CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VI NHÂN GIỐNG 1. Khái niệm vi nhân giống Vi nhân giống là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận khác nhau của thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng thực vật, đường và chất làm đông. Trong mấy thập kỷ qua, vi nhân giống đã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới, được ứng dụng trong sản xuất thương mại, đồng thời có thể duy trì và bảo quản được nhiều giống cây quí hiếm hoặc phục tráng giống [19].
Các giai đoạn trong vi nhân giống thực vật 1. Khử trùng bề mặt Khử trùng mẫu cấy là giai đoạn có nhiều tác nhân cần được kiểm soát như địa điểm thu nhận, độ sạch, khối lượng trung bình, độ tuổi khai thác và tình trạng sinh trưởng của cây. Mặc dù, khi đã kiểm soát được các tác nhân trên thì sự nhiễm nấm và khuẩn vẫn ảnh hưởng đến tỷ lệ thành công của giai đoạn này. Vì vậy, các phương pháp khác nhau đã được phát triển trong vài năm qua, có thể kể đến như cải tiến dụng cụ, hoặc sử dụng các hoá chất khử trùng.
Street (1974) đã đưa ra các chất hoá học, nồng độ khử trùng và thời gian xử lý mẫu cấy để loại bỏ các yếu tố gây nhiễm được thể hiện trong Bảng 1. Như vậy, có thể thấy Ca(ClO)2, HgCl2 và kháng sinh là ba chất khử trùng được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô thực vật [150]. Ca(ClO)2 có tác dụng ức chế nấm mốc và vi khuẩn bằng cách ăn mòn thành tế bào hay tác động lên hệ enzyme của vi khuẩn. Vì vậy, nó được sử dụng như một chất để khử trùng khi đưa các nguồn mẫu ban đầu từ điều kiện ex vitro vào nuôi cấy in vitro.
Mặt khác, các mô tế bào thực vật cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với Ca(ClO)2; ngoài ra, sức khoẻ con người cũng bị ảnh hưởng khi nuốt hay hít phải Ca(ClO)2 [167]. HgCl2 là một dạng muối của thuỷ ngân, hiện được sử dụng phổ biến trong quy mô phòng thí nghiệm. Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, Hussanin và cộng sự (1994) đã thành công khi sử dụng HgCl2 như là một chất giúp chống lại các vi khuẩn và nấm 5 luan an trong giai đoạn vào mẫu ban đầu [77]; nhưng muối thuỷ ngân này lại rất độc - có thể gây tổn thương não và gan khi con người tiếp xúc hay nuốt phải [167]. Về mặt lý thuyết, dường như tất cả các vấn đề nhiễm bẩn có thể được kiểm soát, nhưng sau một thời gian lại bùng phát trở lại.
Trong hầu hết các trường hợp này chất kháng sinh được sử dụng để làm giảm vấn đề, nhưng các chất này thường gây độc tế bào hoặc có thể làm chậm, ức chế sự phát triển mô thực vật và xuất hiện hiện tượng vi sinh vật kháng chất kháng sinh [35], [147]. Trong những năm gần đây, việc sử dụng các hoá chất trên đã có một số thành công nhất định trong vi nhân giống thực vật. Đặc biệt, trên các đối tượng cây salem và dâu tây các nghiên cứu này thường tập trung vào ảnh hưởng của nguồn mẫu, chất khử trùng, nồng độ và thời gian xử lý lên quá trình khử trùng bề mặt (Bảng 1. Tác nhân khử trùng, nồng độ kết hợp với thời gian xử lý trong khử trùng mẫu cấy Chất khử trùng Nồng độ (g/L) Thời gian (phút) Ca(ClO)2 90 – 100 5 – 30 HgCl2 1 – 10 2 – 10 Sodium hypochlorite (NaOCl) 10 – 30 5 – 30 Nước oxy già (H2O2) 100 – 120 5 – 15 Nước brom (Br2) 10 – 20 2 – 10 Chất kháng sinh 0,004 – 0,05 30 – 60 Bảng 1.
Một số nghiên cứu khử trùng bề mặt mẫu cấy trên cây salem và dâu tây Loài thực vật Vật liệu Chất khử trùng Nguồn (nồng độ × thời gian) Salem (Limonium Chồi đỉnh HgCl2 (1 g/L × 5 phút) [83] sinuatum) Dâu tây (Fragaria Chồi đỉnh HgCl2 (1 g/L × 4 phút) [79] × ananassa của ngó, Duch.) đoạn thân bò mang chồi 6 luan an Dâu tây (Fragaria Chồi đỉnh, NaOCl (5 g/L × 15 phút) [111] × ananassa đoạn thân Duch.) bò mang chồi, cuống lá Dâu tây (Fragaria Đoạn thân Thuốc diệt nấm (10 mL/L × 2 [122] × ananassa bò mang giờ); ciprofloxacin (200 g/L × 1 Duch.) chồi giờ); Tween 20 (2 giọt × 5 phút); cồn (70% × 5 phút); HgCl2 (1 g/L × 5 phút) Dâu tây (Fragaria Đỉnh sinh NaOCl (5 g/L × 15 phút) [111] × ananassa trưởng Chandler, Osogrande, Islamabad Local) Dâu tây (Fragaria Đỉnh sinh NaOCl (1 g/L × 15 phút) [111] × ananassa trưởng Chandler) Dâu tây (Fragaria Lá non NaOCl (4 g/L × 20 phút) [21] × ananassa Festivsl) Dâu tây (Fragaria Lá non NaOCl (3 g/L × 20 phút) [21] × ananassa Albion) 1. Phát sinh hình thái Cảm ứng mô sẹo Cảm ứng mô sẹo là một trong những kỹ thuật cơ bản của vi nhân giống thực vật. Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hoá dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, chất điều hoà sinh trưởng thực vật). Các tế bào thuộc mô và cơ quan này phải trải qua quá trình phân hoá trước lần phân chia đầu tiên cho phép tế bào trở lại trạng thái “trẻ hoá” giúp tế bào tái lập khả năng phân chia trong các điều kiện thích hợp [70].
Nhìn chung, cảm ứng mô sẹo thông qua 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia và biệt hoá tế bào. Trong giai đoạn phát sinh mô sẹo, sự trao đổi các chất kích thích dẫn đến sự phân chia tế bào, độ dài của giai đoạn này phụ thuộc vào tình trạng 7 luan an sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Vào giai đoạn tiếp theo của quá trình hình thành mô sẹo thì các tế bào phân chia tăng nhanh sinh khối. Sau đó, tế bào đi vào quá trình biệt hoá dẫn đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao.
Mô sẹo khi hình thành thường gồm hai loại: (1) mô sẹo xốp - chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và không bào to; (2) mô sẹo cứng thì ngược lại - các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ [20]. Nuôi cấy mô sẹo xốp được ứng dụng rộng rãi trong vi nhân giống: (1) vi nhân giống ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc không thực hiện được; (2) làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, tế bào trần, phát sinh phôi, tái sinh chồi, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học; (3) làm nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: tế bào đột biến, chịu mặn, kháng sâu bệnh [20]. Nuôi cấy huyền phù tế bào Nuôi cấy huyền phù tế bào là phương thức nuôi tế bào đơn hay cụm nhiều tế bào ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng. Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo ở môi trường lỏng chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy.
Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng. Ở đó chúng sinh trưởng, phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào. Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào. Điều kiện quan trọng của nuôi cấy huyền phù tế bào là môi trường nuôi cấy được khuấy lắc liên tục với tốc độ 100 – 150 vòng/phút.
Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mô sẹo và các tế bào chết. Sự tái sinh thực vật từ huyền phù tế bào là giai đoạn quan trọng cho phép thực hiện nhân giống in vitro ở mức độ công nghiệp, cũng như mọi thao tác ở mức độ tế bào [156]. Khi phát triển trong môi trường lỏng, các tế bào đơn của thực vật thường trải qua 4 giai đoạn: thích nghi, tăng trưởng, cân bằng và suy vong. Giai đoạn thích nghi là giai đoạn đầu tiên, nó kéo dài cho tới khi có tín hiệu phân chia đầu tiên.
Ở giai đoạn này không xảy ra sự tăng khối lượng và số lượng tế bào. Giai đoạn này được xem là giai đoạn thích ứng của tế bào với môi trường nuôi cấy trước khi sự sinh trưởng của 8 luan an tế bào bắt đầu. Tiếp theo là giai đoạn tăng trưởng, ở giai đoạn này các tế bào phân chia và tăng khối lượng với tốc độ lớn nhất (số lượng tế bào tăng lên theo hàm số mũ). Sau giai đoạn tăng trưởng là giai đoạn cân bằng, sự sinh trưởng của tế bào diễn ra ổn định, số lượng tế bào sinh ra bằng số lượng tế bào chết đi.
Cuối cùng là giai đoạn suy vong, sự sinh trưởng của tế bào giảm xuống và dẫn đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyền [7]. Phát sinh phôi vô tính Phôi vô tính chứa chất dinh dưỡng tương tự như phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây. Các mô và cơ quan sinh dưỡng nuôi cấy in vitro tạo ra phôi vô tính thông qua quá trình tạo mô sẹo trung gian. Tế bào mô sẹo có thể phân chia theo cấp số nhân, nhờ vậy, chỉ sau một thời gian ngắn có thể tạo được một số lượng phôi đáng kể.
Cho đến nay, trên 200 loài cây trồng đã được nhân giống thành công bằng công nghệ phôi vô tính. Phôi vô tính có thể bảo quản lâu dài và cho nảy mầm vào thời vụ thích hợp. Công nghệ tạo phôi vô tính hiện vẫn đang là công nghệ tiên tiến trên thế giới [19]. Sự tái sinh thực vật thông qua con đường phát sinh phôi vô tính bao gồm 5 giai đoạn [10]: - Nuôi cấy tạo phôi bằng cách chọn lựa mẫu cấy sơ cấp và cấy vào môi trường bổ sung chất điều hoà sinh trưởng, chủ yếu là auxin (đôi khi là cytokinin).
- Tăng sinh của quá trình nuôi cấy phôi trên môi trường rắn hoặc lỏng có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng tương tự như trên. - Giai đoạn trước khi trưởng thành của phôi trong môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng để ngăn sự tăng sinh và kích thích sự tạo phôi. - Giai đoạn phôi trưởng thành bằng cách nuôi cấy phôi trong môi trường bổ sung ABA và/hoặc giảm áp lực thẩm thấu. - Sự phát triển của cây trên môi trường nuôi cấy không có chất điều hoà sinh trưởng.
Phôi vô tính được sử dụng trong các nghiên cứu phôi học và kỹ thuật di truyền.