MỞ ĐẦU 1. Ở Việt Nam hiện nay đang trong thời kì phát triển kinh tế, các hoạt động kinh tế và sản xuất làm thay đổi môi trƣờng một cách nhanh chóng, cùng với đó là điều kiện khí hậu nóng ẩm nhiệt đới. Điều này đã dẫn đến sự xuất hiện nhiều loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm gây thiệt hại về kinh tế cũng nhƣ sức khỏe con ngƣời nhƣ : vi khuẩn tả lợn (Vibrio cholera), vi khuẩn gây bệnh viêm phổi lợn, vi khuẩn gây bệnh đƣờng tiêu hóa(Salmonella, E. coli)… Trong khi đó, việc sử dụng lạm dụng các chất kháng sinh dẫn đến tình trạng gia tăng các chủng kháng thuốc trong quần thể.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy tỷ lệ cao các chủng E. coli và Salmonella đa kháng đƣợc phát hiện trong các nguồn thức ăn ở Việt Nam [13] [21] [19]. Đây là một trong những nguyên nhân dẫn đến việc bùng phát dịch bệnh ngộ độc thức phẩm hằng năm ở nƣớc ta. Trƣớc tình hình trên, nhu cầu sử dụng vaccine ở nƣớc ta là rất lớn.
Tuy nhiên, số lƣợng vaccine đƣợc sản xuất ở nƣớc ta còn hạn chế. Vaccine sản xuất ở Việt Nam chủ yếu là vaccine vi sinh vật bất hoạt. Tuy nhiên số lƣợng sản xuất không đủ để đáp ứng khi dịch bệnh bùng phát. Các nghiên cứu cần đƣợc thực hiện để tìm ra các phƣơng pháp chế tạo vaccine mới với thời gian sản xuất ngắn và độ an toàn cao, nhằm giải quyết tình trạng dịch bệnh ở nƣớc ta.
Vỏ tế bào vi khuẩn rỗng là một bƣớc tiến mới về khoa học, cũng nhƣ trong y học động vật. Vỏ tế bào khuẩn rỗng có thể đƣợc dùng để chế tạo ra một loại vaccine mới với nhiều ƣu điểm hơn, việc tạo ra vỏ vi khuẩn rỗng và đóng gói nó tƣơng đối đơn giản [26]. Đặc biệt nữa là loại vaccine đƣợc chế tạo từ vỏ vi khuẩn rỗng không cần bảo quản ở kho lạnh nên giảm đƣợc chi phí n 2 vận chuyển và sử dụng, do chúng có thể tiến hành đông cô và bảo quản ở nhiệt độ bình thƣờng [11]. Giúp tiết kiệm chi phí và thời gian cho ngƣời sử dụng.
Cách thức tạo vi khuẩn rỗng hiện nay chủ yếu là sử dụng các kĩ thuật chuyển gen và kĩ thuật di truyền. Phƣơng pháp này hiệu quả nhƣng có thể chứa nhiều nguy cơ tạo ra các chủng siêu vi khuẩn hay các loại vi khuẩn mới khó kiểm soát. Do đó, dƣới sự phát triển của khoa học kĩ thuật cũng nhƣ kinh nghiệm từ nghiên cứu của một số tác giả, đã nghiên cứu các phƣơng pháp hóa học để sản xuất vỏ tế bào vi khuẩn rỗng. Nguyên lý của phƣơng pháp dựa trên khả năng phá vỡ thành tế bào vi khuẩn của một số chất hóa học ở nồng độ xác định.
Năm 2003, Amara và cs đã thành công sản xuất vỏ tế bào vi khuẩn rỗng từ vi khuẩn E .coli ở pha cân bằng [6] qua đây ta có thể “Tối ƣu hóa các điều kiện để tạo vỏ vi khuẩn rỗng (Bacterial ghost) sử dụng tác nhân hóa học” phƣơng pháp này có thể là hƣớng phát triển đúng đắn và tránh đƣợc các nguy cơ rủi ro. Việc hoàn thiện quy trình và nắm bắt đƣợc phƣơng pháp tái tạo này, sẽ mở ra bƣớc tiến lớn về sinh học cũng nhƣ trong y học động vật, y học của ngƣời. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài. Mục tiêu của đề tài.
Lựa chọn các tác nhân hóa học cho hiệu suất tạo vỏ tế bào vi khuẩn rỗng cao nhất và tối ƣu hóa quy trình tạo vỏ tế bào vi khuẩn rỗng. Đối tƣợng vi khuẩn đƣợc lựa chọn trong đề tài này là một chủng Salmonella spp. thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, một trong những nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ở nƣớc ta. Yêu cầu của đề tài.
- Tìm ra nồng độ vi khuẩn cho số lƣợng vỏ tốt nhất và nhiều nhất. - Độ sống sót của vi khuẩn rỗng sau quá trình tạo thành bị bất hoạt 100%. - Hình thái vỏ rỗng không bị vỡ nát, nguyên vẹn và có độ rỗng cao nhất có thể. Ý nghĩa của đề tài.
- Ý nghĩa trong khoa học: + Quá trình nghiên cứu sẽ đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của một số tác nhân hóa học đến khả năng tạo vỏ vi khuẩn rỗng trên một chủng vi khuẩn Salmonella spp. + Dần tối ƣu các điều kiện để hoàn thiện quy trình tạo vỏ rỗng vi khuẩn sử dụng tác nhân hóa học. + Cung cấp tài liệu tham khảo, nghiên cứu cho sinh viên, giúp sinh viên hoàn thiện cả về kiến thức lý thuyết lẫn thực tiễn. - Ý nghĩa trong thực tiễn: + Tái tạo thành công vỏ vi khuẩn rỗng từ một số loại vi khuẩn gây bệnh, từ đó cung cấp nguồn nguyên liệu để chế tạo vaccine dùng trong y học thú y và sau đó là trên ngƣời.
+ Có thể tạo ra một dòng vaccine thế hệ mới với nhiều đặc tính ƣu việt hơn nhƣ sản xuất nhanh, hiệu lực cao và tiết kiệm chi phí, trƣớc tình hình phát triển của các loại bệnh đang tăng cao. + Có thế chế dùng vỏ tế bào vi khuẩn rỗng để chế tạo thành chất mang thuốc, hay thuốc dẫn. n 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về vi khuẩn.
Đặc điểm hình thái và cấu tạo. Hình thái vi khuẩn. - Vi khuẩn (bacteria) là những VSV đơn bào, không có màng nhân (prokaryote), chúng có cấu trúc và hoạt động đơn giản hơn nhiều so với các tế bào có màng nhân (eukaryote), kích thƣớc của vi khuẩn đƣợc tính bằng đơn vị micromet (. - Dựa theo hình thái bên ngoài, có thể chia vi khuẩn làm 5 loại hình khác nhau: cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn, xoắn khuẩn và phảy khuẩn.
- Kích thƣớc của cầu khuẩn thay đổi trong khoảng từ 0,5-1,0 (1 = 10-3 m). - Cầu khuẩn đƣợc chia ra thành các giống chính sau đây: + Giống đơn cầu khuẩn (Micrococcus, Monococcus) Thƣờng đứng riêng lẻ từng tế bào một, đa số sống hoại sinh trong đất, nƣớc và không khí nhƣ Micrococcus agilis, Micrococcus roseus, Micrococcus leuteus. + Giống song cầu khuẩn (Diplococcus) Là những cầu khuẩn đứng thành đôi, một số loại diplococcus có khả năng gây bệnh nhƣ mô não cầu khuẩn (Niseria menigitidis), lậu cầu khuẩn (Niseria gonorrrhoeae) [3]. n 5 + Giống liên cầu khuẩn (Streptococcus) Là những cầu khuẩn đứng thành từng chuỗi dài nhƣ liên cầu khuẩn sinh mủ (Streptococcus pyogenes).
Trong giống này còn có loại liên song cầu khuẩn (Streptodiplococcus), tức song cầu khuẩn tập hợp từng đôi một thành từng chuỗi dài. Đây là loại vi khuẩn gây bệnh thƣờng hay gặp. + Giống tứ cầu khuẩn (Tetracoccus) Là những cầu khuẩn đứng thành từng nhóm bốn tế bào một. Tứ cầu khuẩn thƣờng sống hoại sinh, song cũng có loài có khả năng gây bệnh cho động vật nhƣ Tetracoccus homeri.
+ Giống bát cầu khuẩn (Sarcina) Là những cầu khuẩn đứng thành những khối gồm 8 hoặc 16 tế bào. Trong không khí thƣờng gặp một số loài nhƣ Sarcina lutea, Sarcina aurantiaca. + Giống tụ cầu khuẩn (Straphilococcus, Staphylococci) Là những cầu khuẩn đứng thành từng đám giống nhƣ chùm nho. Đa số tụ cầu khuẩn sống hoại sinh, một số có thể gây bệnh cho ngƣời và động vật nhƣ Staphilococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.
b) Trực khuẩn (Bacillus) - Là tên chung để chỉ các loài vi khuẩn có hình que, hình gậy, đầu tròn hay hình vuông, kích thƣớc của trực khuẩn 0,5-1 1-5. Những trực khuẩn hay gặp thuộc các giống sau: + Bacillus Là trực khuẩn gram dƣơng, sống hảo khí, sinh nha bào, chiều ngang của nha bào không vƣợt quá chiều ngang của vi khuẩn, do đó khi có nha bào, tế bào vi khuẩn không thay đổi hình dạng. Ví dụ: trực khuẩn nhiệt thán (Bacillus anthracis). n 6 + Bacterium Là trực khuẩn gram âm, sống hảo khí, không sinh nha bào, thƣờng có lông ở quanh thân vi khuẩn, có nhiều loại Bacterium gây bệnh cho ngƣời và gia súc nhƣ trực khuẩn đƣờng ruột.
Ví dụ: Salmonella, Escherichia shigella, Proteus…. + Clostridium Là trực khuẩn gram dƣơng hai đầu tròn, sống kị khí, kích thƣớc khoảng 0,4-1 3-8 , sinh nha bào, chiều ngang của nha bào thƣờng lớn hơn chiều ngang của vi khuẩn, do đó khi mang nha bào thì vi khuẩn bị biến đổi hình dạng nhƣ hình thoi, hình vợt, hình dùi trống. Có nhiều loại gây bệnh cho ngƣời và động vật nhƣ trực khuẩn gây bệnh cho ngƣời và động vật nhƣ trực khuẩn uốn ván (Clostridium chauvoei), trực khuẩn gây bệnh ngộ độc thịt (Clostridium botulium), trực khuẩn hoại thƣ sinh hơi (Clostridium pefringens), nhƣng cũng có loài rất có ích nhƣ trực khuẩn cố định nitơ (Clostridium pasteurianum)…… Hình 1: Hình thái các loại vi khuẩn [3] n 7 1) Đơn cầu khuẩn; 2) Song cầu khuẩn; 3) Liên cầu khuẩn; 4) Tụ cầu khuẩn; 5) Bát cầu khuẩn; 6) Trực khuẩn; 7) Cầu trực khuẩn; 8) Xoắn khuẩn c) Cầu trực khuẩn (Cocco-bacillus) Là loại vi khuẩn trung gian giữa cầu khuẩn và trực khuẩn, có hình bầu dục, hình trứng, có kích thƣớc khoảng 0,25-0,3 0,4-1,5 , ví dụ: vi khuẩn tụ huyết trùng (Pasteurella), vi khuẩn dịch hạch. d)Xoắn khuẩn (Spirochoetales) Là những vi khuẩn có hình lƣợn sóng, gồm các vi khuẩn có từ hai vòng xoắn trở lên, bắt màu gram dƣơng, di động đƣợc nhờ có một hay nhiều tiên mao mọc ở đỉnh.
Kích thƣớc của xoắn khuẩn thay đổi trong khoảng 0,5-3,0 5-40 , ví dụ: Treponemma detina, Siprium rubrum, Leptospira canicola, Leptospira Pomona [3]. e) Phảy khuẩn (Vibrio) Là tên chung để chỉ các vi khuẩn có hình que uốn cong, có hình giống nhƣ dấu phảy, hình lƣỡi liềm.Phần lớn phảy khuẩn sống hoại sinh, mốt số ít có khả năng gây bệnh nhƣ phảy khuẩn trùng tả, nhƣ Vibrio cholera. Cấu tạo tế bào vi khuẩn. Tính từ ngoài vào trong, cho thấy : Hình 2: Cấu tạo tế bào vi khuẩn [3] n 8 1) Tiên mao; 2) Nhân; 3) Màng nguyên sinh chất Tiêm mao; 4) Lớp vỏ nhày; 5) Thành tế bào vi khuẩn; 6) Riboxom; 7) Tiêm mao; 8) Nhân gốc a) Tiên mao (Flagellum): Nhờ có tiên mao (roi) mà vi khuẩn di chyển đƣợc.
Một tế bào có thể có 1 hoặc vài tiên mao, kích thƣớc dao động 0,01- 0,03 4-100. Có 3 loại tiên mao: đơn mao, chùm mao và chu mao. Thành phần hóa học của tiên mao chủ yếu là protein, chiếm > 90%, phần còn lại là các chất vô cơ. b) Nhân gốc: vai trò điều khiển tiên mao di động theo các hƣớng khác nhau.
c) Tiêm mao: đó là các lông tơ phủ ngoài cùng của tế bào vi khuẩn, có tác dụng bảo vệ tế bào và là chỗ bám khi 2 tế bào tiếp hợp với nhau, ở giai đoạn trƣởng thành, 1 tế bào có tới vài nghìn tiêm mao. Thành phần hóa học của tiêm mao chủ yếu là protein. d) Lớp vỏ nhày (lớp dịch nhày): Là lớp dịch đƣợc phủ phía bên ngoài của tế bào vi khuẩn.