Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lúa (Oryza sativa L., thuộc họ Hòa thảo Poaceae) là một trong năm loại cây lương thực chính, cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho hơn một nửa dân số thế giới, đặc biệt tại khu vực châu Á và châu Phi. Hạt lúa gạo có hàm lượng tinh bột cao, giàu protein và chứa các acid amin thiết yếu như Lysine, Threonine, Methionine và Tryptophan. Về mặt kinh tế, lúa gạo là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của nhiều quốc gia, đồng thời là nguyên liệu cho các ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi và công nghiệp chế biến cồn rượu.

Theo thống kê của FAO, sản lượng lúa thế giới năm 2011 đạt 724 triệu tấn trên diện tích gieo trồng 163,6 triệu ha. Tại Việt Nam, sản lượng lúa năm 2012 đạt 43,66 triệu tấn với diện tích canh tác 7,75 triệu ha và năng suất bình quân 5,63 tấn/ha. Mặc dù năng suất liên tục gia tăng, sản xuất lúa gạo vẫn đối mặt với nhiều áp lực lớn từ điều kiện khí hậu bất lợi, suy thoái thổ nhưỡng và đặc biệt là áp lực sâu bệnh hại làm suy giảm nghiêm trọng năng suất và phẩm chất nông sản.

Ứng dụng công nghệ sinh học và kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là hướng tiếp cận quan trọng nhằm cải thiện đặc tính chống chịu sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất lợi của cây lúa. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen gián tiếp ở lúa thực tế còn gặp nhiều hạn chế do tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo thấp, khả năng nhân nhanh và tái sinh cây còn hạn chế, đồng thời phụ thuộc chặt chẽ vào khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn A. tumefaciens, dẫn đến hiệu quả biến nạp gen ở nhiều nghiên cứu chỉ đạt khoảng 11%.

Đề tài "Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo và tiếp nhận gen gus của một số giống lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens" được thực hiện nhằm giải quyết các vấn đề kỹ thuật trên với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

Mục tiêu nghiên cứu:

  1. Xác định ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khoáng đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa.
  2. Xác định ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D và kinetin đến khả năng tạo mô sẹo.
  3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi mô sẹo và nồng độ Acetosyringone (AS) đến khả năng tiếp nhận gen chỉ thị gus thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

  1. Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của 2 loại môi trường khoáng cơ bản (N6 và MS) đến tỷ lệ tạo mô sẹo và chất lượng mô sẹo của 3 giống lúa.
  2. Đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D (0, 1, 2, 3 mg/l) đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo.
  3. Xác định tổ hợp nồng độ tối ưu giữa 2,4-D (2 mg/l) và kinetin (0; 0,1; 0,3; 0,5; 1,0 mg/l) trong môi trường cảm ứng mô sẹo.
  4. Đánh giá ảnh hưởng của độ tuổi mô sẹo (10, 14, 17, 20 ngày tuổi) đến tỷ lệ sống và tỷ lệ tiếp nhận gen gus.
  5. Xác định nồng độ Acetosyringone thích hợp (0, 20, 50, 100 mM/l) bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy nhằm tối ưu hóa hiệu quả biến nạp gen.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Ba giống lúa thuần và lúa lai phổ biến tại miền Bắc Việt Nam gồm Syn 6, Khang Dân và U17; chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang vector pCambia 3301.
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên.
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 12/2013 đến tháng 06/2014.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở khoa học về nuôi cấy mô tế bào thực vật và cơ chế biến nạp gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens:

  • Hệ thống vector và chủng vi khuẩn: Nghiên cứu sử dụng chủng vi khuẩn đất A. tumefaciens EHA105 mang plasmid chuyển gen pCambia 3301. Cấu trúc đoạn T-DNA của plasmid gồm: gen chọn lọc thực vật bar (mã hóa enzyme phosphinothricin acetyltransferase kháng thuốc trừ cỏ glufosinate), gen chọn lọc vi khuẩn kháng kanamycin, và gen chỉ thị gusA (mã hóa enzyme $\beta$-glucuronidase). Đoạn gen gusA có chứa một đoạn intron Catalase nhằm ngăn chặn sự biểu hiện của gen trong tế bào vi khuẩn, chỉ cho phép biểu hiện khi đã chuyển thành công vào nhân tế bào thực vật. Cả hai gen đều được điều khiển bởi promoter CaMV 35S và kết thúc bởi trình tự polyA của gen nopaline synthase (NOS polyA).
  • Cơ chế chuyển gen: Khi mô thực vật bị tổn thương kết hợp với sự hiện diện của hợp chất phenolic ngoại sinh (Acetosyringone), thụ thể VirA trên màng vi khuẩn nhận tín hiệu và hoạt hóa VirG. Protein VirG hoạt hóa phiên mã các operon virB, virC, virD, virE, giúp phức hợp VirD endonuclease cắt mạch đơn T-DNA tại hai trình tự biên (LB và RB), bảo vệ và vận chuyển T-DNA qua cầu nối VirB vào nhân tế bào chủ.
  • Hệ thống chỉ thị nhuộm màu GUS: Sự tiếp nhận và biểu hiện tạm thời của gen gusA được nhận biết thông qua phản ứng enzyme $\beta$-glucuronidase xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-$\beta$-D-Glucuronidase (X-gluc), tạo kết tủa màu xanh chàm (indigo) tại các vị trí mô sẹo tiếp nhận gen.
Hạt giống lúa chín bóc vỏ
Khử trùng bề mặt (Cồn 70% 2 phút + HgCl2 0,1% 10 phút)
Cảm ứng tạo mô sẹo trên môi trường N6 tối ưu (2,4-D + Kinetin, 25°C trong tối)
Đồng nuôi cấy mô sẹo với dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens (AAM-AS, 3 ngày, 25°C)
Nhuộm hóa mô với dung dịch X-gluc (ủ 48 giờ ở 37°C) & Tẩy diệp lục bằng Ethanol 96%
Đánh giá tỷ lệ và mức độ biểu hiện tạm thời của gen gus

Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý dữ liệu:

  • Các thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần lặp lại.
  • Đối với thí nghiệm cảm ứng mô sẹo: Mỗi công thức thực hiện trên 300 mẫu (100 mẫu/lần lặp lại, cấy 25 mẫu/đĩa petri).
  • Đối với thí nghiệm biến nạp và biểu hiện gen: Mỗi công thức tiến hành trên 60 mẫu biến nạp và lấy 40 mẫu nhuộm X-gluc.
  • Xử lý số liệu: Toàn bộ số liệu thực nghiệm được thu thập, xử lý thống kê mô tả trên Microsoft Excel 2003 và phân tích phương sai (ANOVA), so sánh sai khác trung bình bằng phép thử Duncan (LSD ở mức ý nghĩa $p < 0,05$) bằng phần mềm chuyên dụng IRRISTAT 4.0.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ vai trò của cây lúa trong an ninh lương thực, thực trạng các yếu tố sâu bệnh làm giảm năng suất lúa tại Việt Nam, và tiềm năng ứng dụng công nghệ chuyển gen. Đặt ra 3 mục tiêu, 4 nhóm yêu cầu kỹ thuật và làm rõ ý nghĩa khoa học - thực tiễn của đề tài trong việc hoàn thiện quy trình cảm ứng mô sẹo và tiếp nhận gen phục vụ nghiên cứu chọn tạo giống lúa chuyển gen.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Tổng hợp toàn diện các cơ sở lý luận và tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước:

  • Khái quát nguồn gốc, phân loại thực vật chi Oryza (gồm 23 loài, 3 loài phụ: Indica, Japonica, Javanica), đặc điểm sinh thái các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, hạt và giá trị dinh dưỡng, thương mại của cây lúa.
  • Đặc điểm sinh học của vi khuẩn A. tumefaciens, cấu trúc Ti-plasmid, cơ chế hoạt hóa các gen vùng vir, chức năng của T-DNA và vai trò của các gen chỉ thị (gusA, bar).
  • So sánh các phương pháp chuyển gen trực tiếp ở lúa (vi tiêm, xung điện tế bào trần, ống phấn, súng bắn gen) với phương pháp biến nạp gián tiếp qua Agrobacterium.
  • Thống kê tình hình sản xuất lúa gạo thế giới và Việt Nam giai đoạn 2004–2012; tổng quan các thành tựu chuyển gen trên cây lúa (chuyển gen kháng sâu Cry1Ab, Cry1Ac, gen kháng bệnh bạc lá Xa21, gen sản xuất kháng thể MucoRice-ARP1).

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Quy định chi tiết vật liệu thực vật (Syn 6, Khang Dân, U17), chủng vi khuẩn (A. tumefaciens EHA105 mang pCambia 3301), hóa chất môi trường (khoáng MS, N6, 2,4-D, kinetin, AS, X-gluc, kháng sinh chọn lọc), trang thiết bị phòng thí nghiệm. Thiết lập quy trình chuẩn bị mẫu, quy trình khử trùng hạt bằng cồn $70^\circ$ và $\text{HgCl}_2$ 0,1%, quy trình đồng nuôi cấy mô sẹo và phương pháp nhuộm hóa mô X-gluc. Xây dựng 5 công thức thí nghiệm tương ứng với 5 nội dung nghiên cứu.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm, hình ảnh minh chứng và thảo luận so sánh với các công bố quốc tế:

  • Thí nghiệm 1: So sánh môi trường N6 và MS. Môi trường N6 cho kết quả cảm ứng mô sẹo vượt trội ở cả 3 giống (Khang Dân đạt 35,3%; Syn 6 đạt 29,6%; U17 đạt 14,3%) so với môi trường MS (lần lượt đạt 15,6%; 13,3%; 8,3%). Trên môi trường N6, mô sẹo to, màu vàng sáng, độ đồng đều cao; trong khi môi trường MS kích thích mầm kéo dài nhưng mô sẹo nhỏ, màu vàng nhạt.
  • Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ 2,4-D (0, 1, 2, 3 mg/l) trên nền N6. Nồng độ 2 mg/l cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất ở cả 3 giống: Syn 6 (57,0%), Khang Dân (56,3%), U17 (53,0%). Khi tăng nồng độ lên 3 mg/l, mô sẹo chuyển sang màu vàng nâu và chất lượng suy giảm.
  • Thí nghiệm 3: Kết hợp 2,4-D (2 mg/l) với kinetin (0; 0,1; 0,3; 0,5; 1,0 mg/l). Nồng độ kinetin 0,5 mg/l giúp tăng tỷ lệ tạo mô sẹo và cải thiện cấu trúc mô (mô đặc, không bị xốp bở), đạt tỷ lệ: U17 (73,3%), Syn 6 (70,0%), Khang Dân (69,0%).
  • Thí nghiệm 4: Đánh giá độ tuổi mô sẹo (10, 14, 17, 20 ngày tuổi). Mô sẹo 17 ngày tuổi cho tỷ lệ tiếp nhận gen và nhuộm GUS dương tính cao nhất (Syn 6: 24,2%; U17: 23,3%; Khang Dân: 21,6%) với mức độ biểu hiện màu xanh chàm đậm và diện tích rộng (+++).
  • Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ Acetosyringone (0, 20, 50, 100 mM/l). Bổ sung 50 mM/l AS vào môi trường đồng nuôi cấy nâng cao rõ rệt hiệu quả biến nạp tạm thời: Syn 6 đạt 45,0%, U17 đạt 41,7%, Khang Dân đạt 36,7% mô sẹo biểu hiện GUS+ ở mức độ mạnh (+++).

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Đúc kết các thông số kỹ thuật tối ưu đã được chứng minh qua thực nghiệm và đề xuất các định hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao hiệu quả tái sinh cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chuyển gen.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã xác định được hệ thống thông số tối ưu cho quy trình tạo mô sẹo và biến nạp tạm thời gen chỉ thị gusA vào phôi hạt chín của 3 giống lúa miền Bắc Việt Nam:

Chỉ tiêu / Yếu tố khảo sát Giống Syn 6 Giống Khang Dân Giống U17 Kết luận & Đánh giá
Môi trường khoáng tối ưu N6 (29,6%) N6 (35,3%) N6 (14,3%) Môi trường N6 vượt trội hơn MS về tỷ lệ và chất lượng mô sẹo
Nồng độ 2,4-D tối ưu 2,0 mg/l (57,0%) 2,0 mg/l (56,3%) 2,0 mg/l (53,0%) Nồng độ 2,0 mg/l cho mô sẹo to, vàng sáng, đồng đều
Tổ hợp 2,4-D (2 mg/l) + Kinetin Kinetin 0,5 mg/l (70,0%) Kinetin 0,5 mg/l (69,0%) Kinetin 0,5 mg/l (73,3%) Kinetin 0,5 mg/l giúp giảm độ xốp bở, tăng mật độ mô sẹo tốt
Độ tuổi mô sẹo biến nạp 17 ngày tuổi (24,2% GUS+) 17 ngày tuổi (21,6% GUS+) 17 ngày tuổi (23,3% GUS+) Mô sẹo 17 ngày cho hoạt lực phân chia cao và khả năng nhiễm vi khuẩn tối ưu
Nồng độ Acetosyringone (AS) 50 mM/l (45,0% GUS+) 50 mM/l (36,7% GUS+) 50 mM/l (41,7% GUS+) Nồng độ 50 mM/l kích hoạt mạnh mẽ các gen vir, nâng cao tỷ lệ GUS+

Giải pháp và thông số kỹ thuật đề xuất:

  1. Khử trùng hạt chín bằng cồn $70^\circ$ trong 2 phút, tiếp nối bằng dung dịch $\text{HgCl}_2$ 0,1% trong 10 phút.
  2. Cảm ứng mô sẹo trên nền môi trường N6 bổ sung 2,0 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l kinetin, nuôi cấy ở $25^\circ\text{C}$ trong điều kiện tối.
  3. Sử dụng mô sẹo 17 ngày tuổi để tiến hành lây nhiễm với huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang vector pCambia 3301 ($\text{OD}_{600} = 0,7 - 1,0$).
  4. Đồng nuôi cấy trên môi trường AAM bổ sung 50 mM/l Acetosyringone trong 3 ngày tại nhiệt độ $25^\circ\text{C}$.

Đóng góp của khóa luận:

  • Xác lập quy trình cảm ứng mô sẹo và biến nạp gen tạm thời phù hợp với điều kiện trang thiết bị của phòng thí nghiệm trong nước.
  • Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm so sánh phản ứng mô sẹo và hiệu quả biến nạp giữa 3 giống lúa có nguồn gốc di truyền khác nhau (Syn 6, Khang Dân, U17), làm tiền đề cho việc ứng dụng công nghệ chuyển gen trên các giống lúa thuần và lúa lai tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Nghiên cứu mới dừng lại ở phạm vi đánh giá sự biểu hiện tạm thời (transient expression) của gen chỉ thị gusA thông qua phản ứng nhuộm màu hóa mô sau 3 ngày đồng nuôi cấy.
  • Chưa thực hiện giai đoạn chọn lọc mô sẹo trên môi trường chứa chất kháng sinh chọn lọc hoặc thuốc diệt cỏ (đối với gen bar), chưa tiến hành tái sinh mô sẹo thành cây lúa hoàn chỉnh ($R_0$) và chưa kiểm tra sự tích hợp ổn định của gen vào hệ gen cây lúa bằng các kỹ thuật sinh học phân tử chuyên sâu (như PCR hay Southern Blot).

Hướng nghiên cứu tiếp theo (theo đề nghị của tác giả):

  • Tiếp tục thực hiện các thí nghiệm tối ưu hóa môi trường tái sinh chồi và ra rễ nhằm tạo cây lúa chuyển gen hoàn chỉnh từ các mô sẹo đã tiếp nhận gen.
  • Mở rộng nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lý - hóa khác (thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy, mật độ quang của dịch vi khuẩn) nhằm tiếp tục nâng cao hiệu quả biến nạp gen.
  • Ứng dụng quy trình biến nạp tối ưu để chuyển các gen chức năng có ý nghĩa nông học (gen kháng bệnh bạc lá, kháng sâu, chống chịu hạn, mặn) vào các giống lúa sản xuất tại Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng và mục đích nghiên cứu sau:

  • Sinh viên, học viên và nghiên cứu sinh ngành Công nghệ sinh học, Nông học, Di truyền và Chọn giống cây trồng: Tham khảo cách thức thiết kế thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, quy trình bố trí thí nghiệm cảm ứng mô sẹo từ hạt lúa, và kỹ thuật chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium.
  • Cán bộ nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và chuyển gen thực vật: Sử dụng trực tiếp công thức môi trường cảm ứng mô sẹo (nền N6 kết hợp 2,4-D 2 mg/l và Kinetin 0,5 mg/l) cùng thông số đồng nuôi cấy (50 mM/l AS, mô sẹo 17 ngày tuổi) làm quy trình chuẩn cho các thí nghiệm biến nạp gen trên các giống lúa thuần và lúa lai tương đương.
  • Nghiên cứu sinh học phân tử thực vật: Tham khảo phương pháp đánh giá biểu hiện tạm thời của gen chỉ thị gusA thông qua kỹ thuật nhuộm X-gluc và cách thức xử lý số liệu thống kê sinh học bằng phần mềm IRRISTAT.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao môi trường N6 cho hiệu quả tạo mô sẹo ở các giống lúa tốt hơn môi trường MS?
Trong thí nghiệm 1, môi trường N6 đạt tỷ lệ tạo mô sẹo cao hơn rõ rệt so với MS ở cả 3 giống (Khang Dân: 35,3% so với 15,6%; Syn 6: 29,6% so với 13,3%; U17: 14,3% so với 8,3%). Nguyên nhân là do thành phần khoáng và tỷ lệ đạm trong môi trường N6 phù hợp hơn cho quá trình phản phân hóa của tế bào phôi hạt lúa họ Hòa thảo, giúp mô sẹo phát triển to, màu vàng và đặc; trong khi môi trường MS kích thích sự kéo dài của mầm hạt nhưng làm giảm số lượng và chất lượng mô sẹo.

2. Nồng độ 2,4-D và kinetin tối ưu để tạo mô sẹo chất lượng cao là bao nhiêu?
Kết quả từ thí nghiệm 2 và 3 chỉ ra rằng nồng độ 2,4-D 2,0 mg/l kết hợp với kinetin 0,5 mg/l là tổ hợp tối ưu nhất. Tổ hợp này giúp tỷ lệ tạo mô sẹo đạt đỉnh ở cả 3 giống: U17 đạt 73,3%, Syn 6 đạt 70,0% và Khang Dân đạt 69,0%. Việc bổ sung kinetin 0,5 mg/l giúp khắc phục tình trạng mô sẹo bị bở xốp, tạo ra khối mô sẹo đặc, có màu vàng sáng và kích thước đồng đều.

3. Độ tuổi mô sẹo nào thích hợp nhất để tiến hành lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens?
Mô sẹo 17 ngày tuổi là độ tuổi tối ưu nhất để chuyển gen. Ở độ tuổi này, tỷ lệ mô sẹo biểu hiện gen gus dương tính (GUS+) đạt mức cao nhất ở cả 3 giống (Syn 6: 24,2%; U17: 23,3%; Khang Dân: 21,6%) với mức độ nhuộm màu xanh chàm đậm (+++). Mô sẹo quá non (10 ngày tuổi) có tỷ lệ tiếp nhận gen thấp (6,7–7,5%), trong khi mô sẹo già (20 ngày tuổi) bắt đầu có hiện tượng suy giảm khả năng phân chia và tiếp nhận gen (10,0–16,7%).

4. Vai trò và nồng độ tối ưu của Acetosyringone (AS) trong quy trình chuyển gen là gì?
Acetosyringone đóng vai trò là chất phenolic cảm ứng, liên kết với thụ thể VirA để hoạt hóa hệ thống gen vùng vir của vi khuẩn A. tumefaciens, giúp kích hoạt quá trình cắt và chuyển T-DNA vào tế bào thực vật. Nồng độ AS tối ưu được xác định là 50 mM/l trong môi trường đồng nuôi cấy, giúp nâng cao tỷ lệ mô sẹo GUS+ lên 45,0% (Syn 6), 41,7% (U17) và 36,7% (Khang Dân), vượt trội hơn hẳn so với công thức đối chứng không bổ sung AS (chỉ đạt 21,6–24,2%).

5. Vector pCambia 3301 mang những đặc điểm cấu trúc nào phục vụ cho việc chọn lọc và nhận biết cây chuyển gen?
Vector pCambia 3301 mang đoạn T-DNA gồm gen chọn lọc thực vật bar (kháng thuốc diệt cỏ phosphinothricin/glufosinate) và gen chỉ thị gusA mã hóa enzyme $\beta$-glucuronidase. Gen gusA được thiết kế đặc biệt với một đoạn intron Catalase nằm giữa hai exon nhằm ngăn cản sự biểu hiện enzyme trong tế bào vi khuẩn Agrobacterium, đảm bảo chỉ thị màu xanh chàm khi nhuộm X-gluc chỉ xuất hiện khi gen đã chuyển thành công vào nhân tế bào thực vật.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lâm Thị Mạnh đã nghiên cứu và tối ưu hóa thành công các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo mô sẹo và tiếp nhận gen gus ở 3 giống lúa Syn 6, Khang Dân và U17 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105. Kết quả thực nghiệm đã xác định môi trường N6 bổ sung 2,0 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l kinetin cho tỷ lệ tạo mô sẹo chất lượng cao cao nhất, đồng thời xác lập điều kiện biến nạp tối ưu bằng cách sử dụng mô sẹo 17 ngày tuổi kết hợp bổ sung 50 mM/l Acetosyringone trong giai đoạn đồng nuôi cấy. Đây là công trình thực nghiệm có giá trị thực tiễn, cung cấp các dẫn liệu kỹ thuật quan trọng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về tái sinh và chọn tạo giống lúa chuyển gen tại Việt Nam.