HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY LAN HUỆ (Hippeastrum sp.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LÁT MỎNG TẾ BÀO” Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Yến MSV : 637194 Lớp : K63CNSHB Giảng viên hướng dẫn : PGS.Nguyễn Thanh Hải HÀ NỘI – 03/2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng quy trình vi nhân giống Lan Huệ bằng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào” là kết quả quá trình nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của PGS.Nguyễn Thanh Hải. Các số liệu nghiên cứu trung thực, không sao chép kết quả của bất kì khóa luận nào trước đó. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Yến i LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng quy trình nhân giống Lan Huệ bằng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào” là cột mốc quan trọng nhất trong những tháng năm sinh viên của tôi. Để có thể bắt đầu thực hiện và hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám đốc Học viện, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể thầy cô giáo đã tận tình dạy bảo, truyền đạt những kiến thức quan trọng và quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập nghiên cứu và cho đến khi thực hiện đề tài này. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.Nguyễn Thanh Hải đã dành nhiều thời gian, công sức để trực tiếp hướng dẫn và chia sẻ kinh nghiệm để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến gia đình, người thân và những người bạn đã luôn sát cánh, động viên, ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Trong quá trình nghiên cứu không tránh khỏi thiếu sót và hạn chế, kính mong nhận được sự góp ý của quý thầy (cô) để đề tài được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Yến ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC BẢNG. v DANH MỤC HÌNH ẢNH.
vi DANH MỤC VIẾT TẮT. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Giới thiệu chung về cây Lan Huệ. Hệ thống phân loại thực vật.
Đặc điểm thực vật của cây Lan Huệ. Điều kiện ngoại cảnh. Một số nghiên cứu về nhân giống vô tính cây Lan Huệ. Khái quát về vi nhân giống.
Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô. Các bước nhân giống in vitro. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan Huệ. Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào.
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng, địa điểm, vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Các phương pháp nghiên cứu.
Các chỉ tiêu theo dõi. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Nội dung 1: Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ presept tới hiệu quả khử trùng mẫu củ Lan Huệ.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tới hiệu quả khử trùng củ Lan Huệ. Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ của cây Lan huệ. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ Lan Huệ. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ lan huệ.
Ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ lan huệ. Nội dung 3: Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của IBA tới quá trình tạo cây Lan Huệ in vitro hoàn chỉnh. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của α- NAA tới quá trình tạo cây Lan Huệ in vitro hoàn chỉnh.
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng than hoạt tính tới quá trình tạo cây Lan Huệ in vitro hoàn chỉnh. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 40 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 4.
Ảnh hưởng của nồng độ presept tới hiệu quả khử trùng mẫu củ Lan Huệ sau 6 tuần theo dõi. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tới hiệu quả khử trùng cây Lan Huệ. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ Lan Huệ sau 8 tuần. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ Lan Huệ sau 8 tuần.
Ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ Lan Huệ sau 8 tuần. Ảnh hưởng của IBA tới quá trình tạo cây Lan Huệ in vitro hoàn chỉnh sau 4 tuần. Ảnh hưởng của α- NAA tới quá trình tạo cây Lan Huệ in vitro hoàn chỉnh sau 4 tuần. Cây Lan Huệ hoàn chỉnh sau 4 tuần trên các môi trường bổ sung α- NAA.
Ảnh hưởng của than hoạt tính tới quá trình tạo cây Lan Huệ in vitro hoàn chỉnh sau 3 tuần. 37 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 4.1 Mẫu lan huệ in vitro phát triển tốt chuẩn bị cho các thì nghiệm tiếp theo. Hình ảnh mẫu lát mỏng tế bào Lan Huệ bổ sung 2,4 D sau 8 tuần. Hình ảnh mẫu nuôi cấy lát mỏng tế bào bổ sung BAP sau 8 tuần.
Hình ảnh mẫu nuôi cấy lát mỏng tế bào bổ sung TDZ sau 8 tuần. Cây Lan Huệ hoàn chỉnh sau 4 tuần trên các môi trường bổ sung IBA. Cây Lan Huệ hoàn chỉnh sau 4 tuần trên các môi trường bổ sung than hoạt tính. 38 vi DANH MỤC VIẾT TẮT BAP : Benzyl-amino-purine CT : Công thức CV (%) : Sai số thí ngiệm ĐC : Đối chứng MS : Môi trường Murashige and Sknoog α- NAA : α-naphtalene acetic acid IBA : Indole-3 butyric acid TDZ : Thidiaruzon NL : Nhắc lại TN : Thí nghiệm vii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Xây dựng quy trình vi nhân giống Lan Huệ (Hippeastrum sp.) bằng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào” với mục đích bước đầu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Lan Huệ, sử dụng phương pháp nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật để tiến hành.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, tối thiểu 30 mẫu/công thức, các chỉ tiêu được quan sát và đo đếm hàng tuần. Sau quá trình nghiên cứu thu được kết quả như sau: Nồng độ chất khử trùng Presept tốt nhất cho bước khử trùng mẫu là 0,75%. Bên cạnh đó, thời gian khử trùng tốt nhất là 15 phút. Môi trường MS bổ sung TDZ với nồng độ 1,5 mg/l có tác động tốt nhất đến khả năng nhân nhanh chồi.
Môi trường bổ sung than hoạt tính với nồng độ 1 mg/l là môi trường tối ưu cho việc ra rễ. Cây hoa Lan huệ (Hippeastrum sp.) có nguồn gốc từ Nam Mỹ nên có khả năng thích ứng với nhiều vùng sinh thái ở Việt Nam (Nguyễn Thị Đỏ, 2007; Phạm Hoàng Hộ, 2000). Kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Minh Phượng và cộng sự (2014), Trịnh Thị Mai Dung và cộng sự (2015) cho thấy chủng loại giống Lan huệ hiện phổ biến trồng làm cảnh tại các tỉnh/thành phố trên cả nước là 11 loại với nhiều màu sắc, hình dáng khác nhau và thuộc nhóm hoa cánh đơn. Những năm gần đây, cây hoa Lan huệ đã nhận được nhiều sự quan tâm của người chơi hoa và nhà nghiên cứu ở trong và ngoài nước.
Màu sắc, hình dạng và chủng loại Lan huệ trên thị trường ngày càng đa dạng, tuy nhiên nguồn cung cấp giống còn hạn chế, giá giống mới ngoại nhập cao nên thị trường hoa Lan huệ chưa được phát triển như mong đợi và chưa đáp ứng được nhu cầu của người chơi hoa. Để làm phong phú tập đoàn Lan huệ Việt Nam, một số nghiên cứu lai tạo giống đã được công bố như các kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Minh Phượng và cộng sự (2014), Nguyễn Hạnh Hoa và cộng sự (2014), Phạm Thị Minh Phượng (2016). Tuy nhiên, các nghiên cứu trên chủ yếu tạo ra các dòng lai Lan huệ cánh đơn (hoa 6 cánh) trong khi đó, trên thị trường dạng hoa bán kép hoặc cánh kép với số cánh >6 đang được người chơi hoa ưa chuộng, giá bán củ giống hoa Lan huệ cánh kép thường cao hơn so với các giống hoa cánh đơn. Trên thế giới, Lan huệ cánh kép được thương mại hóa từ đầu những năm 1990.
Đến đầu thế kỷ XXI chỉ có khoảng 30 giống Lan huệ cánh kép được thương mại ở một số quốc gia như Úc, Hà Lan, Nhật Bản, Mỹ và Nam Mỹ (Read, 2005). Xu hướng lai tạo hoa Lan huệ cánh kép của mỗi khu vực rất khác nhau. Tại Hà Lan và Úc, hoa cánh kép được lai tạo có kích thước hoa lớn, ngồng hoa cao, cánh hoa dày còn ở Nhật Bản hoa thường nhỏ và thấp cây (Read, 2005). Gần đây, Ming-Chung Liu và Der-Ming Yeh (2015) đã tạo được giống hoa Lan huệ cánh kép có hương thơm đặt tên “T.1- Pink Pearl” bằng 1 phương pháp lai thông qua thụ phấn in vitro tại Đài Loan.
Để có thể tạo ra các giống Lan huệ cánh kép từ nguồn gen hoa Lan huệ trong nước đáp ứng nhu cầu của người chơi hoa thì việc nghiên cứu lai tạo giống hoa Lan huệ cánh kép Việt Nam là thực sự cần thiết. Xây dựng quy trình để nâng cao hiệu quả trong vi nhân giống Lan Huệ bằng kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào. Xác định được thời gian khử trùng và nồng độ chất khử trùng trong gian đoạn tạo vật liệu ban đầu. Xác định được môi trường nhân nhanh thích hợp cho hệ số nhân in vitro chồi Lan Huệ.
Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới sự tạo rễ của chồi Lan Huệ. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về cây Lan Huệ. Các loài Lan Huệ (Hippeastrum) có nguồn gốc tập trung nhiều nhất ở hai trung tâm đa dạng loài (centre of diversity), một ở miền đông Brazil và một còn lại ở trung tâm miền nam Andes thuộc Peru, Bolivia và Argentina, tại sườn đông gần foothill.
Vài loài sống xa lên phía bắc tại Mexico và miền tây Đông Ấn. Chi này được cho là có gốc ở Brazil, nơi ít nhất 34 được phát hiện. Môi trường sống chủ yếu là nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nhiều loài sống ở các tầng cây thấp, trong khi nhiều loài lại ưa nắng.
Hippeastrum angustifolium là ví dụ cho loài thích vùng lũ. Cũng có các loài thực vật biểu sinh như Hippeastrum aulicum, Hippeastrum calyptratum, Hippeastrum papilio và Hippeastrum arboricola thuộc chi Omphalissa. Hệ thống phân loại thực vật. Đặc điểm thực vật của cây Lan Huệ.