Nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt đến chất lượng cây giống in vitro ở các cây trồng có giá trị kinh tế.

• Tác giả: Đỗ Mạnh Cường
• Người hướng dẫn: GS. Dương Tấn Nhựt
• Trường học: Đại học Huế
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Tác Động Của Nano Bạc Và Nano Sắt Đến Chất Lượng Cây Giống In Vitro
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thừa Thiên Huế

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.2. VI NHÂN GIỐNG
• 1.2.1. Khái niệm vi nhân giống
• 1.2.2. Các giai đoạn trong vi nhân giống thực vật
• 1.2.2.1. Khử trùng bề mặt
• 1.2.2.2. Phát sinh hình thái
• 1.2.2.3. Cây hoàn chỉnh và thích nghi vườn ươm
• 1.2.2.4. Một số hạn chế trong vi nhân giống thực vật
• 1.2.2.4.1. Tích luỹ khí ethylene
• 1.2.2.4.2. Hoá nâu mẫu cấy
• 1.3. NANO KIM LOẠI
• 1.3.1. Giới thiệu chung
• 1.3.2. Ứng dụng nano kim loại trong vi nhân giống thực vật
• 1.3.2.1. AgNPs và FeNPs trong vi nhân giống thực vật
• 1.3.2.1.1. AgNPs trong vi nhân giống thực vật
• 1.3.2.1.2. FeNPs trong vi nhân giống thực vật
• 1.3.2.2. Hấp thu, vận chuyển và chuyển hóa nano kim loại trong cây
• 1.3.2.3. Tính an toàn sinh học của các nano kim loại
• 1.4. SƠ LƯỢC VỀ CÁC ĐỐI TƯỢNG CÂY TRỒNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
• 1.4.1. Sâm Ngọc Linh
• 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu thực vật
• 2.2. Dung dịch nano
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy
• 2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro
• 2.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro
• 2.4.4. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 2.5.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy
• 2.5.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro
• 2.5.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro
• 2.5.1.4. Thí nghiệm 4: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng, phát triển và tích luỹ hoạt chất của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 2.5.2. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu
• 2.5.2.1. Phương pháp quan sát bề mặt mô sẹo
• 2.5.2.2. Phương pháp giải phẫu thực vật
• 2.5.2.3. Phương pháp quan sát và đếm số lượng tế bào
• 2.5.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng khí ethylene
• 2.5.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng AgNPs hấp thụ
• 2.5.2.6. Phương pháp phân tích định lượng saponin (G-Rg1, M-R2, G-Rb1)
• 2.5.3. Điều kiện nuôi cấy
• 2.5.4. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
• 2.5.5. Phương pháp xử lý thống kê
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy
• 3.1.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem
• 3.1.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây
• 3.1.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh
• 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro
• 3.2.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem nuôi cấy in vitro
• 3.2.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi từ huyền phù tế bào cây salem nuôi cấy in vitro
• 3.2.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình phát sinh và tăng sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
• 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi nuôi cấy in vitro
• 3.3.1. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem nuôi cấy in vitro
• 3.3.2. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây nuôi cấy in vitro
• 3.3.3. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
• 3.4. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 3.4.1. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây salem in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 3.4.2. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây dâu tây in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 3.4.3. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây sâm Ngọc Linh in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nano bạc và nano sắt

Nghiên cứu về nano bạc (AgNPs) và nano sắt (FeNPs) đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Nano bạc được biết đến với khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ, trong khi nano sắt đóng vai trò thiết yếu trong quá trình quang hợp và sinh trưởng của cây. Việc ứng dụng các hạt nano này trong nuôi cấy in vitro không chỉ giúp cải thiện chất lượng cây giống mà còn nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp. Theo nghiên cứu, tác động của nano đến cây trồng có thể được phân tích qua các chỉ tiêu như tỷ lệ nảy mầm, sự phát triển của rễ và lá, cũng như khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi. Việc sử dụng công nghệ nano trong nông nghiệp mở ra nhiều cơ hội mới cho việc phát triển giống cây trồng có giá trị kinh tế cao.

II. Tác động của nano bạc đến chất lượng cây giống

Nghiên cứu cho thấy nano bạc có tác động tích cực đến chất lượng cây giống in vitro. Cụ thể, việc sử dụng AgNPs trong quá trình khử trùng bề mặt mẫu cấy giúp giảm thiểu sự nhiễm khuẩn, từ đó nâng cao tỷ lệ sống sót của cây giống. Các thí nghiệm cho thấy rằng cây giống được xử lý bằng nano bạc có khả năng phát triển mạnh mẽ hơn, với sự gia tăng đáng kể về số lượng tế bào và sự phát sinh chồi. Điều này chứng tỏ rằng tác dụng của nano bạc không chỉ dừng lại ở việc kháng khuẩn mà còn thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc bổ sung AgNPs vào môi trường nuôi cấy có thể cải thiện đáng kể khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây, từ đó nâng cao chất lượng cây giống.

III. Tác động của nano sắt đến chất lượng cây giống

Tương tự như nano bạc, nano sắt cũng cho thấy những tác động tích cực đến chất lượng cây giống in vitro. Việc thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs trong môi trường nuôi cấy đã giúp cải thiện đáng kể khả năng sinh trưởng của cây. Nghiên cứu cho thấy rằng cây giống được bổ sung nano sắt có khả năng phát triển rễ mạnh mẽ hơn, từ đó tăng cường khả năng hấp thu nước và dinh dưỡng. Tác dụng sinh học của FeNPs không chỉ giúp cây phát triển tốt hơn mà còn nâng cao khả năng chống chịu với các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Điều này cho thấy rằng việc ứng dụng nano sắt trong nông nghiệp có thể là một giải pháp hiệu quả để cải thiện chất lượng cây giống và năng suất cây trồng.

IV. Ứng dụng công nghệ nano trong nông nghiệp

Công nghệ nano đang mở ra nhiều hướng đi mới trong nông nghiệp, đặc biệt là trong lĩnh vực vi nhân giống. Việc ứng dụng hạt nano như AgNPs và FeNPs không chỉ giúp cải thiện chất lượng cây giống mà còn giảm thiểu việc sử dụng hóa chất độc hại trong nông nghiệp. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ứng dụng nano trong nông nghiệp có thể giúp tăng cường khả năng sinh trưởng, phát triển và chống chịu của cây trồng. Hơn nữa, việc sử dụng công nghệ nano còn giúp tiết kiệm chi phí sản xuất và nâng cao hiệu quả kinh tế cho người nông dân. Từ đó, có thể thấy rằng việc nghiên cứu và ứng dụng nano bạc và nano sắt trong nông nghiệp không chỉ mang lại lợi ích cho cây trồng mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học của tác giả Đỗ Mạnh Cường, với đề tài "Nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro ở một số cây trồng có giá trị kinh tế", được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Dương Tấn Nhựt và PGS. Trương Thị Bích Phượng. Công trình hoàn thành và bảo vệ năm 2022.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Vi nhân giống thực vật đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra số lượng lớn cây giống sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền và bảo tồn nguồn gen. Tuy nhiên, quy trình nhân giống in vitro truyền thống vẫn gặp phải các rào cản kỹ thuật như: tỷ lệ nhiễm khuẩn cao trong giai đoạn khử trùng ban đầu, hiện tượng tích lũy khí ethylene trong bình kín dẫn đến tình trạng thủy tinh thể, rụng lá, úa vàng, hệ thống rễ in vitro kém phát triển, giòn và dễ gãy khi chuyển giao cơ học, cùng với tỷ lệ sống sót của cây con ở giai đoạn thuần hóa vườn ươm (ex vitro) thấp (thường hao hụt 10–40%). Bên cạnh đó, các hóa chất khử trùng thông dụng như clorua thủy ngân ($\text{HgCl}_2$) có độc tính cao đối với con người và môi trường, trong khi muối sắt chelate truyền thống ($\text{Fe-EDTA}$) bị giảm hiệu quả hấp thu khi độ pH môi trường dao động. Việc ứng dụng các hạt nano kim loại như nano bạc (AgNPs) và nano sắt (FeNPs) vào môi trường nuôi cấy mô được đặt ra nhằm giải quyết các hạn chế nêu trên, nâng cao chất lượng cây giống và hạ giá thành sản xuất.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Mục tiêu tổng quát: Đánh giá tác động của hạt nano bạc (AgNPs) dùng trong khử trùng bề mặt mẫu lá và bổ sung vào môi trường nuôi cấy, hạt nano sắt (FeNPs) dùng thay thế $\text{Fe-EDTA}$ trong vi nhân giống lên chất lượng cây giống ở một số loài cây trồng có giá trị kinh tế.
2. Mục tiêu cụ thể:
   • Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs lên hiệu quả khử trùng bề mặt mẫu lá cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh so sánh với các hóa chất khử trùng truyền thống gồm calcium hypochlorite [$\text{Ca(ClO)}_2$] và chlorua thủy ngân ($\text{HgCl}_2$).
   • Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái (phát sinh phôi, tái sinh chồi, gia tăng số lượng tế bào) ở cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh.
   • Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình hình thành cây hoàn chỉnh ở ba đối tượng cây trồng nghiên cứu.
   • Đánh giá ảnh hưởng của lượng AgNPs được hấp thu đến sự biến động khí ethylene tích luỹ trong quá trình hình thành rễ ở cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh.
   • Đánh giá khả năng thích nghi và sinh trưởng của cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh ở giai đoạn ex vitro có nguồn gốc từ nghiệm thức AgNPs và FeNPs tối ưu in vitro.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Dung dịch hạt AgNPs (sử dụng khử trùng bề mặt và bổ sung môi trường dinh dưỡng) và FeNPs (thay thế nguồn $\text{Fe-EDTA}$) ở các nồng độ khác nhau; ba loài cây trồng gồm hoa salem (Limonium sinuatum), dâu tây (Fragaria × ananassa) và sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
• Phạm vi nghiên cứu: Các giai đoạn trong quy trình vi nhân giống in vitro (khử trùng ban đầu, cảm ứng mẫu cấy, nuôi cấy huyền phù, tăng sinh tế bào, phát sinh phôi vô tính, tái sinh chồi, tạo rễ và cây con hoàn chỉnh) và giai đoạn theo dõi sinh trưởng ex vitro tại vườn ươm, nhà kính (từ 4 tuần đến 24 tháng tùy đối tượng).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Luận án đã hệ thống hóa các tài liệu nghiên cứu liên quan đến ba nhóm vấn đề chính:

1. Kỹ thuật khử trùng và nhân giống in vitro truyền thống:

   • Khử trùng: Street (1974) tổng kết các tác nhân khử trùng phổ biến như $\text{Ca(ClO)}_2$, $\text{HgCl}_2$, $\text{NaOCl}$, $\text{H}_2\text{O}_2$, nước brom và kháng sinh. Hussanin và cộng sự (1994) ghi nhận hiệu quả diệt khuẩn của $\text{HgCl}_2$ nhưng nhấn mạnh độc tính cao đối với gan và não bộ. Các công trình trên cây salem của [83] sử dụng $\text{HgCl}_2$ ($1\text{ g/L}$ trong 5 phút); trên cây dâu tây của [79], [111], [122], [21] khảo sát các tác nhân $\text{HgCl}_2$ và $\text{NaOCl}$ trên chồi đỉnh, đoạn thân bò và lá non.
   • Phát sinh hình thái: Các công trình sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật truyền thống gồm auxins (NAA, 2,4-D, IBA, IAA, picloram) và cytokinins (BAP, BA, kinetin, TDZ, zeatin) để kích thích tạo mô sẹo, huyền phù tế bào và tái sinh chồi trên cây salem [83, 78], dâu tây [111, 82, 112, 123] và sâm Ngọc Linh [119, 118, 116].
   • Hạn chế do ethylene: Houben và Van de Poel (2019) mô tả con đường sinh tổng hợp ethylene từ Methionine $\rightarrow$ SAM $\rightarrow$ ACC $\rightarrow$ Ethylene thông qua enzyme ACS (ACC Synthase) và ACO (ACC Oxidase). Azhar và cộng sự (2019) làm rõ chuỗi truyền tín hiệu ethylene qua hệ thống thụ thể màng ETR1, ERS1, ETR2, EIN4, ERS2 kết hợp với phức hệ protein CTR1, EIN2, EIN3 và các yếu tố phiên mã ERF1.

2. Cơ chế hấp thu sắt ở thực vật:

   • Romheld và cộng sự (1986) xác lập hai cơ chế hấp thu sắt: Cơ chế 1 (ở thực vật hai lá mầm và một lá mầm không thuộc nhóm hòa thảo) dựa vào enzyme khử $\text{Fe}^{3+}$ thành $\text{Fe}^{2+}$ tại màng sinh chất kết hợp bơm đẩy proton $\text{H}^+$; Cơ chế 2 (ở nhóm thực vật hòa thảo) dựa vào việc tiết phytosiderophores chelate hóa $\text{Fe}^{3+}$. Nguồn $\text{Fe-EDTA}$ truyền thống dễ mất hoạt tính khi pH môi trường vượt quá 6,5.

3. Ứng dụng vật liệu nano trong công nghệ sinh học thực vật:

   • Quốc tế: Ứng dụng AgNPs khử trùng mẫu cấy trên Valeriana officinalis [22], Gerbera jamesonii [58], Fragaria × ananassa [161], Arabidopsis thaliana [102]; kích thích tái sinh chồi trên Vanilla planifolia [149], Rosa hybrida [68]; bổ sung FeNPs kích thích sinh trưởng trên Spinacia oleracea [25], Calendula officinalis [26], Typha latifolia [99].
   • Tại Việt Nam: Các nghiên cứu bước đầu của Dương Tấn Nhựt và cộng sự về AgNPs trên hoa cúc (Chrysanthemum spp.) [14, 18, 97], hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) [9, 13, 8], hoa hồng gai (Rosa hybrida) [8], cúc Jimba (Chrysanthemum morifolium) [160], và hạt nano đồng (CuNPs) trên rễ tơ sâm Ngọc Linh [6].

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Mặc dù nano kim loại đã bước đầu được thử nghiệm, các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung đơn lẻ vào một giai đoạn nuôi cấy hoặc trên các loài cây hoa thông thường. Chưa có nghiên cứu nào thực hiện đồng bộ từ khâu khử trùng bề mặt, phát sinh hình thái, nuôi cấy huyền phù, tạo phôi, tạo cây hoàn chỉnh cho đến đánh giá sinh trưởng ex vitro dài hạn và định lượng hoạt chất saponin trên ba nhóm cây trồng đại diện (cây hoa cắt cành - salem, cây ăn quả - dâu tây, cây dược liệu đặc hữu - sâm Ngọc Linh). Luận án cũng là công trình làm rõ mối tương quan định lượng giữa hàm lượng AgNPs được mô thực vật hấp thu với sự suy giảm nồng độ khí ethylene nội sinh trong bình nuôi cấy in vitro.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Cơ chế kháng khuẩn của AgNPs: Các ion $\text{Ag}^+$ giải phóng từ AgNPs liên kết với nhóm peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn, làm tổn thương cấu trúc màng, ức chế vận chuyển oxy. Khi thâm nhập vào nội bào, $\text{Ag}^+$ phản ứng với nhóm sulfhydryl (-SH) của các enzyme chuyển hóa, vô hiệu hóa chuỗi hô hấp và gắn kết với các base nitơ của DNA để ức chế quá trình sao chép.
• Cơ chế ức chế tác động của ethylene của hạt nano bạc: Hạt AgNPs giải phóng ion $\text{Ag}^+$ cạnh tranh thế chỗ ion đồng ($\text{Cu}^+$) tại trung tâm hoạt động của thụ thể màng ETR1, ngăn chặn sự gắn kết của ethylene và ức chế chuỗi truyền tín hiệu gây lão hóa. Đồng thời, việc ức chế tổng hợp ethylene chuyển hướng tiền chất SAM sang con đường sinh tổng hợp các polyamine nội sinh, kích thích sự phân chia tế bào và phát sinh hình thái.
• Cơ chế dinh dưỡng và quang học: AgNPs có khả năng hấp thụ ánh sáng ở dải bước sóng 390–420 nm, hỗ trợ quá trình thu nhận năng lượng ánh sáng và tổng hợp chlorophyll. FeNPs (kích thước <60 nm) cung cấp nguồn sắt ổn định, xâm nhập qua vách Caspary và hệ mạch dẫn (apoplast/symplast) mà không bị phụ thuộc chặt chẽ vào độ pH môi trường như $\text{Fe-EDTA}$.

      [Dung dịch nano AgNPs & FeNPs (Viện Công nghệ Môi trường)]
[Salem (L. sinuatum)]   [Dâu tây (F. × ananassa)]   [Sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis)]
[Phân tích thiết bị: GC-CP 3380, AAS-6650, FE-SEM S4800, SPAD-502, HPLC]

Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm

Nghiên cứu được thiết kế thành 4 khối thí nghiệm chính:

1. Thí nghiệm 1 - Khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy: Mẫu lá non được xử lý bằng AgNPs ở các dải nồng độ và thời gian khác nhau, so sánh đối chứng với các nghiệm thức $\text{HgCl}_2$ và $\text{Ca(ClO)}_2$. Ghi nhận tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ cảm ứng mô sẹo/chồi sau thời gian nuôi cấy (4–6 tuần).
2. Thí nghiệm 2 - Phát sinh hình thái in vitro:
   • Trên cây salem: Đánh giá sự tăng trưởng số lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy lỏng lắc (100–150 vòng/phút) có bổ sung AgNPs theo chu kỳ 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 ngày; đánh giá khả năng tái sinh chồi từ dịch huyền phù tế bào.
   • Trên sâm Ngọc Linh: Đánh giá quá trình phát sinh và tăng sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis) từ mô sẹo trên môi trường bổ sung AgNPs.
3. Thí nghiệm 3 - Tạo cây con hoàn chỉnh: Bổ sung AgNPs kết hợp thay thế hoàn toàn nguồn $\text{Fe-EDTA}$ bằng FeNPs trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy chồi cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Theo dõi các chỉ tiêu hình thái (chiều cao chồi, số lá, số rễ, chiều dài rễ, khối lượng tươi/khô, chỉ số SPAD chlorophyll).
4. Thí nghiệm 4 - Đánh giá giai đoạn ex vitro: Chuyển cây con hoàn chỉnh đạt chuẩn ra vườn ươm/nhà kính. Theo dõi tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng trên vỉ xốp (4 tuần đối với salem, dâu tây; 6 tháng đối với sâm Ngọc Linh), trong chậu nhựa/rổ nhựa (12 tuần đối với salem, dâu tây; 12–24 tháng đối với sâm Ngọc Linh).

Dữ liệu và thiết bị phân tích

• Nguồn vật liệu: Lá non cây salem và dâu tây 3 tháng tuổi, lá sâm Ngọc Linh 3 năm tuổi thu nhận tại vườn ươm Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Dung dịch AgNPs (20–25 nm, chất khử $\text{NaBH}_4$, chất ổn định chitosan) và FeNPs (20–60 nm, chất khử $\text{NaBH}_4$, chất ổn định CMC) nồng độ gốc 1000 ppm do Viện Công nghệ Môi trường tổng hợp.
• Trang thiết bị chuyên dụng:
  • Kính hiển vi điện tử quét FE SEM S4800: Quan sát cấu trúc bề mặt mô sẹo, khí khổng và rễ.
  • Máy sắc ký khí Gas Chromatography GC-CP 3380: Phân tích hàm lượng khí ethylene tích luỹ trong bình nuôi cấy.
  • Máy quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS-6650: Định lượng nồng độ bạc và sắt hấp thụ trong mô thực vật.
  • Máy đo hàm lượng chlorophyll SPAD-502 (Minolta Co., Osaka, Nhật Bản).
  • Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC: Phân tích định lượng 3 hợp chất saponin khung dammaran chính của sâm Ngọc Linh gồm Ginsenoside Rg1 ($\text{G-Rg1}$), Majonoside R2 ($\text{M-R2}$) và Ginsenoside Rb1 ($\text{G-Rb1}$).
• Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định Duncan qua phần mềm thống kê SPSS.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp các cơ sở lý luận về vi nhân giống thực vật, nêu rõ bản chất của các giai đoạn nuôi cấy (khử trùng bề mặt, phát sinh mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh phôi vô tính, tạo rễ và thuần hóa ex vitro). Chương này phân tích chi tiết hai trở ngại sinh lý phổ biến trong nuôi cấy in vitro: sự tích lũy khí ethylene gây úa lá, hoại tử mô và hiện tượng hóa nâu do sự oxy hóa các hợp chất phenol.

Phần tiếp theo của chương hệ thống hóa các khái niệm về vật liệu nano kim loại, phân loại nano core-shell, cơ chế kháng khuẩn, cơ chế hấp thu qua vách tế bào thực vật (kích thước lỗ vách 5–20 nm và khả năng thâm nhập của hạt nano đến 50 nm qua cấu trúc tạo lỗ nhân tạo hoặc gian bào). Chương 1 cũng trình bày chi tiết sinh học và giá trị kinh tế của ba đối tượng nghiên cứu: cây hoa salem (Limonium sinuatum), cây dâu tây (Fragaria × ananassa) và cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), qua đó xác định cơ sở khoa học cho việc ứng dụng AgNPs và FeNPs để cải thiện chất lượng cây giống.

Nhóm nội dung tổng quan	Các khía cạnh lý thuyết và dẫn liệu chính	Nguồn tài liệu tiêu biểu
Kỹ thuật vi nhân giống	Các giai đoạn in vitro; hạn chế do nấm, vi khuẩn, rụng lá, rễ giòn gãy, tỷ lệ sống vườn ươm thấp	Street (1974), Nhựt và cs. (2017)
Ức chế khí Ethylene	Chu trình Yang, sinh tổng hợp qua SAM, ACS, ACO; truyền tín hiệu thụ thể ETR1, CTR1, EIN2, EIN3	Houben & Van de Poel (2019), Azhar và cs. (2019)
Cơ chế hấp thu Sắt	Cơ chế 1 (khử $\text{Fe}^{3+} \rightarrow \text{Fe}^{2+}$, bơm $\text{H}^+$); Cơ chế 2 (tiết phytosiderophores)	Romheld và cs. (1986)
Đặc tính hạt Nano	Cấu trúc core-shell, hiệu ứng diện tích bề mặt, phổ hấp thụ ánh sáng 390–420 nm của AgNPs	Salata (2004), Zuverza-Mena và cs. (2017)
Đối tượng nghiên cứu	Sinh học và nhân giống cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh (chứa saponin $\text{M-R2}$, $\text{G-Rg1}$, $\text{G-Rb1}$)	Đỗ Tất Lợi (2004), Nhựt và cs. (2009-2020)

Chương 2. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc và tiêu chuẩn của vật liệu thực vật (lá non salem và dâu tây 3 tháng tuổi; lá sâm Ngọc Linh 3 năm tuổi). Thông số kỹ thuật của dung dịch hạt nano kim loại gồm: AgNPs hóa trị 0 (kích thước 20–25 nm, chất ổn định chitosan) và FeNPs hóa trị 0 (kích thước 20–60 nm, chất ổn định CMC), cả hai đều pha loãng từ nồng độ gốc 1000 ppm do Viện Công nghệ Môi trường chế tạo.

Chương này trình bày quy trình bố trí 4 nội dung thí nghiệm tương ứng 4 giai đoạn sinh trưởng của cây trồng; quy chuẩn các điều kiện môi trường phòng nuôi cấy (nhiệt độ, quang chu kỳ, độ ẩm, cường độ chiếu sáng); đồng thời mô tả chi tiết quy trình thao tác trên các thiết bị phân tích hiện đại như hệ thống quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS-6650, sắc ký khí GC-CP 3380, kính hiển vi điện tử quét FE SEM S4800, máy SPAD-502 và quy trình chiết xuất, phân tích định lượng 3 loại saponin bằng HPLC.

Chương 3. Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm và thảo luận theo 4 phân mục lớn:

1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy

• Trên cây salem: AgNPs xử lý mẫu lá cho tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn tương đương hoặc cao hơn nghiệm thức khử trùng bằng $\text{HgCl}_2$, đồng thời loại bỏ nguy cơ gây độc tế bào của muối thủy ngân, mẫu lá duy trì màu xanh và cảm ứng tạo mô sẹo khỏe mạnh sau 4 tuần nuôi cấy.
• Trên cây dâu tây: Nghiệm thức sử dụng AgNPs khử trùng mẫu lá non ghi nhận tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo và tái sinh chồi sạch bệnh sau 6 tuần nuôi cấy vượt trội so với đối chứng sử dụng $\text{Ca(ClO)}_2$ hoặc $\text{HgCl}_2$.
• Trên cây sâm Ngọc Linh: Xử lý bề mặt mẫu lá non bằng AgNPs giúp kiểm soát nhiễm khuẩn nội sinh và ngoại sinh sau 6 tuần nuôi cấy, kích thích mô lá hình thành mô sẹo sâm sạch bệnh mà không bị hiện tượng hóa nâu mô.

2. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu in vitro

• Gia tăng số lượng tế bào mô sẹo cây salem: Trong nuôi cấy huyền phù tế bào lỏng lắc, việc bổ sung AgNPs ở nồng độ thích hợp thúc đẩy số lượng tế bào gia tăng theo hàm số mũ từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 20 trước khi đạt trạng thái cân bằng ở ngày thứ 24–28 (Biểu đồ 3.1).
• Tái sinh chồi từ huyền phù tế bào salem: Môi trường bổ sung AgNPs tối ưu làm tăng tỷ lệ cụm tế bào phân hóa thành chồi hoàn chỉnh sau 4 tuần nuôi cấy so với nghiệm thức đối chứng không bổ sung.
• Phát sinh và tăng sinh phôi sâm Ngọc Linh: Nghiệm thức bổ sung AgNPs ở nồng độ tối ưu ($1{,}6\text{ mg/L}$) làm gia tăng tỷ lệ phát sinh phôi soma, tăng số lượng phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và tỷ lệ tái sinh chồi từ phôi vô tính sau 6–14 tuần nuôi cấy (Bảng 3.5, Hình 3.6, Hình 3.7).

3. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh

• Bổ sung kết hợp AgNPs và thay thế $\text{Fe-EDTA}$ bằng FeNPs trong môi trường tạo cây hoàn chỉnh cho thấy:
  • Hệ thống rễ của cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh phát triển mạnh, số lượng rễ nhiều, rễ dài và tăng độ bám dính, thành tế bào dày, cấu trúc mô dẫn hoàn thiện (quan sát qua ảnh SEM).
  • Tăng hàm lượng chlorophyll (đo qua chỉ số SPAD), cây có màu xanh đậm, phiến lá dày, hạn chế hiện tượng rụng lá in vitro.
  • Phân tích GC cho thấy nồng độ khí ethylene tích luỹ trong bình nuôi cấy ở các nghiệm thức bổ sung AgNPs giảm rõ rệt so với đối chứng. Kết quả đo AAS xác nhận mô cây đã hấp thu một lượng hạt AgNPs nhất định, tỷ lệ nghịch trực tiếp với lượng khí ethylene thoát ra trong bình kín.

4. Khả năng sinh trưởng của cây con ở giai đoạn ex vitro

• Cây salem: Cây con in vitro từ nghiệm thức tối ưu AgNPs + FeNPs khi chuyển ra vỉ xốp đạt tỷ lệ sống cao sau 4 tuần nuôi trồng; sau 12 tuần trong chậu nhựa cây sinh trưởng mạnh, thân cứng cáp, tán lá phát triển đồng đều (Bảng 3.10, Bảng 3.11, Hình 3.11).
• Cây dâu tây: Cây con thích nghi tốt trong vỉ xốp sau 4 tuần và phát triển mạnh trong chậu nhựa sau 12 tuần, tốc độ phân nhánh và ra lá mới cao hơn nghiệm thức đối chứng truyền thống (Bảng 3.12, Bảng 3.13, Hình 3.12).
• Cây sâm Ngọc Linh: Cây con đạt tỷ lệ sống cao khi nuôi trồng trong vỉ xốp sau 6 tháng; chuyển sang rổ nhựa sinh trưởng tốt sau 12 tháng và tiếp tục phát triển củ khỏe mạnh sau 24 tháng trong nhà kính (Hình 3.13, Hình 3.14). Phân tích HPLC củ sâm Ngọc Linh 2 năm tuổi thu nhận hàm lượng tích lũy của 3 hợp chất saponin chính gồm $\text{G-Rg1}$, $\text{M-R2}$ và $\text{G-Rb1}$ đạt mức ổn định (Biểu đồ 3.5, Biểu đồ 3.6).

Kết luận và kiến nghị

Luận án kết luận hạt AgNPs và FeNPs có hiệu quả cao trong việc thay thế hóa chất khử trùng độc hại, điều hòa sinh trưởng, ức chế ethylene và cung cấp dinh dưỡng khoáng sắt cho ba loài cây nghiên cứu. Tác giả kiến nghị ứng dụng các thông số nồng độ tối ưu vào quy trình sản xuất giống thương phẩm quy mô lớn.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học

1. Công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu một cách hệ thống và toàn diện về ứng dụng hạt nano kim loại (AgNPs và FeNPs) trong toàn bộ quy trình vi nhân giống trên ba đối tượng cây trồng có giá trị kinh tế đại diện: cây hoa (Limonium sinuatum), cây ăn quả (Fragaria × ananassa) và cây dược liệu đặc hữu (Panax vietnamensis).
2. Làm rõ cơ chế sinh lý của AgNPs trong việc làm suy giảm sự tích lũy khí ethylene nội sinh trong bình nuôi cấy thông qua mối tương quan định lượng giữa hàm lượng hạt Ag hấp thu vào mô (phân tích bằng AAS) và nồng độ ethylene phân tích bằng sắc ký khí (GC).
3. Chứng minh hiệu quả thay thế hoàn toàn nguồn sắt chelate truyền thống ($\text{Fe-EDTA}$) bằng hạt nano sắt (FeNPs), giúp gia tăng khả năng hấp thu khoáng chất, hoàn thiện giải phẫu rễ và nâng cao hàm lượng chlorophyll ở cây con in vitro.

Những đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Thiết lập quy trình khử trùng bề mặt mẫu lá an toàn sinh học bằng AgNPs, thay thế hoàn toàn hóa chất độc hại $\text{HgCl}_2$ và $\text{Ca(ClO)}_2$, bảo vệ sức khỏe kỹ thuật viên phòng thí nghiệm và môi trường.
2. Xây dựng hoàn chỉnh ba quy trình vi nhân giống có bổ sung AgNPs và FeNPs cho cây hoa salem, cây dâu tây và cây sâm Ngọc Linh. Quy trình giúp tạo cây giống có bộ rễ khỏe, thân cứng cáp, tăng tỷ lệ sống sót và tốc độ sinh trưởng khi đưa ra giai đoạn vườn ươm và nhà kính.
3. Dẫn liệu thực nghiệm chứng minh củ sâm Ngọc Linh in vitro được tạo ra từ quy trình ứng dụng nano kim loại sinh trưởng ổn định sau 24 tháng nuôi trồng trong nhà kính và tích lũy đầy đủ 3 loại saponin đặc trưng ($\text{G-Rg1}$, $\text{M-R2}$, $\text{G-Rb1}$).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Các cơ chế tương tác ở cấp độ phân tử, quá trình biến nạp sinh học và chuyển hóa chi tiết của hạt nano kim loại sau khi đi vào nội bào thực vật chưa được khảo sát sâu do giới hạn của các công nghệ phân tích sinh học phân tử hiện hành đối với hạt nano; đồng thời phạm vi theo dõi cây sâm Ngọc Linh mới dừng ở mốc 24 tháng trong điều kiện nhà kính.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng nghiên cứu ứng dụng AgNPs và FeNPs trong các hệ thống nuôi cấy tự động hóa quy mô công nghiệp (hệ thống thoáng khí tự nhiên, hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời); tiếp tục theo dõi sự tích lũy sinh khối và hàm lượng saponin của sâm Ngọc Linh ở các giai đoạn tuổi lớn hơn (3–5 năm) ngoài thực địa rừng tự nhiên.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học thực vật, Nông học, Lâm nghiệp tham khảo làm tài liệu chuyên khảo về công nghệ nano sinh học (nanobiotechnology) và nuôi cấy mô tế bào thực vật.
  • Giảng viên đại học: Sử dụng làm giáo trình giảng dạy chuyên đề vi nhân giống nâng cao, sinh lý thực vật in vitro và ứng dụng vật liệu mới trong nông nghiệp công nghệ cao.
  • Các doanh nghiệp, cơ sở sản xuất giống thương mại: Ứng dụng quy trình khử trùng và bổ sung nano kim loại để nâng cao chất lượng xuất vườn cho cây giống hoa salem, dâu tây và dược liệu sâm Ngọc Linh.
• Phần đáng tham khảo nhất: Quy trình công nghệ khử trùng bằng AgNPs; các công thức nồng độ phối hợp giữa AgNPs và FeNPs trong giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh; phương pháp định lượng ethylene bằng GC kết hợp đo AAS xác định hàm lượng kim loại hấp thụ.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Kích thước và phương pháp chế tạo hạt AgNPs và FeNPs sử dụng trong luận án là gì?

Hạt AgNPs có kích thước từ 20–25 nm, được tổng hợp bằng phương pháp khử dung dịch nước từ tiền chất $\text{AgNO}_3$ với tác nhân khử $\text{NaBH}_4$ và chất ổn định chitosan. Hạt FeNPs có kích thước từ 20–60 nm, được chế tạo từ tiền chất $\text{FeSO}_4$ với tác nhân khử $\text{NaBH}_4$ và chất ổn định carboxymethyl cellulose (CMC). Cả hai dung dịch do Viện Công nghệ Môi trường cung cấp ở nồng độ gốc 1000 ppm.

2. Bằng chứng thực nghiệm nào chứng minh AgNPs ức chế sự tích lũy khí ethylene?

Luận án sử dụng hệ thống sắc ký khí GC-CP 3380 để đo nồng độ khí ethylene tích lũy trong bình nuôi cấy kín và phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS-6650 để đo hàm lượng Ag hấp thu trong mô cây. Kết quả cho thấy khi nồng độ AgNPs bổ sung thích hợp làm tăng lượng bạc hấp thu vào mô thì nồng độ khí ethylene tự do trong bình nuôi cấy giảm tỷ lệ nghịch tương ứng ở cả ba loài salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh.

3. Việc thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs mang lại hiệu quả gì cho cây con in vitro?

FeNPs giúp cung cấp nguồn sắt ổn định, không bị kết tủa ở dải pH biến động như $\text{Fe-EDTA}$. Cây con được nuôi cấy trên môi trường FeNPs có hệ thống rễ phát triển vượt trội (số lượng rễ nhiều hơn, rễ dài và bền chắc hơn), cấu trúc mạch dẫn hoàn thiện hơn khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét SEM, đồng thời làm tăng hàm lượng chlorophyll đo bằng chỉ số SPAD.

4. Kết quả nuôi trồng ex vitro cây sâm Ngọc Linh sau 2 năm trong nhà kính ghi nhận những chỉ tiêu nào?

Sau 24 tháng nuôi trồng trong nhà kính, cây sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ nghiệm thức in vitro bổ sung nano đạt tỷ lệ sống cao, hình thành củ hoàn chỉnh với khối lượng tươi phát triển tốt; phân tích HPLC xác nhận sự hiện diện và tích lũy ổn định của cả 3 hợp chất saponin khung dammaran chủ yếu là Ginsenoside Rg1 ($\text{G-Rg1}$), Majonoside R2 ($\text{M-R2}$) và Ginsenoside Rb1 ($\text{G-Rb1}$).

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Đỗ Mạnh Cường là công trình nghiên cứu thực nghiệm toàn diện về việc ứng dụng hạt nano bạc (AgNPs) và nano sắt (FeNPs) vào quy trình vi nhân giống ba loài cây trồng có giá trị kinh tế gồm salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả khử trùng thay thế $\text{HgCl}_2$, làm rõ cơ chế ức chế khí ethylene nội sinh của AgNPs và khả năng cung cấp dinh dưỡng khoáng vượt trội của FeNPs so với nguồn $\text{Fe-EDTA}$ truyền thống. Các kết quả theo dõi sinh trưởng ex vitro và định lượng hoạt chất saponin củ sâm Ngọc Linh 24 tháng tuổi cung cấp cơ sở khoa học và quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh phục vụ công tác sản xuất giống thương mại quy mô lớn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VI NHÂN GIỐNG 1. Khái niệm vi nhân giống Vi nhân giống là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận khác nhau của thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng thực vật, đường và chất làm đông. Trong mấy thập kỷ qua, vi nhân giống đã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới, được ứng dụng trong sản xuất thương mại, đồng thời có thể duy trì và bảo quản được nhiều giống cây quí hiếm hoặc phục tráng giống [19].

Các giai đoạn trong vi nhân giống thực vật 1. Khử trùng bề mặt Khử trùng mẫu cấy là giai đoạn có nhiều tác nhân cần được kiểm soát như địa điểm thu nhận, độ sạch, khối lượng trung bình, độ tuổi khai thác và tình trạng sinh trưởng của cây. Mặc dù, khi đã kiểm soát được các tác nhân trên thì sự nhiễm nấm và khuẩn vẫn ảnh hưởng đến tỷ lệ thành công của giai đoạn này. Vì vậy, các phương pháp khác nhau đã được phát triển trong vài năm qua, có thể kể đến như cải tiến dụng cụ, hoặc sử dụng các hoá chất khử trùng.

Street (1974) đã đưa ra các chất hoá học, nồng độ khử trùng và thời gian xử lý mẫu cấy để loại bỏ các yếu tố gây nhiễm được thể hiện trong Bảng 1. Như vậy, có thể thấy Ca(ClO)2, HgCl2 và kháng sinh là ba chất khử trùng được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô thực vật [150]. Ca(ClO)2 có tác dụng ức chế nấm mốc và vi khuẩn bằng cách ăn mòn thành tế bào hay tác động lên hệ enzyme của vi khuẩn. Vì vậy, nó được sử dụng như một chất để khử trùng khi đưa các nguồn mẫu ban đầu từ điều kiện ex vitro vào nuôi cấy in vitro.

Mặt khác, các mô tế bào thực vật cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với Ca(ClO)2; ngoài ra, sức khoẻ con người cũng bị ảnh hưởng khi nuốt hay hít phải Ca(ClO)2 [167]. HgCl2 là một dạng muối của thuỷ ngân, hiện được sử dụng phổ biến trong quy mô phòng thí nghiệm. Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, Hussanin và cộng sự (1994) đã thành công khi sử dụng HgCl2 như là một chất giúp chống lại các vi khuẩn và nấm 5 luan an trong giai đoạn vào mẫu ban đầu [77]; nhưng muối thuỷ ngân này lại rất độc - có thể gây tổn thương não và gan khi con người tiếp xúc hay nuốt phải [167]. Về mặt lý thuyết, dường như tất cả các vấn đề nhiễm bẩn có thể được kiểm soát, nhưng sau một thời gian lại bùng phát trở lại.

Trong hầu hết các trường hợp này chất kháng sinh được sử dụng để làm giảm vấn đề, nhưng các chất này thường gây độc tế bào hoặc có thể làm chậm, ức chế sự phát triển mô thực vật và xuất hiện hiện tượng vi sinh vật kháng chất kháng sinh [35], [147]. Trong những năm gần đây, việc sử dụng các hoá chất trên đã có một số thành công nhất định trong vi nhân giống thực vật. Đặc biệt, trên các đối tượng cây salem và dâu tây các nghiên cứu này thường tập trung vào ảnh hưởng của nguồn mẫu, chất khử trùng, nồng độ và thời gian xử lý lên quá trình khử trùng bề mặt (Bảng 1. Tác nhân khử trùng, nồng độ kết hợp với thời gian xử lý trong khử trùng mẫu cấy Chất khử trùng Nồng độ (g/L) Thời gian (phút) Ca(ClO)2 90 – 100 5 – 30 HgCl2 1 – 10 2 – 10 Sodium hypochlorite (NaOCl) 10 – 30 5 – 30 Nước oxy già (H2O2) 100 – 120 5 – 15 Nước brom (Br2) 10 – 20 2 – 10 Chất kháng sinh 0,004 – 0,05 30 – 60 Bảng 1.

Một số nghiên cứu khử trùng bề mặt mẫu cấy trên cây salem và dâu tây Loài thực vật Vật liệu Chất khử trùng Nguồn (nồng độ × thời gian) Salem (Limonium Chồi đỉnh HgCl2 (1 g/L × 5 phút) [83] sinuatum) Dâu tây (Fragaria Chồi đỉnh HgCl2 (1 g/L × 4 phút) [79] × ananassa của ngó, Duch.) đoạn thân bò mang chồi 6 luan an Dâu tây (Fragaria Chồi đỉnh, NaOCl (5 g/L × 15 phút) [111] × ananassa đoạn thân Duch.) bò mang chồi, cuống lá Dâu tây (Fragaria Đoạn thân Thuốc diệt nấm (10 mL/L × 2 [122] × ananassa bò mang giờ); ciprofloxacin (200 g/L × 1 Duch.) chồi giờ); Tween 20 (2 giọt × 5 phút); cồn (70% × 5 phút); HgCl2 (1 g/L × 5 phút) Dâu tây (Fragaria Đỉnh sinh NaOCl (5 g/L × 15 phút) [111] × ananassa trưởng Chandler, Osogrande, Islamabad Local) Dâu tây (Fragaria Đỉnh sinh NaOCl (1 g/L × 15 phút) [111] × ananassa trưởng Chandler) Dâu tây (Fragaria Lá non NaOCl (4 g/L × 20 phút) [21] × ananassa Festivsl) Dâu tây (Fragaria Lá non NaOCl (3 g/L × 20 phút) [21] × ananassa Albion) 1. Phát sinh hình thái Cảm ứng mô sẹo Cảm ứng mô sẹo là một trong những kỹ thuật cơ bản của vi nhân giống thực vật. Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hoá dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, chất điều hoà sinh trưởng thực vật). Các tế bào thuộc mô và cơ quan này phải trải qua quá trình phân hoá trước lần phân chia đầu tiên cho phép tế bào trở lại trạng thái “trẻ hoá” giúp tế bào tái lập khả năng phân chia trong các điều kiện thích hợp [70].

Nhìn chung, cảm ứng mô sẹo thông qua 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia và biệt hoá tế bào. Trong giai đoạn phát sinh mô sẹo, sự trao đổi các chất kích thích dẫn đến sự phân chia tế bào, độ dài của giai đoạn này phụ thuộc vào tình trạng 7 luan an sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Vào giai đoạn tiếp theo của quá trình hình thành mô sẹo thì các tế bào phân chia tăng nhanh sinh khối. Sau đó, tế bào đi vào quá trình biệt hoá dẫn đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao.

Mô sẹo khi hình thành thường gồm hai loại: (1) mô sẹo xốp - chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và không bào to; (2) mô sẹo cứng thì ngược lại - các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ [20]. Nuôi cấy mô sẹo xốp được ứng dụng rộng rãi trong vi nhân giống: (1) vi nhân giống ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc không thực hiện được; (2) làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, tế bào trần, phát sinh phôi, tái sinh chồi, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học; (3) làm nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: tế bào đột biến, chịu mặn, kháng sâu bệnh [20]. Nuôi cấy huyền phù tế bào Nuôi cấy huyền phù tế bào là phương thức nuôi tế bào đơn hay cụm nhiều tế bào ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng. Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo ở môi trường lỏng chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy.

Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng. Ở đó chúng sinh trưởng, phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào. Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào. Điều kiện quan trọng của nuôi cấy huyền phù tế bào là môi trường nuôi cấy được khuấy lắc liên tục với tốc độ 100 – 150 vòng/phút.

Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mô sẹo và các tế bào chết. Sự tái sinh thực vật từ huyền phù tế bào là giai đoạn quan trọng cho phép thực hiện nhân giống in vitro ở mức độ công nghiệp, cũng như mọi thao tác ở mức độ tế bào [156]. Khi phát triển trong môi trường lỏng, các tế bào đơn của thực vật thường trải qua 4 giai đoạn: thích nghi, tăng trưởng, cân bằng và suy vong. Giai đoạn thích nghi là giai đoạn đầu tiên, nó kéo dài cho tới khi có tín hiệu phân chia đầu tiên.

Ở giai đoạn này không xảy ra sự tăng khối lượng và số lượng tế bào. Giai đoạn này được xem là giai đoạn thích ứng của tế bào với môi trường nuôi cấy trước khi sự sinh trưởng của 8 luan an tế bào bắt đầu. Tiếp theo là giai đoạn tăng trưởng, ở giai đoạn này các tế bào phân chia và tăng khối lượng với tốc độ lớn nhất (số lượng tế bào tăng lên theo hàm số mũ). Sau giai đoạn tăng trưởng là giai đoạn cân bằng, sự sinh trưởng của tế bào diễn ra ổn định, số lượng tế bào sinh ra bằng số lượng tế bào chết đi.

Cuối cùng là giai đoạn suy vong, sự sinh trưởng của tế bào giảm xuống và dẫn đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyền [7]. Phát sinh phôi vô tính Phôi vô tính chứa chất dinh dưỡng tương tự như phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây. Các mô và cơ quan sinh dưỡng nuôi cấy in vitro tạo ra phôi vô tính thông qua quá trình tạo mô sẹo trung gian. Tế bào mô sẹo có thể phân chia theo cấp số nhân, nhờ vậy, chỉ sau một thời gian ngắn có thể tạo được một số lượng phôi đáng kể.

Cho đến nay, trên 200 loài cây trồng đã được nhân giống thành công bằng công nghệ phôi vô tính. Phôi vô tính có thể bảo quản lâu dài và cho nảy mầm vào thời vụ thích hợp. Công nghệ tạo phôi vô tính hiện vẫn đang là công nghệ tiên tiến trên thế giới [19]. Sự tái sinh thực vật thông qua con đường phát sinh phôi vô tính bao gồm 5 giai đoạn [10]: - Nuôi cấy tạo phôi bằng cách chọn lựa mẫu cấy sơ cấp và cấy vào môi trường bổ sung chất điều hoà sinh trưởng, chủ yếu là auxin (đôi khi là cytokinin).

- Tăng sinh của quá trình nuôi cấy phôi trên môi trường rắn hoặc lỏng có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng tương tự như trên. - Giai đoạn trước khi trưởng thành của phôi trong môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng để ngăn sự tăng sinh và kích thích sự tạo phôi. - Giai đoạn phôi trưởng thành bằng cách nuôi cấy phôi trong môi trường bổ sung ABA và/hoặc giảm áp lực thẩm thấu. - Sự phát triển của cây trên môi trường nuôi cấy không có chất điều hoà sinh trưởng.

Phôi vô tính được sử dụng trong các nghiên cứu phôi học và kỹ thuật di truyền.