nguồn thu protease 1. Protease động vật Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất. Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat.
Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepsin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepsin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi.
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia parasitica và Mucor purillus [1]. Protease thực vật Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein.
Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá. Ficin thu được từ nhựa cây sung (Ficus carica). Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên [1]. Protease vi sinh vật Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số loại nấm men.
download by : skknchat@gmail.com 10 * Vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B.
thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp.
Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.
Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12 [1]. * Nấm: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3 [1].
Một số nấm mốc khác như: A. download by : skknchat@gmail.com 11 cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát. * Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.