Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn Paraburkholderia caribensis

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn paraburkholderia caribensis, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyễn Thị Phương Mai
• Người hướng dẫn: ThS. Trần Chí Hiếu
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn Paraburkholderia caribensis
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn Paraburkholderia caribensis
• 2.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Paraburkholderia caribensis
• 2.3. Phân bố của vi khuẩn Paraburkholderia caribensis
• 2.4. Đặc điểm sinh hóa, sinh lý vi khuẩn Paraburkholderia caribensis
• 2.5. Tổng quan về quá trình cố định nitơ
• 2.6. Vai trò của đạm đối với cây trồng
• 2.7. Quá trình cố định nitơ
• 2.8. Ảnh hưởng của các yếu tố điều kiện và môi trường lên vi sinh vật
• 2.9. Chất dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật
• 2.10. Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật
• 2.11. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của vi sinh vật
• 2.12. Tỷ lệ nạp giống ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật
• 2.13. Ảnh hưởng của tốc độ lắc ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật
• 2.14. Thời gian thế hệ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật
• 2.15. Đường cong tăng trưởng biểu diễn sự sinh trưởng của vi sinh vật
• 2.16. Giới thiệu phương pháp tối ưu
• 2.16.1. Phương pháp Plackett-Burman
• 2.16.2. Phương pháp Box — Behnken
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu
• 3.3. Phương pháp
• 3.3.1. Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật
• 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả nội dung 1: Khảo sát đơn yếu tố điều kiện và nguồn dinh dưỡng
• 4.1.1. Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng vi khuẩn
• 4.1.2. Khảo sát sự tăng trưởng và khả năng cố định đạm
• 4.1.3. Kết quả khảo sát điều kiện đến vi khuẩn P.
• 4.1.4. Kết quả khảo sát nguồn dinh dưỡng
• 4.2. Kết quả nội dung 2: Tối ưu hóa điều kiện và môi trường nuôi cấy vi khuẩn
• 4.2.1. Kết quả sàng lọc các yếu tố có ý nghĩa bằng ma trận Plackett-Burman
• 4.2.2. Kết quả tối ưu hóa điều kiện và thành phần môi trường lên men
• 4.2.3. Kết quả kiểm định thực tế mô hình tối ưu hóa
• 4.2.4. Kết quả đường cong tăng trưởng trên môi trường tối ưu
• 4.3. Thảo luận chung
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn Paraburkholderia caribensis

Vi khuẩn Paraburkholderia caribensis là một loài vi khuẩn có khả năng cố định đạm, đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp. Việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho loài vi khuẩn này không chỉ giúp tăng cường khả năng sinh trưởng mà còn nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp. Nghiên cứu này nhằm tìm ra các yếu tố tối ưu ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn, từ đó ứng dụng vào thực tiễn sản xuất.

1.1. Đặc Điểm Của Vi Khuẩn Paraburkholderia caribensis

Vi khuẩn Paraburkholderia caribensis có khả năng sinh trưởng trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Chúng có thể sống trong đất, nước và có khả năng chịu đựng các điều kiện khắc nghiệt. Đặc điểm này giúp chúng trở thành một ứng viên tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm sinh học.

1.2. Vai Trò Của Vi Khuẩn Trong Nông Nghiệp

Vi khuẩn này không chỉ giúp cố định đạm mà còn tạo ra các chất kích thích tăng trưởng cho cây trồng. Nghiên cứu cho thấy rằng Paraburkholderia caribensis có thể cung cấp đến 50% đạm sinh học cho cây trồng, giúp tăng năng suất và chất lượng sản phẩm.

II. Vấn Đề Trong Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn

Mặc dù tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho vi khuẩn Paraburkholderia caribensis mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, và nguồn dinh dưỡng cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo sự phát triển tối ưu của vi khuẩn. Việc không kiểm soát tốt các yếu tố này có thể dẫn đến sự giảm sút trong khả năng sinh trưởng và hiệu quả sản xuất.

2.1. Thách Thức Về Điều Kiện Môi Trường

Điều kiện môi trường như pH và nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi khuẩn. Nghiên cứu cho thấy rằng pH tối ưu cho sự phát triển của Paraburkholderia caribensis là 7,2, trong khi nhiệt độ lý tưởng là 25°C.

2.2. Ảnh Hưởng Của Nguồn Dinh Dưỡng

Nguồn dinh dưỡng cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình nuôi cấy. Việc sử dụng peptone và sucrose với nồng độ phù hợp có thể tối ưu hóa sự phát triển của vi khuẩn, từ đó nâng cao năng suất sinh khối.

III. Phương Pháp Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn

Để tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho Paraburkholderia caribensis, các phương pháp như thiết kế Box-Behnken và Plackett-Burman được áp dụng. Những phương pháp này giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng và tìm ra điều kiện tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn.

3.1. Phương Pháp Plackett Burman

Phương pháp Plackett-Burman cho phép khảo sát ảnh hưởng của nhiều yếu tố trong một thời gian ngắn. Kết quả từ phương pháp này giúp xác định các yếu tố quan trọng nhất cần được tối ưu hóa trong môi trường nuôi cấy.

3.2. Phương Pháp Box Behnken

Phương pháp Box-Behnken được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy sau khi đã xác định được các yếu tố quan trọng. Phương pháp này giúp tìm ra sự kết hợp tối ưu giữa các yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ dinh dưỡng.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Vi Khuẩn Paraburkholderia caribensis

Vi khuẩn Paraburkholderia caribensis không chỉ có tiềm năng trong việc cải thiện năng suất cây trồng mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Việc sử dụng vi khuẩn này trong sản xuất nông nghiệp có thể giảm thiểu việc sử dụng phân bón hóa học, từ đó giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

4.1. Tăng Cường Năng Suất Cây Trồng

Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng Paraburkholderia caribensis có thể giúp tăng năng suất cây trồng lên đến 30%. Điều này không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn giúp cải thiện chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

4.2. Giảm Thiểu Ô Nhiễm Môi Trường

Sử dụng vi khuẩn trong nông nghiệp giúp giảm thiểu lượng phân bón hóa học cần thiết, từ đó giảm thiểu ô nhiễm đất và nước. Điều này góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng và môi trường sống.

V. Kết Luận Về Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn

Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho Paraburkholderia caribensis là một bước quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm sinh học ứng dụng trong nông nghiệp. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc kiểm soát các yếu tố như pH, nhiệt độ và nguồn dinh dưỡng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn trong sản xuất nông nghiệp bền vững.

5.1. Triển Vọng Nghiên Cứu Trong Tương Lai

Nghiên cứu về Paraburkholderia caribensis sẽ tiếp tục được mở rộng để tìm ra các ứng dụng mới trong nông nghiệp. Việc phát triển các sản phẩm sinh học từ vi khuẩn này có thể giúp cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng.

5.2. Đóng Góp Vào Nông Nghiệp Bền Vững

Việc ứng dụng vi khuẩn trong sản xuất nông nghiệp không chỉ giúp tăng năng suất mà còn bảo vệ môi trường. Điều này góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Đối với cây trồng, đạm là nguyên tố rat quan trọng thứ hai trong cây trồng, sau carbon (C), đạm là một chất dinh dưỡng quan trọng cho sự phát triển và sinh trưởng và năng suất của cây. Theo số liệu năm 2021 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, hàng năm, nước ta sử dụng trên 10 triệu tấn phân bón hóa học. Tuy nhiên, lượng phân bón thường chỉ được hấp thu khoảng 50% thì mỗi năm Việt Nam lãng phí khoảng 2 tỷ USD từ phân bón. Đạm hóa chất dư thừa có thể tăng độ kiềm của đất, làm tăng độ pH, điều này gây ra hiện tượng bị chai cứng, và lượng đạm Nitrate thừa lại hòa tan vào mạch nước ngầm và chảy ra sông suối làm cho động vật và người bi nhiễm độc và cũng là một trong những nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính (Stoltzfus và ctv, 1997).

Như vậy, bón phân hóa học vừa tốn kém vừa gây ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, lượng nito trong không khí chiếm đến 78% mà cây lại không sử dụng được. Dé giải quyết van đề này, trên thế giới, hiện nay đang có xu hướng nghiên cứu và sử dụng phân bón sinh học nhờ sự có định nitơ của một số loài vi khuẩn trong đất, tiêu biểu như một số loài vi khuẩn thuộc giống Azospirillum va Burkholderia có thé tong hop đạm nhờ quá trình cố định nitơ sinh học với enzyme nitrogenase cắt nối ba của phân tử nitơ tạo ra amoniac. Có nghiên cứu chứng minh rằng khả năng có định đạm của chủng Burkholderia có khả năng cung cấp đến 50% đạm sinh học trong khi chủng Pseudomonadota chỉ cung cấp 25% đạm sinh học (Ngô Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp, 2013) và một số chủng của chỉ Paraburkholderia cấp nguồn đạm giúp cây nảy mầm và sinh trưởng nhanh hơn và tăng năng xuất (Đỗ Thành Luân và Nguyễn Khởi Nghĩa, 2020).

Đặc biệt trong các loài của chỉ Paraburkholderia có loài Paraburkholderia caribensis (P. caribensis) có khả năng cô định đạm, nhưng loài này chưa được ứng dụng trong sản xuất, vì trước đây loài này bị xếp vào chi gây bệnh sau này được chuyền qua chi mới không gây bệnh. Ngoài ra, còn có thé tong hợp các kích thích tố tăng trưởng như IAA, siderophores, photpho. Do đó, tối ưu hóa thành phần môi trường lên men vi khuẩn Paraburkholderia caribensis được nghiên cứu hướng tới việc sản xuất sản pham sinh học nhằm giảm lượng phân bón hóa học, tiết kiệm chi phí sản xuất cho nông dân và góp phần bảo vệ môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng đồng, gia tăng sản lượng, đáp ứng nhu cau lương thực ngày càng cao của Việt Nam và thé giới.

Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích là tối ưu hóa môi trường lên men vi khuẩn Paraburkholderia caribensis nhằm tạo ra nguồn sinh khối cao nhằm sản xuất sản phẩm sinh học ứng dụng trong cây trồng nông — lâm nghiệp. Mục tiêu đề tài: Xác định được điều kiện và thành phần môi trường nuôi cây vi khuẩn Paraburkholderia caribensis nhằm cho ra sinh khối cao. Nội dung nghiên cứu: Nội dung 1: Khảo sát đơn yếu tổ điều kiện và nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn Paraburkholderia caribensis Nội dung 2: Tối ưu điều kiện và môi trường nuôi cấy của vi khuẩn Paraburkholderia caribensis CHƯƠNG 2. TONG QUAN TAI LIEU 2.

Tống quan về vi khuẩn Paraburkholderia caribensis 2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Paraburkholderia caribensis Paraburkholderia caribensis trước đây thuộc chi Burkholderia, lần đầu tiên được phân lập từ vertisol ở Martinique và sau đó là từ nốt san của Mimosa spp. ở Đài Loan và Trung Quốc (Achouak và ctv, 1999; Liu va ctv, 2011), trước đây thuộc một chi gây bệnh trên thực vật và gây bệnh cơ hội ở bệnh nhân sơ nang. Sau đến năm 2014 được Sawana va ctv, chuyén qua chi Paraburkholderia, ho: Burkholderiaceae, bộ: Burkholderiales, lớp: Betaproteobacteria, ngành: Pseudomonadota, thuộc chi không gây nhiễm bệnh trên người và làm một tiềm năng mạnh mẽ dé thực hiện quá trình cố định đạm sinh học (Poroshina và ctv, 2013).

Paraburkholderia caribensis là một té bào Gram âm dang que, 0,5 x 1 - 2 um, không sinh bào tử. Các khuẩn lạc có kích thước khoảng 0,5 - 2,0 mm sau khi ủ 48 giờ có màu trong, mịn và nhay, nhưng sau khi ủ 72 giờ thì khuẩn lạc có màu trắng đục, Hình 2.1 là hình thái khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn Paraburkholderia caribensis được nhìn dưới kính hiển vi quang học. Hình ảnh hiên vi của vi khuan Paraburkholderia caribensis. (a) Hình vi thé; (b) Hình đại thé của vi khuân Paraburkholderia caribensis.

2 Contras De = set ty ZEISS, CC —Eaettness= 493% Mag= 400K xSpotSize=361 SystemVacuum=3E7eO035a Oate 9 Jun2023 Hình 2. Hình anh SEM của vi khuân Paraburkholderia caribensis. Phân bố của vi khuẩn Paraburkholderia caribensis Vi khuẩn Paraburkholderia caribensis là một loài không độc hại và có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiều môi trường khác nhau. Hiện tại, Paraburkholderia caribensis được biết đến và phân bồ rộng rãi trên khắp thế giới, từ Bắc Mỹ, châu Âu, châu Á và châu Phi.

Paraburkholderia caribensis cũng có thé sống trong các vùng nước dang rừng mưa và có thể chịu được sự ảnh hưởng của ánh sáng mặt trời. Điều này làm cho Paraburkholderia caribensis có thê sông trong nước nông, can, trong các dong nước chảy nhanh và có thể sống trong môi trường khắc nghiệt như môi trường nước mặn. Ngoài ra, Paraburkholderia caribensis cũng có vai trò quan trọng trong duy trì độ ổn định của hệ sinh thái đất và quá trình phát triển cây trồng (Coenye và ctv, 2001). Đặc điểm sinh hóa, sinh lý vi khuẩn Paraburkholderia caribensis Theo Achouak vào năm 1999, các tế bào vi khuẩn Burkholderia caribensis có khả năng tạo ra một lượng lớn chất polyme ngoại bao (EPS) chịu trách nhiệm cho sự tổng hợp đất, khi phát triển trên môi trường thạch tăng cường đường (2% glucose, xylose, fructose, sorbitol, arabinose, xylose, mannitol hoặc inositol).

Burkholderi caribensis ngoài việc tạo nốt san cho vật chủ ban dau, chủng cũng có thể tạo nốt sần cho các loài Mai dương khác, và tat cả các nốt san được tạo ra trên Mimosa pudica đều có các hoạt động và cau trúc nitrogenase (khử axetylen) điển hình của các cộng sinh cé định nitơ hiệu qua (Chen va ctv, 2005).Trong nghiên cứu của Delvasto và ctv vào năm 2009, Burkholderia caribensis khả năng loại bỏ phosphat từ quặng sắt ở Brazil (~0,2% trọng lượng P) là vi khuan dị đưỡng bản địa của quặng. Haloacetate như monochloroacetate (MCA) là chất độc và gây đột biến và có thể được tạo ra một cách tinh cờ trong quá trình khử trùng nước. Burkholderia caribensis MBA4 được phân lập từ đất vì khả năng sử dụng monochloroacetate. Vi khuẩn này tạo ra một haloacid dehalogenase cảm ứng có thê biến đổi monohaloacetate thành glycolate và thành glyoxylate bởi glycolate oxidase (Pan và ctv, 2014).

Năm 2013, Roy và ctv, đã phân lập được sáu dòng vi khuẩn Burkholderia từ đất và rễ lúa trồng ở vùng đất thấp nhiệt đới của Nam Assam, Ấn Độ. Trong số các dòng phân lập Burkholderia đã được xác định, SDSA-I10/1 cho thấy tiềm năng có định đạm cao hơn và Paraburkholderia caribensis đã được chọn dé giải trình tự 16 rDNA. SDSA- 110/1 phân lập cho thay sự tương đồng cao nhất với Burkholderia caribensis MWAP84 4 (Y17011) và do đó, được xác định là chủng Burkholderia caribensis. Việc cay chung này đã cải thiện đáng ké các thông số tăng trưởng và năng suất của lúa so với các cây đối chứng không được cấy, do đó chủng Burkholderia caribensis có thé được sử dung làm chế phẩm vi sinh vật ban địa dé thâm canh lúa ở vùng dat thấp nhiệt đới.

Vi khuẩn chi Burkholderia được phan lập từ rễ mía được chứng minh là có tác dụng kích thích tăng trưởng, quang hợp và hấp thu chất dinh dưỡng ở cây nhân giống vi mô và cây nhân giống bằng thân cây khi được bón phân thường xuyên và bỏ đói nitơ (Silveira va ctv, 2018). Một số chủng trong đó có chủng Burkholderia caribensis tạo ra axit indoleacetic, siderophores va hydro xyanua và là chất đối kháng với mầm bệnh mia (Schlemper và ctv, 2018; Silveira va ctv, 2018). Ngoài ra, theo thử nghiệm cua Leite và ctv năm 2021, vi khuẩn Paraburkholderia caribensis [AC/ BECa 88 giúp tăng khối lượng khô của chồi và rễ, đồng thời ảnh hưởng đến nồng độ và sự tích lũy các chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng quan trọng. Ngoài ra, vi khuân Paraburkholderia caribensis có thé sản xuất: Oxidase, catalase, urease, arginine dihydrolase và p - galactosidase.

Vào nam 2018, các thử nghiệm đồng hóa và hoạt động của enzyme được Choi và Im tiễn hành bằng cách sử dụng bộ kit API 20NE, API 32GN và API ZYM. Kết quả thấy rằng vi khuân Paraburkholderia caribensis có phản ứng sinh hóa như hoạt động oxy hóa, khử nitrat thành nitrit và phản ứng đồng hóa và enzym với axit hóa glucose, caprate, malate, propionate, vallerate, 2 — ketogluconate, lactate, esterase lipase (C8), 3 — hydroxy — benzoate, valine arylamidase, 2 — ketogluconate, Cystine arylamidase, cystine arylamidase, d — ribose, B — galactosidase. Va không phan ứng đồng hóa va enzym như acetate, sucrose, suberate, — glucosidase. Tong quan về quá trình cố định nito 2.

Vai trò của đạm đối với cây trồng Thông thường trong đất có 2 nguồn đạm dễ thu hút đối với cây trồng là đạm amoniac và nitrat. Nói chung, các dang đạm khoáng cây hút rất nhanh và chuyên thành những dạng đạm hữu cơ. Phân đạm là tên gọi chung của các loại phân đơn cung cấp chất lá có kích thước to, xanh, quang hợp mạnh và làm tăng năng suất cây trồng. Thiếu đạm cây trồng tăng trưởng còi cọc, đẻ nhánh kém, ít phát triển mầm non, phân cành ra lá đều kém, lá nhỏ.

Cây ra hoa kết quả muộn, ít hoa, ít quả, khả năng tích lũy chất có đạm, bột đường đều kém. Tuy nhiên, nếu bón đạm nhiều cho cây sẽ có tác dụng ngược lại: cây lớn nhanh, đẻ nhánh nhiều, lá phát triển quá mức, bộ rễ phát triển 5 kém, thân non mềm. Đó là hiện tượng “lếp cây”, cây dễ bị đồ, trồ chậm, chin chậm và không chắc hạt. Mặt khác bón nhiều đạm làm tăng mức độ nhiễm sâu bệnh do màu sắc xanh đậm của lá thu hút bướm, lá mềm sâu dễ đục, nắm bệnh, vi khuẩn dễ xâm nhập.

Một số loài vi khuẩn thuộc giống Azospirillum và Burkholderia có thé tông hợp đạm nhờ quá trình cố định nitơ sinh học với enzyme nitrogenase cắt nối ba của phân tử Na tạo ra NH3; tương tự như quá trình cố định nito công nghiệp nhưng không cần cung cấp năng lượng cho vi khuẩn. Vi khuẩn giống Azospirillum và Burkholderia có thé làm tăng năng suất trên 20% (Bashan và Levanony, 1990). Phân lập được 68 loài Rhizopus sp. cũng làm tăng năng suất rau diép lên 11% so với đôi chứng (Chabot va ctv, 1993).