Đặt vấn đề Pheỉỉinus igniarius hay gọi là nấm Thượng hoàng là loại nấm có tính dược liệu cao được phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản v. Từ thời xưa, con người đã sử dụng loại nấm này để điều trị một số bệnh lý nhờ vào hoạt tính sinh học của nó như hỗ trợ điều trị ung thư, tiểu đường, tiêu chảy, v.v Hiện nay, vấn đề sức khỏe đang nhận được sự quan tâm đặc biệt của con người. Nấm Thượng hoàng (Pheỉỉinus igniarius) được biết đến như một loại nguyên liệu chứa nhiều hoạt chất tốt và mang hoạt tính sinh học cao. Nhận thấy được nhu cầu này, đề tài “Toi ưu hóa quá trình thu nhận dịch chiết nấm Thượng hoàng (Phellinus ỉgniarius).
ứng dụng sản xuất thực phẩm bo trợ sức khỏe” tiến hành tối ưu hóa qúa trình trình thu nhận dịch chiết và xây dựng quy trình sản xuất thực phẩm bổ trợ sức khỏe ở quy mô phòng thí nghiệm. Mục tiêu của đề tài - Tối ưu hóa quy trình sản xuất dịch chiết nấm Thượng hoàng thông qua tối ưu các điều kiện trích ly bao gồm: nhiệt độ, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian trích ly. - Đề xuất quy trình sản xuất thực phẩm bổ trợ sức khỏe dạng dịch chiết, cao nấm Thượng hoàng. - Xác định khả năng kháng oxi hóa bằng phưong pháp xác định khả năng khử gốc tự do DPPH.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tương nghiên cứu là nấm Thượng Hoàng tên khoa học là Pheỉỉinus igriarius, đây là loại nấm có dược tính cao. Nguyên liệu được mua về ở dạng xay nhỏ mịn, có màu nâu. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Đe tài này có ý nghĩa khoa học trong việc xác định điều kiện tối ưu thu nhận dịch chiết bằng phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm nhằm xác định điều kiện thu được polyphenol cao nhất trong điều kiện thí nghiệm. Ngoài ra, kết quả đề tài cũng đề xuất quy trình sản xuất thực phẩm bổ trợ sức khỏe dạng dịch chiết, cao nấm Thượng hoàng làm tiền đề cho những nghiên cứu nhằm ứng dụng vào nghiên cứu quy trình sản xuất quy mô lớn hơn và ứng dụng rộng rãi nấm Thượng hoàng.
1 CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN 1. Nguồn gốc và đặc tính của nấm Thượng Hoàng (Phellinus igniarius) ỉ. Nguồn goc và vị trí trong phân loại nấm học Chi Pheỉỉinus thuộc họ Hymenochaetaceae là một loại nấm được sử dụng hơn 2000 năm trước và được nhắc đến nhiều trong dược điển Trung Quốc, phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Mông cổ, Hàn Quốc và một số nước châu Á khác cũng như Mỹ và Châu Phi. Chi Phellinus có nhiều loài như: Pheỉỉinus ỉinteus, Pheỉỉinus baumii, Pheỉỉinus igniarius,.
gọi chung là Sanghuang (Trung Quốc) hay còn có tên gọi khác là Nấm Thượng Hoàng (Việt Nam). Vị trí Nấm Thượng Hoàng trong phân loại nấm học [1]. Ngành: Basidiomycota Lớp: Basidiomycete Bộ: Hymenochaetaỉes Họ: Hymenochaetaceae Chi: Pheỉỉinus Theo nghiên cứu đã công bố của Ewa Zapora và cộng sự, tính đến 2016 có 138 loài thuộc chi Pheỉỉinus như: p. Đặc điểm nấm học Đặc điểm phát triển của Pheỉỉinus phát triển theo từng giai đoạn tại Poland được Ewa Zapora và cộng sự ghi nhận lại theo nghiên cứu đã công bố tại hình 1.1: Phellinus igniarius sinh trưởng tại rừng Bialowieza, Poland A.
Quả thể non sinh trưởng tại Salix fiagili B. Sinh trưởng trên thân cây Betula pendula chết c. Quả thể trên 10 năm tuổi tại Carpinus betuTus D. Ouả thể 2Ĩà sinh trưởna tai Caroinus betulus Quả thễ Phellinus thường có dạng quạt, thân gỗ cứng, mặt trên có màu đạm, mặt dưới có thể có lông mịn, màu nhạt.
Các loại nấm này thường mọc ỏ vùng rừng sâu, núi cao, các khu rừng nguyên sinh, có thể chịu được các yếu tố khắc nghiệt như mưa kéo dài hay hạn hán [3]. Hằng năm, nấm phát triển tạo thành các lớp thụ tầng chồng lên nhau, qua thòi gian, các lớp này sẽ trở nên cứng và khô tạo thành lóp thân gỗ của nấm. Khi nấm còn tươi thường có màu vàng nhạt, khi già hoặc được sấy khô sẽ trở nên sậm màu có thể chuyển sang màu xám đen. 3 Ở Việt Nam, nấm Thượng Hoàng tự nhiên thường xuất hiện xung quanh khu vực Nghệ An, Huế.
Quả thể của loài nấm này được tìm kiếm, thường là đối tượng nghiên cứu trong lĩnh vực y dược [4]. Thành phần hóa học của nấm Thượng Hoàng Có nhiều bài báo, nghiên cứu về thành phần hóa học của nấm Thượng hoàng, các bài báo này chỉ ra nhiều hợp chất mang hoạt tính sinh học, có tác dụng tích cực đến sức khỏe của con người. Thành phần dinh dưỡng trong nấm Thượng Hoàng Nấm Thượng Hoàng (Phellnus igniarius) được biết đến và sử dụng như một vị thuốc trong y học cổ truyền ở nhiều quốc gia, đặc biệt là các quốc gia chằu Á. Bên cạnh đó, các nghiên cứu về thành phần trong nấm cũng chỉ ra rằng đây là một loại nấm có giá trị dinh dưỡng, chứa các hợp chất mang hoạt tính sinh học.
Theo nghiên cứu của Nae-Cherng Yang (2016) [5], một số thành phần dinh dưỡng thiết yếu của nấm Thượng Hoàng được trình bày ở bảng 1.1 sau đây: Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng quả thể nấm Phellinus igniarius thu hái tại Đài Loan Thành phần Định lượng (%) Thành phần Định lượng (pg/g) Độ am 16,0 ± 1,28 Mg 5,1 ±0,1 Protein thô 5,6 ±0,11 K 44,0 ± 2,8 Chất béo thô 1,3 ±0,07 Ca 14,8 ±2,8 Chất sọi thô 7,9 ± 0,52 Mn 0,6 ± 0,0 Chất tro 2,2 ±0,04 Fe 1,0 ±0,0 Chất hòa tan 67,1 ±0,59 Cu 0,3 ± 0,0 không chứa Nitơ Na 0,8 ± 0,3 Zn 0,2 ± 0,0 4 1. Lởp chất polyphenol Các họp chất polyphenol có thế được phân loại thành các phenol đon giản, các acid phenolic bao gồm: acid gallic, acid benzoic, acid syringic, v.v các polyphenol như: flavonoid, tanin, v.v được biết đến là các họp chất mang đặc tính có lợi cho sức khỏe, chống gốc tự do, ức chế thủy phân và oxi hóa enzym, hoạt động như 1 chất chống oxi hóa hiệu quả [6]. Polyphenol có tác dụng chống viêm, hạ đường huyết, kích thích hệ miễn dịch hoạt động chống lại các tác nhân gây bệnh.Theo nghiên cứu của Ziaja (2017) và cộng sự, chứng minh trong 4 loài nấm thuộc chi Phellinus bao gồm p. robustus có sự hiện diện của aicd syringic và acid protocatechuic (í), các chất này có hoạt tính sinh học cao, trong đó acid protocatechuic là chất có khả năng chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm cao [7].
Acid protocatechuic (1) Protocatechualdehyde (2) Acid caffeic (3) Acid ellagic (4) Năm 2010, Lee và cộng sự tách được 9 họp chất trong đó có 4 họp chất thuộc lóp phenolic bao gồm acid protocatechuic (1), protocatechualdehyde (2), acid caffeic (3), và acid ellagic (4) tò loài Phellinus linteus. Ngoài ra trong trong khuôn khô nghiên cún của mình, Lee và cộng sự chứng minh được khả năng ức chế protein Tyrosine phosphatese 1/? của các họp 5 chất được phân lập từ quả thể Pheỉỉinus ỉinteus được kì vọng là bước đi mới trong lĩnh vực y dược [8]. Năm 2015, Suabjakyong và cộng sự xác định 7 hợp chất thuộc lớp polyphenol bao gồm 3,4- dihydroxybenzaldehyde (5), 4-(3,4-dihydroxyphenyl-3-buten-2one (6), inonoblin c (7), phelligridin D (8), inoscavin c (9), phelligridin c (10) và interfungin B (11) từ Pheỉỉinus igniarius. Polyphenol sau khi định danh tiếp tục được nghiên cứu khả năng ức chế Acrolein và mô hình chống đột quỵ trên chuột.
Kết quả nghiên cứu cho thấy chiết xuất polyphenol từ loài Pheỉỉinus igniarius có khả năng kiềm hãm độc tính Acrolein 0,5 và 2 gM ở nồng độ 0,5 và 2 ựg/mỉ tưong ứng, các cá thể chuột giảm 62,2% khả năng đột quỵ sau khi được điều trị bằng chiết xuất polyphenol được chiết tách từ nghiên cứu [9]. ỉ II h°yì yy° ho'^^yn^ oX Xìl H H°Y%yX H01 ° OH 3,4- 4-(3,4-dihydroxyphenyl-3- dihydroxybenzalde Inonoblin c (7) buten-2one (6) hy de (5) OH OH o; o roAA^ỵík--- O XXX HO Y O 0 Phelligridin D (8) Inoscavin c (9) Phelligridin c (10) H0 - HO f V 0 OH Interfungin B (11) 6 Năm 2017, Zheng và cộng sự nghiên cứu tác động polyphenol từ Pheỉỉinus igniarius đến hoạt động chống tiểu đường loại 2. Theo nghiên cứu, Zheng chứng minh được sự có mặt của 4 hợp chất thuộc lớp polyphenol bao gồm 7,8-dihydroxycoumarin (12) , 3,4- dihydroxybenzalacetone (13), 7,3'-dihydroxy-5'-methoxyisoflavone (14) và inoscavin c (9). Ket quả nghiên cứu cho thấy Phellinus igniarius giàu polyphenol, các loại polyphenol này thể hiện khả năng chống tiểu đường thông qua việc làm tăng khả năng hấp thu glucose của dòng tế bào L6, cải thiện khả năng dung nạp glucose giảm khả năng kháng insulin, giảm nồng độ glucose trong máu [10].
3,4- 3'-dihydroxy-5'- 7,8-dihydroxycoumarin dihydroxybenzalaceton methoxyisoflavone (12) e (13) (14) 1. Hoạt tính sinh học Từ lâu theo y học phương Đông nói chung và y học cổ truyền Trung Quốc nói riêng loài Phenllinus được sử dụng như một loại dược liệu ngăn ngừa các bệnh như: rối loạn tiêu hóa, xuất huyết, ung thư, v. Nhiều nghiên cứu chứng minh các chất trích ly từ quả thể nấm hoặc sợi nấm có tác dụng phòng ngừa và chữa nhiều bệnh khác nhau. Ngoài ra, Pheỉỉinus còn kích thích chức năng miễn dịch, kháng viêm, là một ứng cử viên tiềm năng trong ngăn ngừa và phòng chống nhiều loại ung thư [3].
Hoạt tính kháng oxi hóa Năm 2014, Jin Ga-Heon và cộng sự nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa, khả năng ức chế sự hoạt động của enzyme Acetylcholinesterase, Xathine oxyase từ quả thể, sợi nấm, và dịch nuôi cấy Pheỉỉinus igniarius. Trong nghiên cứu, Jin và cộng sự sử dụng dung môi ethanol 70% trích ly dịch chiết, sau đó sấy ở nhiệt độ 40°C và lấy mẫu thử hoạt tính kháng oxi hóa bằng DPPH nhằm xác định khả năng kháng oxi hóa từ loài Phellinus igniarius. Ket quả thu 7 được khả năng nhặt gốc tự do từ dịch chiết quả thể, sợi nấm và dịch nuôi cấy là 90,25- 95,60%, 78,82-85,24%, 76,32-82,50% tương ứng ở nồng độ 50-400 ụ. Hoạt tính kháng viêm Các nghiên cứu về khả năng kháng viêm của Pheỉỉinus đã chứng minh được các hợp chất bên trong nguyên liệu này có khả năng kháng viêm hiệu quả.
Năm 2007, Jin và công sự nghiên cứu về khả năng chống viêm củã Pheỉhnus ỉinteus trên dòng tế bào RAW264. Kết quả cho thấy các tế bào được xử lí bằng dịch trích ly từ Pheỉỉinus ỉinteus có khả năng chống viêm hiệu quả theo mô hình trong phòng thí nghiệm [11]. Năm 2019, Kim và cộng sự nghiên cứu hiệu quả kháng viêm và kháng oxi hóa từ Pheỉỉinus igniarius trên dòng tế bào RAW 264. Ket quả nghiên cứu kết luận các tế bào được xử lí bang lipopolysaccharide có khả năng kháng viêm và kháng oxi hóa đáng kể, phụ thuộc vào nồng độ lipopolysaccharide khi xử lí mẫu, đây là một nghiên cứu triển vọng nhằm tìm ra một phương pháp có giá trị trong điều trị các bệnh viêm nhiễm [12].