CHƯƠNG I.1 Cây dừa cạn Catharanthus roseus Giống Catharanthus (thuộc họ Trúc đào Apocynaceae) gồm có 8 loài, hầu hết là cây thân thảo lâu năm. Trong số đó chỉ có loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ Madagascar. Số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài thuộc Catharanthus đều là 2n = 16. Tám loài thuộc giống này gồm: Catharanthus coriaceus Markgr.
Catharanthus lanceus (Bojer ex A. Catharanthus longifolius (Pichon) Pichon. Catharanthus ovalis Markgr. Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon.
Catharanthus trichophyllus (Baker) pichon. Madagascar Những loài thuộc giống Catharanthus có nguồn gốc từ Madagascar thường được trồng để làm cảnh, được biết đến nhiều nhất là loài Madagascar Periwinkle hay còn gọi là Vinca nhờ vào khả năng chịu hạn và chịu nóng của nó. Ngoài việc được biết đến như một loại cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid từ Catharanthus roseus đã được sử dụng trong y học dân gian như một loại thuốc chống đái tháo đường, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau lành, chống viêm mắt, làm se da…. và ngày nay người ta còn tìm ra được một công dụng hết sức quan trọng của loài Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thư và chứng cao huyết áp rất hiệu quả.1 Phân loại Giới: Thực vật Phân giới: Tracheobionta – cây có mạch Ngành: Magnoliophyta – cây có hoa Lớp: Magnoliopsida – cây 2 lá mầm Phân lớp: Asteridae Bộ: Gentianales Họ: Apocynaceae – họ trúc đào 3 Luận văn thạc sĩ Chi: Catharanthus G.
Don – periwinkle Loài: Catharanthus roseus (L.2 Đặc điểm thực vật Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 - 60 cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Mọc thành bụi. Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, cuống lá hẹp nhọn, dài 4 – 6 cm, rộng 2 - 3 cm, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt. Hoa trắng hoặc hồng, có mùi thơm, mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn.
Quả dài 2 – 4 cm, rộng 2 – 3 mm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các chấm nổi thành đường chạy dọc. Mùa hoa quả gần như quanh năm.1: Hạt của cây dừa cạn [3] Hình 1.2 : Cây dừa cạn [4] 1. Cành đang nở hoa; 2. Hạt 4 Luận văn thạc sĩ 1.3 Phân bố Chi Catharanthus L.
Don có nguồn gốc ở Madagascar. Loài dừa cạn được di nhập sang nhiều nước nhiệt đới ở Nam Á cũng như Đông Nam Á trong đó có Việt Nam và đảo Hải Nam Trung Quốc. Vào giữa thế kỷ 18, dừa cạn được trồng ở Paris, sau đó có mặt ở nhiều vườn thực vật khác ở Châu Âu. Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú Yên.
Ngoài ra còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn mọc trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Dừa cạn còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc.4 Phân loại Catharanthus roseus (L. là nguồn thực vật giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid terpenoid indole gồm 3 giống cây khác nhau: ‘roseus’ với hoa màu tím hoặc hồng.
‘albus’ với hoa màu trắng. ‘ocellatus’ với hoa màu trắng nhụy đỏ. Trong đó hoa màu đỏ tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất.3: Các phân loài Catharanthus roseus [3] 5 Luận văn thạc sĩ 1.5 Một số công dụng dược lý Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, thân và lá được phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, săn da, chữa bệnh ngoài da Ở Nam Châu Phi, Ấn Độ, châu Úc, quần đảo Antilles người dân dùng trị bệnh đái tháo đường. Có nơi dùng chữa tiêu hóa kém và lỵ.
Nhờ thực nghiệm trên chuột mà các nhà khoa học Canada đã phát hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất chiết tách được từ dừa cạn dẫn đến sự phát hiện vincaleucoblastin và các alkaloid khác có tác dụng chống u là vinblastine và vincristine. [2] Ngoài ra, người ta còn phát hiện ra tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthin, vindolinin và vindolidin. Những thí nghiệm trên người bệnh được bắt đầu vào những năm 1960 ở Mỹ, Pháp và một số nước khác, tuy nhiên vẫn còn có nhiều ý kiến khác nhau. Mặc dù vậy, vì hiện nay chưa có loại thuốc nào khác tốt hơn nên nhu cầu về dừa cạn vẫn cứ tăng lên.
Bên cạnh nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về vinblastine và vincristine trên cây dừa cạn, ajmalicine được thu từ rễ đang được quan tâm bởi khả năng điều trị cao huyết áp, thiếu máu tuần hoàn não ở người cao tuổi, người hoạt động trí não thường xuyên.6 Một số hợp chất alkaloid trong Catharanthus C. roseus đã thu được rất nhiều sự quan tâm từ ngành công nghiệp dược phẩm, với khoảng 130 loại alkaloid hữu ích đã được phát hiện [5]. Trong đó chiếm nhiều nhất là hai loại alkaloid vinblastine (vincaleukoblastine) và vincristine (leurocristine). Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37 – 1,15 %, thân 0,40 %, rễ chính 0,7 – 2,4 %, rễ phụ 0,9 – 3,7 %, hoa 0,14 – 0,84 %, vỏ quả 1,14 %, hạt 0,18 %.
Trong số đó, đặc biệt chú ý là nhóm 20 alkaloid dimeric, là những nhóm có hoạt tính chống ung thư, bao gồm vincristine và vinblastine. Vinblastine có ở lá với hàm lượng 0,013 – 0,063 %, ở bộ phận trên mặt đất 0,0015 %, ở rễ 0,23 %. Nếu cây bị bệnh asteryllow-virus thì sẽ không có vinblastine. Vincristine có hàm lượng thấp hơn 0,0003 - 0,0015 %.
6 Luận văn thạc sĩ Lá dừa cạn thu thập ở nhiều địa phương khác nhau chứa 0,7 – 1,2 % alkaloid toàn phần, cao nhất ở Phú Yên (1,21 – 1,62 %). Vinblastine có với hàm lượng 1,6 - 2 phần vạn ở lá. Thời gian thu hái nguyên liệu thích hợp để cây có hàm lượng hoạt chất cao là cuối tháng 8 đến giữa tháng 9 dương lịch. Hàm lượng alkaloid toàn phần ở cây dừa cạn hoang dại thu thập ở Phú Yên cao nhất là 0,892 – 0,982 % ở lá và 1,38 – 1,445 % ở rễ vào mùa khô.
[2] Mai Ngọc Tâm và cs (1997) đã chứng minh rễ dừa cạn ở vùng Nha Trang chứa ajmalicine 0,18 %, serpentine 0,27 %, tetrahydroalstonine, tabersonine, lochnericine, catharanthine và akuamine. Nhiều tác giả khác (Phạm Thanh Kỳ và cs., 1995; Trần Văn Thanh và cs., 1996 và 1999) đã chiết xuất được ajmalicine từ rễ dừa cạn. Trần Văn Thanh và cs., (1996 và 1999) đã chiết xuất alkaloid toàn phần từ rễ, làm giàu ajmalicine bằng phương pháp hydro hóa serpentine, sau đó mới chiết xuất ajmalicine, tạo hiệu suất chiết xuất cao hơn gấp 2 lần. Những alkaloid này chỉ tồn tại một lượng nhỏ ở cây (ví dụ vincristine thu được từ cây nguyên vẹn chỉ đạt hiệu suất 0,0002 %), vì vậy nếu muốn sản xuất thuốc phải cần có một lượng lớn nguyên liệu thô để trích ly.4: Công thức hóa học một số hợp chất nhóm alkaloid [8] 7 Luận văn thạc sĩ 1.1 Vinblastine và Vincristine Vinblastine có tên thương mại là Velbe®, Velban®, Vinblastine®… được dùng riêng lẻ hoặc kết hợp với các thuốc chống ung thư khác trong quá trình điều trị bệnh Hodgkin, ung thư hệ bạch huyết, ung thư mô tinh hoàn, ung thư dạ con, ung thư biểu mô vú … tuy nhiên, sử dụng vinblastine có tác dụng phụ là phá hủy tủy xương.
Vincristine có tên thương mại là Oncovin®, Vincasar®, Vincrisul®, Kyocristine®, được dùng như một nhân tố kết hợp trong liệu pháp điều trị bệnh Hodgkin, ung thư hệ bạch huyết … vincristine ít có tính độc đối với huyết học nhưng có gây độc hệ thần kinh trung ương.2 Ajmalicine Ajmalicine, còn được gọi là δ-Yohimbine hoặc raubasine được tìm thấy trong nhiều loại cây trồng như Rauwolfia spp., Catharanthus roseus… ajmalicine được tổng hợp thông qua con đường shikimate với các tiền chất pyruvate và glyceraldehyd-3- phosphate (hình 1.5) 8 Luận văn thạc sĩ Hình 1.5: Con đường tổng hợp ajmalicine [9, 10, 11] Ajmalicine được sử dụng kết hợp với một vài hợp chất thuộc nhóm rauwolfia alkaloid để chống lại bệnh cao huyết áp, suy giảm trí nhớ, thiểu năng tuần hoàn não và làm giảm nguy cơ đột quỵ. Khi căng thẳng, cơ thể sẽ tiết noradrenaline, liên kết với thụ thể trên mạch máu, làm mạch co thắt mạnh dẫn đến tăng huyết áp. Ajmalicine ức chế chọn lọc đối với thụ thể α1-adrenergic và làm ngắt quãng tín hiệu từ thụ thể này, điều hòa hoạt động điều khiển sản xuất ion calci gây co cơ làm tăng huyết áp của adrenaline và noradrenalin. Do đó, ajmalicine được biết với tác dụng dược lý là làm hạ huyết áp (hình 1.
Các sản phẩm dược có thành phần từ ajmalicine hay còn gọi là raubasine kết hợp với almitrine mesylate – một dẫn xuất của almitrine có mặt trên thị trường Việt Nam là Dumazil, Duxil, Pyducil và Pymeducil. 9 Luận văn thạc sĩ Hình 1.6 : Cơ chế tăng huyết áp bằng sự gây co cơ trơn của adrenalin và noradrenalin [12] 1.2 Những thành tựu về thu nhận alkaloid từ kỹ thuật nuôi cấy tế bào và cơ quan C. roseus in vitro 1.1 Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo được biết đến như một hệ thống tế bào có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp (HCTC), nhưng trong một số trường hợp các sản phẩm bậc hai không thể được tổng hợp trong mô sẹo do sử dụng mẫu cấy không phù hợp. [13] Năm 1987, Miura và cộng sự đã thu nhận thành công vinblastine trong mô sẹo hình thành từ lá non C.
Ngoài vinblastine, còn có những nghiên cứu khác để thu nhận ajmalicine, alsotonine, serpentine,…[14] Năm 2010, Chinnamadasamy Kalidass và cs. nuôi cấy mô sẹo Catharanthus roseus nhằm mục đích thu vincristine. Các tác giả nuôi mẫu cấy trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng là auxin, cytokinin và quan sát hiệu quả tích lũy vincristine. Môi trường bổ sung 2,4-D 1,0 mM, kinetin 1,0 mM được sử dụng để hỗ trợ sự tăng trưởng của mô sẹo.
Sinh khối khô lớn nhất thu được sau 7 tuần nuôi cấy. 10 Luận văn thạc sĩ Các tác giả cũng ghi nhận được NAA và kinetin đóng một vai trò quan trọng trong sự sinh tổng hợp vincristine. [15] Ashutosh và cs.