Luận văn ThS: Tối ưu điều kiện môi trường sinh tổng hợp protease A. oryzae VTCC-F-0187

Luận văn nghiên cứu tối ưu điều kiện môi trường ảnh hưởng sinh tổng hợp protease từ nấm Aspergillus oryzae VTCC F 0187. Khám phá quy trình hiệu quả.

• Tác giả: Lý Thị Huyền
• Người hướng dẫn: TS. Trịnh Đình Khá
• Trường học: Trường đại học khoa học - đại học thái nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Tối ưu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC – F - 0187
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thái nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. Lý do chọn đề tài
• 2. Mục tiêu của đề tài
• 3. Nội dung nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khái niệm Protease
• 1.2. Phân loại protease
• 1.3. Nguồn thu protease
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
• 2.2. Môi trường nuôi cấy
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ
• 2.4. Dung dịch và đệm
• 2.5. Địa điểm và thời gian
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A
• 3.2. Tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp protease
• 3.3. Sản xuất chế phẩm
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Tối Ưu Môi Trường Sinh Tổng Hợp Protease 55

Enzyme đóng vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp, từ thực phẩm đến dược phẩm. Protease, enzyme thủy phân protein, chiếm vị trí đặc biệt quan trọng, gần 60% thị trường enzyme. Aspergillus oryzae được công nhận là an toàn (GRAS) và có lịch sử sử dụng lâu đời trong sản xuất thực phẩm lên men. A. oryzae có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme, bao gồm protease. Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng và giảm giá thành, việc tối ưu môi trường sinh tổng hợp protease là vô cùng cần thiết. Các nghiên cứu tập trung vào chọn lọc chủng giống, tìm kiếm cơ chất mới và tối ưu các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, và thành phần môi trường. Nghiên cứu này tập trung vào tối ưu hóa môi trường để sinh tổng hợp protease hiệu quả hơn, sử dụng các nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước. Mục tiêu chính là tạo ra quy trình sản xuất protease ngoại bào hiệu quả từ chủng A. oryzae VTCC - F - 0187, sử dụng nguyên liệu rẻ và dễ kiếm. Đồng thời, sẽ khảo sát khả năng sinh protease sau bảo quản và nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường, điều kiện lên men đến sinh tổng hợp protease của A. oryzae VTCC - F – 0187. Cuối cùng, thử nghiệm lên men sản xuất chế phẩm protease thô được thực hiện.

1.1. Vai Trò Quan Trọng Của Enzyme Protease Trong Công Nghiệp

Protease là một nhóm enzyme quan trọng, xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide trong protein. Chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như dược phẩm, thực phẩm và công nghệ sinh học. Theo một nghiên cứu, protease chiếm gần 60% thị trường enzyme toàn cầu, cho thấy tầm quan trọng kinh tế của chúng. Việc sản xuất protease hiệu quả và kinh tế là yếu tố then chốt để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường.

1.2. Aspergillus Oryzae Chủng Vi Sinh Vật Tiềm Năng Cho Sinh Tổng Hợp Protease

Aspergillus oryzae là một loại nấm sợi được công nhận là an toàn và có lịch sử sử dụng lâu dài trong ngành công nghiệp thực phẩm. Nó có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào, bao gồm protease. A. oryzae là một lựa chọn tiềm năng để sản xuất protease quy mô lớn do khả năng phát triển trên nhiều loại cơ chất và dễ dàng điều khiển các điều kiện nuôi cấy. Việc nghiên cứu và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy A. oryzae có thể giúp tăng hiệu suất sản xuất protease và giảm chi phí.

II. Thách Thức Vấn Đề Trong Sản Xuất Protease A

Mặc dù A. oryzae là một chủng vi sinh vật tiềm năng, việc sản xuất protease từ chủng này vẫn còn đối mặt với nhiều thách thức. Giá thành chế phẩm protease còn khá cao do nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng nhiều. Để phát triển các dây chuyền sản xuất protease đạt hiệu quả cao, có nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành để chọn lọc chủng giống, tìm kiếm cơ chất mới thích hợp cho sinh tổng hợp protease. Bên cạnh đó thì việc tối ưu các điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ pH, oxy hòa tan, thành phần môi trường) cũng được các nhà nghiên cứu rất quan tâm, mục đích tìm ra điều kiện nuôi cấy phù hợp nhất để thu được lượng protease nhiều và hạ giá thành sản phẩm. Việc bảo quản giống trong thời gian dài có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn. Do đó, cần định kỳ cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu của chủng giống. Môi trường nuôi cấy cần chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết như C, H, O, N, các chất vô cơ và các chất vi lượng khác.

2.1. Ảnh Hưởng Của Điều Kiện Bảo Quản Giống Aspergillus Oryzae

Việc bảo quản giống Aspergillus oryzae trong thời gian dài có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease. Các điều kiện bảo quản không phù hợp có thể dẫn đến sự xuất hiện của các biến dị ngẫu nhiên, làm giảm hiệu suất sản xuất enzyme. Do đó, cần phải kiểm tra lại các đặc tính ban đầu của chủng giống sau một thời gian bảo quản và có các biện pháp bảo quản phù hợp để duy trì khả năng sinh tổng hợp protease.

2.2. Tầm Quan Trọng Của Thành Phần Môi Trường Nuôi Cấy Đối Với Sinh Tổng Hợp Protease

Thành phần môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của Aspergillus oryzae. Môi trường cần chứa đầy đủ các nguồn carbon, nguồn nitrogen, các chất khoáng và các yếu tố tăng trưởng. Sự thiếu hụt hoặc mất cân đối trong thành phần môi trường có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng vi sinh vật.

III. Cách Tối Ưu Hóa Nguồn Carbon Nitrogen Cho Protease 60

Nguồn carbon và nitrogen là hai yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protease. Nguồn carbon cung cấp năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, trong khi nguồn nitrogen là thành phần cấu tạo của protein. Việc lựa chọn và tối ưu hóa các nguồn carbon và nitrogen phù hợp có thể giúp tăng hiệu suất sinh tổng hợp protease. Các nguồn carbon thường được sử dụng bao gồm glucose, tinh bột, và các loại đường khác. Các nguồn nitrogen có thể là hữu cơ (bột đậu tương, pepton) hoặc vô cơ (muối nitrat, amoni). Cần phải có các chất cảm ứng - nguồn nitơ hữu cơ (bột đậu tương, bột mì, pepton, protein…) trong môi trường. Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ, người ta còn bổ sung vào môi trường nuôi cấy các nguồn nitơ vô cơ như các muối nitrat và amon.

3.1. Ảnh Hưởng Của Tỷ Lệ Bột Đậu Tương Và Bột Lõi Ngô Đến Sinh Tổng Hợp

Tỷ lệ giữa bột đậu tương và bột lõi ngô trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể đến sinh tổng hợp protease. Thí nghiệm cho thấy tỷ lệ bột lõi ngô và bột đậu tương thích hợp nhất cho A. oryzae lên men sinh tổng hợp protease tương ứng là 65% và 35%, hoạt tính enzyme protease cao nhất đạt 18 U/g. Khi tỉ lệ lõi ngô và đậu tương không thích hợp, hoạt tính sẽ giảm.

3.2. Vai Trò Của Cám Gạo Bổ Sung Trong Môi Trường Nuôi Cấy

Việc bổ sung cám gạo vào môi trường nuôi cấy có thể cải thiện khả năng sinh tổng hợp protease của Aspergillus oryzae. Protease được sinh tổng hợp trong môi trường có bổ sung thêm cám gạo đạt 19,7 U/g. Tuy nhiên, nồng độ cám gạo bổ sung cần được tối ưu hóa để đạt hiệu quả tốt nhất. Hỗn hợp 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo là nguồn cơ chất phù hợp cho chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease.

IV. Phương Pháp Tối Ưu Nhiệt Độ pH Độ Ẩm Để Tăng Protease 60

Ngoài nguồn carbon và nitrogen, các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH và độ ẩm cũng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protease. Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme, pH ảnh hưởng đến cấu trúc và hoạt tính của enzyme, và độ ẩm ảnh hưởng đến sự vận chuyển chất dinh dưỡng và quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng hoá học cũng tăng theo. Độ ẩm Thành phần nước chiếm từ 70 - 90% khối lượng cơ thể vi sinh vật, tất cả các quá trình phân huỷ thức ăn và các phản ứng chuyển hoá các chất trong tế bào đều diễn ra với sự có mặt của nước. pH môi trường (hay nồng độ ion H +) có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt lực enzyme. Mỗi một enzyme thể hiện sự tác dụng của mình ở một khoảng pH nhất định (có khi rất nhỏ).

4.1. Ảnh Hưởng Của Độ Ẩm Đến Sinh Tổng Hợp Protease

Độ ẩm môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng trao đổi chất của chủng nấm trong quá trình lên men xốp. Nghiên cứu trên cho thấy, độ ẩm tối ưu nhất cho quá trình này đạt 60%. Ở độ ẩm này, hoạt tính enzyme đạt tối đa là 22,2 U/g, khi độ ẩm tăng, cơ chất phồng lên làm tăng độ xốp, tạo điều kiện cho nấm dễ dàng tiếp xúc với cơ chất hơn. Nếu tăng độ ẩm hơn nữa thì hoạt tính enzyme sẽ bị giảm.

4.2. Tối Ưu Nhiệt Độ Nuôi Cấy Để Tăng Hoạt Tính Enzyme Protease

Nhiệt độ nuôi cấy có tác động lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease. Nghiên cứu chỉ ra rằng khi nhiệt độ tăng từ 25 – 30C sinh tổng hợp protease tăng lên và hoạt tính enzyme đạt cao nhất là 23,7 U/g ở nhiệt độ 30C. Vì vậy, nhiệt độ phù hợp nhất cho chủng A. oryzae VTCC-F-0187 là 30C.

4.3. Tối Ưu pH Môi Trường Nuôi Cấy Để Tăng Khả Năng Sinh Tổng Hợp

pH môi trường nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn tới hoạt tính của enzyme protease, vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất cảm ứng sinh enzyme. Kết quả cho thấy, khi pH môi trường nuôi cấy tăng từ 3 lên 6 thì hoạt tính của enzyme tăng khá mạnh đạt cực đại là 25,1 U/g. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng pH của môi trường, hoạt tính enzyme giảm đi.

V. Thời Gian Lên Men Tối Ưu Để Sinh Tổng Hợp Protease Cao Nhất 60

Thời gian lên men có vai trò quan trọng trong việc quyết định hiệu suất sinh tổng hợp protease. Hoạt tính enzyme của A. oryzae lên cao ở ngày thứ 5 và thứ 6 khi quá trình hóa nâu bào tử nấm bắt đầu. Những ngày sau đó khi các bào tử nấm hóa nâu ngày một nhiều thì sự sinh tổng hợp enzyme của nấm cũng giảm. Cần xác định thời gian lên men tối ưu để thu được lượng protease cao nhất.

5.1. Ảnh Hưởng Của Thời Gian Lên Men Đến Hoạt Tính Enzyme Protease

Thời gian lên men là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme của nấm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian ảnh hưởng lớn tới hoạt tính của enzyme protease của A. oryzae. Thời gian thích hợp nhất cho chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease là 6 ngày, hoạt tính enzyme đạt 27,1 U/g.

VI. Ứng Dụng Quy Trình Sản Xuất Protease VTCC F 0187 57

Sau khi xác định được các điều kiện tối ưu, quy trình sản xuất protease từ A. oryzae VTCC-F-0187 có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Từ đó mang lại hiệu quả kinh tế cho sản xuất trong nước. Quy trình này có thể được sử dụng để sản xuất chế phẩm enzyme thô hoặc chế phẩm enzyme tinh khiết, tùy thuộc vào mục đích sử dụng. Dịch chiết thô hay dịch nuôi cấy chứa enzyme sau khi đã loại bỏ tế bào và mảnh vụn tế bào được chuyển sang tinh sạch enzyme theo nhiều bước nhằm loại bỏ tất cả những chất ô nhiễm ảnh hưởng không tốt đến mục đích sử dụng. Việc lập công thức chế phẩm enzyme cũng giống như là một nghệ thuật và được các nhà sản xuất giữ bí mật chi tiết, hoặc không tiết lộ đối với khách hàng.

6.1. Lên Men Sản Xuất Chế Phẩm Protease Từ A. Oryzae VTCC F 0187

Lên men chủng A. oryzae VTCC-F-0187 trong hỗn hợp cơ chất 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo, với độ ẩm ban đầu là 60%, pH ban đầu bằng 6, ở nhiệt độ 30C trong tủ điều khiển nhiệt độ, có không khí lưu thông trong thời gian lên men 6 ngày.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong cơ cấu thương mại sinh phẩm toàn cầu, enzyme protease đóng vai trò trụ cột khi chiếm tới gần 60% tổng dung lượng thị trường enzyme công nghiệp, trong đó protease có nguồn gốc vi sinh vật đóng góp khoảng 40% tổng doanh số bán ra trên toàn thế giới. Nhu cầu ứng dụng protease ngày càng gia tăng vượt bậc trong các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, thủy sản, dệt may, thuộc da và y dược. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất hiện nay là giá thành chế phẩm thương mại còn tương đối cao do phụ thuộc nhiều vào các nguồn cơ chất tinh khiết nhập khẩu và công nghệ lên men phức tạp.

Tại Việt Nam, nguồn phụ phẩm nông nghiệp như lõi ngô, cám gạo và bột đậu tương vô cùng dồi dào với sản lượng hàng triệu tấn mỗi năm nhưng chưa được khai thác hiệu quả. Luận văn tập trung giải quyết bài toán tận dụng tối đa nguồn cơ chất rẻ tiền, sẵn có trong nước để tối ưu hóa quy trình công nghệ sinh tổng hợp protease ngoại bào từ chủng nấm sợi Aspergillus oryzae VTCC – F - 0187. Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm tại Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học thuộc Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên trong giai đoạn từ tháng 6/2017 đến tháng 7/2018.

Mục tiêu cụ thể của đề tài là xác định chính xác các thông số môi trường tối ưu gồm tỷ lệ phối trộn cơ chất, độ ẩm ban đầu, nhiệt độ, pH và thời gian lên men xốp. Kết quả nghiên cứu đã nâng cao hoạt độ protease từ mức cơ sở ban đầu 7,7 U/g lên mức cực đại 27,1 U/g, mang lại ý nghĩa kinh tế - kỹ thuật to lớn trong việc chủ động sản xuất chế phẩm sinh học quy mô nội địa, giảm thiểu chi phí sản xuất ước tính từ 35% đến 45% so với việc sử dụng môi trường tổng hợp tiêu chuẩn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Quá trình sinh tổng hợp protease trong nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết động học xúc tác enzyme và mô hình tương tác cơ chất - enzyme kinh điển của Michaelis - Menten qua phương trình phản ứng: Enzyme + Cơ chất tạo phức hợp Enzyme - Cơ chất rồi phân ly giải phóng Sản phẩm và Enzyme tự do. Protease (peptide-hydrolase 3.4) là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân các liên kết peptide (-CO-NH-) trong phân tử protein để tạo thành các chuỗi peptide ngắn và amino acid tự do. Dựa trên vị trí tác động, protease được chia thành endopeptidase (cắt liên kết bên trong chuỗi polypeptide) và exopeptidase (cắt liên kết ở đầu N hoặc đầu C tự do).

Bên cạnh đó, nghiên cứu vận dụng lý thuyết lên men bán rắn (lên men xốp) đối với vi nấm. Nấm sợi Aspergillus oryzae là đối tượng vi sinh vật đạt chuẩn an toàn sinh học GRAS do Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ chứng nhận. Hệ gene của loài này gồm 8 nhiễm sắc thể với 12.000 gene và 37 triệu cặp base. Loài nấm vi sinh này có khả năng thích nghi cao trên cơ chất xốp thông qua cơ chế tiết đa dạng các enzyme ngoại bào. Để kích thích chủng nấm sinh tổng hợp protease mạnh mẽ, môi trường lên men bắt buộc phải có cơ chất cảm ứng chứa nguồn nitơ hữu cơ (như protein từ bột đậu tương) kết hợp với chất mang tạo độ thoáng khí (như cellulose và hemicellulose từ bột lõi ngô).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng chủng nấm thuần khiết Aspergillus oryzae VTCC-F-0187 được tuyển chọn và cung cấp từ Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế theo nguyên tắc tối ưu hóa đơn yếu tố (từng nhân tố biến thiên độc lập trong khi cố định các yếu tố còn lại) nhằm đánh giá tác động của 6 chỉ tiêu: tỷ lệ bột đậu tương / bột lõi ngô (thay đổi từ 5% đến 45% đậu tương), tỷ lệ cám gạo bổ sung (5% đến 45%), độ ẩm ban đầu (50% đến 90%), nhiệt độ nuôi cấy (25°C đến 35°C), pH môi trường (3,0 đến 9,0) và thời gian lên men (từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 8).

Hoạt độ enzyme protease được định lượng chính xác bằng phương pháp Anson cải tiến dựa trên phản ứng thủy phân cơ chất casein 2,0% trong 10 phút ở 30°C. Phản ứng được ngưng bằng acid tricloacetic (TCA) 5,0%, sau đó dịch nổi được tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N trong môi trường natri cacbonat 6,0% và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 660 nm hoặc 750 nm. Định lượng sản phẩm dựa trên đường chuẩn L-Tyrosine tuyến tính trong dải nồng độ 0,2 đến 2,0 µM với phương trình hồi quy chuẩn y = 0,6475x + 0,0048. Toàn bộ thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập và số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 để tính toán giá trị trung bình và độ lệch chuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát thực nghiệm đã mang lại 4 phát hiện khoa học quan trọng:

• Khả năng duy trì hoạt tính sinh học sau bảo quản: Chủng giống Aspergillus oryzae VTCC-F-0187 sau khi hoạt hóa trên môi trường PDA và chuyển sang cơ chất thử nghiệm đã thể hiện khả năng phân giải casein mạnh mẽ trên đĩa thạch với đường kính vòng phân giải đạt từ 20 mm đến 25 mm, hoạt độ protease thô ban đầu đạt 15,2 ± 0,3 U/g.

• Tỷ lệ phối trộn cơ chất tối ưu: Khi khảo sát hệ cơ chất, tỷ lệ 35% bột đậu tương kết hợp với 65% bột lõi ngô cho hoạt độ đạt 18,0 U/g. Việc bổ sung tiếp 10% cám gạo vào môi trường (tương ứng tỷ lệ 35% bột đậu tương : 55% bột lõi ngô : 10% cám gạo) đã nâng hoạt độ protease lên 19,7 U/g, tăng khoảng 9,4% so với môi trường không bổ sung cám gạo. Nếu giảm bột đậu tương xuống mức 5% và tăng lõi ngô lên 95%, hoạt độ enzyme sụt giảm nghiêm trọng tới 25%, chỉ còn 13,5 U/g.

• Điều kiện vi khí hậu môi trường tối ưu: Độ ẩm tối ưu cho quá trình lên men xốp được xác định là 60%, mang lại hoạt độ 22,2 U/g, cao hơn 33,7% so với khi nuôi cấy ở độ ẩm 90% (chỉ đạt 16,6 U/g). Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu đạt mức 30°C với hoạt độ 23,7 U/g. Độ pH ban đầu tối thích là pH 6,0 cho hoạt tính đạt cực đại 25,1 U/g, tăng 28,7% so với môi trường pH 3,0 (19,5 U/g) và cao hơn 20,7% so với môi trường pH 8,0 (20,8 U/g).

• Động học tích lũy enzyme theo thời gian: Hoạt tính protease bắt đầu phát sinh từ ngày thứ nhất (đạt 7,7 U/g), tăng trưởng liên tục theo sự phân nhánh của hệ sợi nấm và đạt đỉnh cực đại 27,1 U/g vào ngày nuôi cấy thứ 6 (tăng gấp gần 4 lần, tương đương mức tăng 251,9% so với ngày đầu tiên). Sau ngày thứ 6, khi các bào tử nấm chuyển sang giai đoạn hóa nâu hoàn toàn, hoạt độ enzyme giảm nhanh chóng xuống còn 19,1 U/g ở ngày thứ 8.

Thảo luận kết quả

Cơ chế sinh học đằng sau sự gia tăng hoạt tính protease gắn liền với đặc tính lý hóa của môi trường lên men xốp. Bột lõi ngô đóng vai trò là chất mang tạo độ phồng xốp, đảm bảo độ thông khí và cung cấp oxy cho hệ sợi nấm hoại sinh hiếu khí. Bột đậu tương đóng vai trò là nguồn protein và nitơ hữu cơ dồi dào kích thích sự cảm ứng biểu hiện gene mã hóa protease. Việc bổ sung 10% cám gạo giúp cung cấp bổ sung các vitamin nhóm B và nguyên tố vi lượng cần thiết cho quá trình chuyển hóa nội bào. Độ ẩm 60% giúp hạt cơ chất trương nở tối ưu; nếu độ ẩm quá thấp dưới 50% sẽ làm giảm trao đổi chất, nhưng nếu độ ẩm vượt 80% đến 90% sẽ gây bết dính, làm suy giảm nghiêm trọng lượng oxy hòa tan trong khối cơ chất.

So sánh với các nghiên cứu công bố trước đây, hoạt độ protease của A. oryzae VTCC-F-0187 trên cơ chất phụ phẩm nông nghiệp (27,1 U/g) vượt trội so với chủng Aspergillus niger nuôi trên bột hướng dương (5,2 U/g) và tương đương với Aspergillus oryzae nuôi trên cơ chất bột khoai tây đắt tiền (18,68 U/g). Về mặt nhiệt độ, mức tối ưu 30°C của chủng nghiên cứu tương đương với A. niger nhưng thấp hơn A. oryzae LBA 01 (55°C đến 60°C) và Aspergillus clavatus (40°C), giúp tiết kiệm đáng kể năng lượng điều hòa nhiệt trong sản xuất công nghiệp.

Toàn bộ động thái thay đổi của hoạt tính protease theo từng yếu tố (tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, nhiệt độ, pH và thời gian) có thể được mô hình hóa trực quan thông qua các đồ thị đường tương quan 2 chiều và biểu đồ cột so sánh. Điểm uốn cực đại tại các giá trị tối ưu cung cấp dữ liệu định lượng chính xác để cài đặt thông số tự động hóa cho các hệ thống lên men buồng quy mô pilot.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện và chuyển giao quy trình công nghệ vào thực tiễn sản xuất chế phẩm enzyme sinh học, 4 giải pháp trọng tâm được đề xuất thực hiện như sau:

• Hoàn thiện công nghệ nâng quy mô lên men pilot: Chuyển giao quy trình lên men xốp từ quy mô bình tam giác và khay thí nghiệm (30 cm x 50 cm) sang hệ thống buồng lên men tự động công suất từ 50 kg đến 100 kg cơ chất/mẻ. Mục tiêu duy trì ổn định nhiệt độ 30°C, độ ẩm 60% và pH ban đầu 6,0 trong chu kỳ 6 ngày. Đơn vị thực hiện: Các Viện nghiên cứu và Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học Công nghệ với thời gian hoàn thành trong vòng 12 tháng.

• Chuẩn hóa chuỗi cung ứng nguyên liệu phụ phẩm: Xây dựng quy trình xử lý, nghiền mịn (kích thước hạt 0,5 mm đến 1,0 mm) và bảo quản nguồn bột lõi ngô, cám gạo từ các vùng chuyên canh nông nghiệp miền Bắc. Mục tiêu cắt giảm từ 40% đến 50% chi phí môi trường nuôi cấy so với việc sử dụng hóa chất ngoại nhập. Chủ thể thực hiện: Doanh nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi và phụ phẩm nông nghiệp trong thời hạn 6 tháng.

• Tối ưu hóa kỹ thuật thu hồi và tinh sạch chế phẩm: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ trích ly enzyme bằng hệ dung môi đệm photphat kết hợp sấy thăng hoa hoặc sấy phun ở nhiệt độ dưới 40°C với chất mang maltodextrin 5% đến 10%. Mục tiêu tạo ra chế phẩm protease dạng bột có độ bền hoạt tính đạt trên 85% sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện thường. Nhóm thực hiện: Phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme trong lộ trình 9 tháng.

• Mở rộng thử nghiệm ứng dụng trong thủy sản và chăn nuôi: Tiến hành thử nghiệm sử dụng chế phẩm protease thô để rút ngắn thời gian ủ thủy phân đạm cá, sản xuất nước mắm ngắn ngày hoặc bổ sung vào khẩu phần thức ăn chăn nuôi. Mục tiêu nâng cao hiệu suất hòa tan protein thêm 15% đến 20%. Chủ thể thực hiện: Doanh nghiệp sản xuất nước mắm và thức ăn gia súc trong thời gian 18 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn là tài liệu tham khảo giá trị đối với 4 nhóm đối tượng cụ thể sau:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học và Hóa sinh học: Tiếp cận phương pháp luận khoa học về thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa đơn yếu tố, kỹ thuật xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến và kỹ thuật lên men nấm sợi trên môi trường rắn.

• Kỹ sư công nghệ và chuyên viên R&D tại các doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học: Ứng dụng ngay công thức phối trộn cơ chất tối ưu (55% bột lõi ngô, 35% bột đậu tương, 10% cám gạo) để xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme protease thô với giá thành cạnh tranh.

• Doanh nghiệp chế biến thực phẩm, nước mắm và thức ăn chăn nuôi: Khai thác quy trình công nghệ để tự sản xuất nguồn protease phục vụ quá trình thủy phân nhanh protein thịt cá, giảm thời gian ủ chượp từ vài tháng xuống vài tuần và tăng tỷ lệ tiêu hóa thức ăn cho vật nuôi.

• Cán bộ quản lý nông nghiệp và môi trường: Tham khảo mô hình kinh tế tuần hoàn nhằm xử lý và nâng cao giá trị gia tăng cho phụ phẩm trồng trọt (lõi ngô, cám gạo), góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường nông thôn.

Câu hỏi thường gặp

• Chủng nấm Aspergillus oryzae có an toàn khi sản xuất chế phẩm dùng cho thực phẩm không? Chủng nấm sợi Aspergillus oryzae được xếp vào nhóm vi sinh vật an toàn đạt chuẩn GRAS của FDA Hoa Kỳ và có lịch sử lâu đời trong lên men tương truyền thống. Bào tử nấm có màu vàng hoa cau đặc trưng, không sinh độc tố aflatoxin, an toàn tuyệt đối cho người và gia súc.

• Bột lõi ngô đóng vai trò gì trong môi trường lên men sinh tổng hợp protease? Bột lõi ngô chiếm tỷ lệ lớn nhất (55%) đóng vai trò là chất mang hữu cơ tạo cấu trúc tơi xốp, giữ ẩm và lưu thông oxy cho nấm hiếu khí phát triển, đồng thời cung cấp nguồn carbon tự nhiên giúp tiết kiệm tới 50% chi phí môi trường.

• Tại sao hoạt tính protease lại giảm mạnh sau ngày lên men thứ 6? Sau 6 ngày (144 giờ), vi nấm hoàn thành giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng và chuyển sang giai đoạn sinh sản tạo bào tử hóa nâu. Nguồn dinh dưỡng cạn kiệt kết hợp với việc vi nấm tự phân và tiết ra enzyme phân hủy nội bào khiến hoạt độ protease sụt giảm từ 27,1 U/g xuống 19,1 U/g ở ngày thứ 8.

• Phương pháp Anson cải tiến xác định hoạt độ enzyme dựa trên nguyên lý nào? Phương pháp dựa trên sự thủy phân cơ chất casein bởi protease tạo thành các peptide và amino acid hòa tan trong acid TCA 5,0%. Các gốc Tyrosine và Tryptophan phản ứng với thuốc thử Folin tạo phức hợp màu xanh đo quang phổ ở 660 nm hoặc 750 nm.

• Quy trình lên men xốp của luận văn có thể triển khai ở quy mô nông hộ không? Quy trình hoàn toàn khả thi ở quy mô xưởng nhỏ hoặc nông hộ nhờ sử dụng thiết bị đơn giản như khay men 30 cm x 50 cm, nguồn nhiệt 30°C và cơ chất phụ phẩm nông nghiệp rẻ tiền, dễ kiếm tại địa phương.

Kết luận

• Đã phục hồi thành công khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của chủng Aspergillus oryzae VTCC-F-0187 sau bảo quản với hoạt tính phân giải casein ban đầu đạt 15,2 ± 0,3 U/g và đường kính vòng phân giải từ 20 mm đến 25 mm.
• Xác định được công thức phối trộn cơ chất tối ưu từ nguồn phụ phẩm nông nghiệp trong nước gồm 55% bột lõi ngô, 35% bột đậu tương và 10% cám gạo.
• Thiết lập bộ thông số môi trường tối ưu cho quá trình lên men xốp: độ ẩm ban đầu 60%, nhiệt độ nuôi cấy 30°C và pH môi trường ban đầu đạt 6,0.
• Xác định thời gian lên men thích hợp nhất là 6 ngày (144 giờ), đưa hoạt độ protease đạt mức cực đại 27,1 U/g (tăng gần gấp 4 lần so với ngày nuôi cấy đầu tiên).
• Xây dựng thành công quy trình thử nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme protease thô trên khay nuôi cấy 30 cm x 50 cm đạt độ ổn định và hiệu suất cao.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là đã hoàn thiện cơ sở khoa học và thực tiễn cho việc tận dụng phụ phẩm lõi ngô và cám gạo để sản xuất protease chất lượng cao với chi phí thấp. Trong kế hoạch 12 tháng tiếp theo, nhóm nghiên cứu khuyến nghị triển khai thử nghiệm pilot ở quy mô 50 kg đến 100 kg/mẻ và tối ưu hóa công nghệ sấy tạo bột thương phẩm. Quý độc giả, nhà khoa học và doanh nghiệp quan tâm có thể ứng dụng ngay các thông số tối ưu trong luận văn để mở rộng sản xuất và hợp tác phát triển công nghệ enzyme tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái niệm Protease (peptide – hidrolase 3.4) là nhóm enzyme xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n, polypeptide trong phân tử protein đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển amino acid [1].

Sơ đồ enzyme protease thủy phân phân tử Protein [7] Protease hay các enzyme proteolytic xúc tác các phản ứng thuỷ phân protein và peptide. Protease có trong nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và trong các hạt ngũ cốc nảy mầm. Protease có 2 loại: proteinase và peptidase. Proteinase thuỷ phân protein thành các peptide và amino acid, peptidase thuỷ phân các peptide thành amino acid.

Sự phân chia protease thành hai loại enzyme ở đây là điều ước lệ vì protease cũng thuỷ phân peptide [6]. Protease được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa.) và động vật (có trong gan, dạ dày. Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu. Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại chế phẩm.

Quá trình này có thể được thực hiện nhờ các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình lên men thu protease để sản xuất chế phẩm [7]. download by : skknchat@gmail. Phân loại protease Theo ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử, protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme; Tuy nhiên, việc định tên cho các protease không dễ dàng tuân theo cách định tên phổ biến của hệ thống enzyme bởi sự đa dạng về cấu trúc và khả năng hoạt động. Phân loại dựa vào pH hoạt động tối ưu Trước đây, protease được phân loại một cách đơn giản dựa vào pH hoạt động tối ưu thành ba nhóm: Protease acid, protease trung tính và protease kiềm [1].

Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu Protease Đặc điểm Protease acid Hoạt động ở pH 2-6, gồm phần lớn là aspartic protease, một số cysteine protease và metalloprotease Protease trung Hoạt động ở pH 7-8, gồm cysteine protease, tính metalloprotease và một số serine protease Protease kiềm Hoạt động ở pH 8-13, chủ yếu là serine protease 1. Phân loại dựa vào các tiêu chí cơ bản Phân loại dựa trên ba tiêu chí cơ bản: loại phản ứng xúc tác, bản chất hóa học của trung tâm xúc tác và mối quan hệ giữa sự tiến hóa có liên quan đến cấu trúc, protease được chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase [1]. download by : skknchat@gmail. Sơ đồ phân loại protease [7] * Exopeptidase Phân loại dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide exopeptidase được phân chia thành hai loại: Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide; Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.

* Endopeptidase Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin proteinase: Là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động download by : [e-mail] 6 xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN.

Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vài protein động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

Mô hình phân tử protease (papain) [11] Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. download by : skknchat@gmail.

Mô hình phân tử protease (renin) [17] Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Trong bốn nhóm protease kể trên, các cysteine proteinase và protease- tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn suất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn suất của amino acid.

Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về câu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đổi bé, nhất là các cysteine proteinase. Các cysteine proteinase có trọng lượng phân tử vào khoảng 20. Tuy nhiên, cũng có một số cysteine proteinase có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của Penicillium cyoneo’fulvum (44.

Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với cysteine proteinase (khoảng 33. Protease tiol và nhiều protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30. download by : skknchat@gmail. Cơ chế xúc tác Một chất xúc tác dù là hóa học hay sinh học đều có tác dụng làm tăng vận tốc của phản ứng.

Vận tốc của phản ứng enzyme là lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một đơn vị thời gian. Thông thường, lượng cơ chất hoặc lượng sản phẩm được biểu diễn bằng nồng độ phân tử (M) và đơn vị thời gian là giây [8]. Sự xúc tác của enzyme thường được thực hiện bằng cách tạo ra ít nhất một phức hợp tạm thời giữa enzyme và cơ chất. Mô hình đơn giản nhất là mô hình của Michaelis.

Mô hình này thừa nhận rằng phản ứng chỉ xảy ra với một cơ chất và tạo thành chỉ một sản phẩm [8]: E + S → ES → P + E Trong đó: E là Enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là sản phẩm (Product) * Giai đoạn đầu: phức hợp enzyme cơ chất dược tạo thành một cách nhanh chóng và thuận nghịch nhờ các tương tác phi đồng hóa trị giữa cơ chất và các amino acid nhận biết của tâm hoạt động của enzyme [8]. Rồi trạng thái quá độ này sẽ tự chuyển hóa thành phức enzyme - sản phẩm và cuối cùng phức enzyme - sản phẩm sẽ phân ly thành enzyme tự do và sản phẩm [8]. Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học của enzyme người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất thành hợp chất trung gian [2]. E (enzyme) + S (cơ chất)→ ES (hợp chất trung gian) download by : skknchat@gmail.

Nguồn thu protease 1. Protease động vật Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất. Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat.

Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepsin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepsin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi.

Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia parasitica và Mucor purillus [1]. Protease thực vật Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein.

Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá. Ficin thu được từ nhựa cây sung (Ficus carica). Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên [1]. Protease vi sinh vật Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số loại nấm men.

download by : [e-mail] 10 * Vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B.

thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp.

Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.

Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12 [1]. * Nấm: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3 [1].

Một số nấm mốc khác như: A. download by : [e-mail] 11 cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát. * Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.