MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Hàng năm, các bệnh cây trồng đã gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp. Theo tổ chức nông lƣơng liên hợp quốc (FAO, 2004), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm gây ra đến 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm khoảng 11,6% tổng sản lƣợng nông nghiệp trên thế giới. Trong đó chiếm 83% là bệnh do vi nấm gây ra, chủ yếu là các bệnh nhƣ: đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sƣơng… đặc biệt bệnh do nấm Fusarium và Rhizoctonia gây ra chiếm tỉ lệ tƣơng đối lớn.
Hiện nay, các biện pháp hóa học vẫn đƣợc sử dụng rất phổ biến và rộng rãi với một lƣợng rất lớn vì nó mang lại hiệu quả phòng trừ cao, rẻ tiền. Tuy nhiên bên cạnh đó, nó cũng gây ra những tác hại rất to lớn đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời, tạo ra sự kháng thuốc với nhiều loại bệnh hại. Vì vậy gây nên nhiều khó khăn trong công tác phòng trừ bệnh. Để khắc phục những nhƣợc điểm do biện pháp hóa học gây ra nhƣ trên, hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, việc sử dụng các chế phẩm sinh học thay thế một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh cây trồng do vi sinh vật gây ra đang là xu hƣớng chủ yếu.
Chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng có tác dụng tích cực đối với nông nghiệp, ƣu việt hơn so với việc dùng thuốc hóa học. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho ngƣời sản xuất nhƣ: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu tƣ, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trƣờng sinh thái, không ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời và vật nuôi, góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả. Vi khuẩn Bacillus theo nhiều tài liệu đã công bố đƣợc biết đến với vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau nhƣ các chất kháng sinh, download by : skknchat@gmail.com 2 lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin.
Một số chủng Bacillus subtilis đã đƣợc ứng dụng để kiểm soát bệnh cây trồng do nấm gây ra. Việc nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây trồng bằng các chế phẩm sinh học đã đƣợc hình thành và phát triển ở Việt Nam nhƣng vẫn còn nhiều hạn chế. Các chế phẩm dƣới dạng tinh sạch tách chiết từ vi sinh vật mới nghiên cứu chủ yếu ở trong phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất thử nên giá thành còn cao. Các sản phẩm trên thị trƣờng chủ yếu là các sản phẩm có chứa tế bào vi sinh vật đối kháng nên thời gian hữu hiệu ngắn hiệu quả không cao.
Mặt khác, các sản phẩm sử dụng tế bào mang nguy cơ gây bệnh rất lớn cho con ngƣời. Vì vậy, để phát triển sản phẩm sinh học đạt độ tinh sạch cao để phòng chống nấm bệnh cây trồng là một vấn đề rất cấp thiết. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng B. subtilis AS có khả năng ức chế mạnh các nấm gây bệnh cây trồng nhƣ F.
Xuất phát từ những lý do trên và tình hình nghiên cứu ở Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện đề tài luận văn: "Tinh sạch các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus phân lập ở Việt Nam". Mục tiêu của đề tài - Tinh sạch hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm F. solani từ chủng B. - Đánh giá tính chất lý hóa của hợp chất đƣợc tinh sạch.
Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng ức chế sinh trƣởng và phát triển của dịch lọc ngoại bào vi khuẩn B. subtilis AS đối với hai chủng nấm F. - Tách chiết và tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ dịch lọc ngoại bào vi khuẩn B. - Đánh giá sự ảnh hƣởng của nhiệt độ, proteinase K, ức chế sợi tử bào nấm và nồng độ ức chế tối thiểu lên hoạt tính kháng nấm của protein tinh sạch đƣợc.
download by : skknchat@gmail.com 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái quát về chất đối kháng sinh trƣởng nấm Chất đối kháng sinh trƣởng nấm (Antifungal – compounds, AFC) là những chất có khả năng ức chế sự sinh trƣởng hoặc tiêu diệt sự phát triển của các loại nấm.Các chất này đã đƣợc ứng dụng để phòng và chữa trị các bệnh do nấm gây ra, đặc biệt là các loại nấm gây bệnh hại trên cây trồng nhƣ lạc, cà chua, đậu tƣơng, cây cà phê và nhiều loại cây khác. Các protein và peptide có hoạt tính kháng nấm đều đƣợc tách chiết phần lớn từ động vật, thực vật, vi khuẩn và nấm. Năm 1993, Lijima và cộng sự đã xác định đƣợc protein chống nấm Candida albicans, Shizosaccharomyces pombe có trong hemolymph của ấu trùng Sarcophaga (2,5 mg protein tinh khiết thu đƣợc từ 10ml hemolymph với nồng độ ức chế sự tăng trƣởng 50% là 30 pg/ml) [25].
Hoạt tính kháng nấm cũng đƣợc phát hiện ở thực vật nhƣ tính kháng nấm của heme preoxidase từ cây mây Acoru peroxidase có vai trò trong việc ức chế các sợi nấm của Phaseolina macrophomina, Fusarium moniliforme và trichosporium vesiculosum [23]. Một chất ức chế protease cysteine đƣợc công bố có khả năng kháng nấm từ hạt kê. Chất này ức chế mạnh hoạt động của nấm T. reesei một loại nấm gỗ, nồng độ tối thiểu để ức chế sự tăng trƣởng của sợi nấm hay bào tử nảy mầm là 1 µg/ml (250mg/đĩa).
Ngoài ra chúng còn ức chế một số loại nấm gây hại thực vật khác nhƣ: Claviceps, Helminthosprium, Curvularia, Alternaria và các loài thuộc chi Fusarium [27]. Một protein kháng nấm đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens MET0908 có khả năng kiểm soát sự sinh trƣởng của nấm Colletotrichum lagenarium gây bệnh trên dƣa hấu. Protein này còn có thể hoạt động đƣợc trên vách tế bào C. Đặc biệt hoạt chất kháng nấm còn đƣợc phân lập từ quả thể của nấm hypsizygus marmoreus là Hypsin một protein chịu nhiệt ức chế sự tăng trƣởng download by : skknchat@gmail.com 4 của sợi nấm trong các loài nấm khác nhau bao gồm Mycosphaerella arachidicola, Physalospora piricola, F.
oxyproum, và Botrytis cinerea với giá trị IC50 tƣơng ứng là 2,7; 2,5; 14,2 và 0,06 µM [33]. Trong các nguồn trên thì các chất AFC tách chiết từ vi khuẩn thuộc các chi Bacillus đƣợc quan tâm nhiều hơn cả bởi tính phổ biến và thuận lợi trong tinh sạch. Các chủng Bacillus có rất nhiều đặc tính tốt nhƣ: dễ nuôi cấy, phổ biến, sinh trƣởng nhanh trong môi trƣờng lỏng, cho nhiều bào tử và đặc biệt chúng có khả năng tổng hợp nhiều chất đối kháng sinh trƣởng nấm. Các protein và peptide có khả năng kháng nấm đƣợc phân loại theo nhiều cách khác nhau, dựa vào cơ chế tác động có thể phân thành 3 loại đó là loại tác động vào vách tế bào nấm: (1) ức chế sự tổng hợp chitin và glucan, loại tác động vào màng tế bào nấm: (2) các chất gắn dính hay ức chế sự tổng hợp ergosterol của nấm và (3) loại tác động vào quá trình tổng hợp protein và acid nucleic của nấm.
Dựa vào cấu trúc hoặc chức năng, các protein và peptide có khả năng kháng nấm đƣợc phân loại thành nhiều lớp khác nhau, chẳng hạn nhƣ chitinase và chitinase-like protein [14], [34], ribonuclease [39], chất ức chế protease [27]. Peptide kháng nấm đầu tiên đƣợc tách chiết từ chủng Bacillus là iturin và bacillomycin. Chúng có cấu trúc peptidolipid mạch vòng và có khả năng kháng nấm và tan huyết [35]. Bacillus cũng chính là đối tƣợng vi khuẩn đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất hiện nay, chủng này sinh tổng hợp rất nhiều các polypeptide có hoạt tính kháng nấm và có tiềm năng trong việc kiểm soát các bệnh hại cây trồng do nấm gây ra cũng nhƣ trong sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm.
download by : skknchat@gmail. Vai trò của vi khuẩn B. subtilis trong kiểm soát sinh học 1. Đại cương về vi khuẩn B.
subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủng đƣợc sử dụng để phòng bệnh lị cho bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Đến năm 1949, khi Henry và các cộng sự tách đƣợc chủng thuần khiết của B. subtilis thì chúng mới đƣợc dùng để điều trị bệnh về rối loạn tiêu hóa.
Ngày nay, vi khuẩn B. subtilis đã trở nên phổ biến và đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học, thực phẩm… và đặc biệt là kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn B. subtilis thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillacea Chi: Bacillus Loài: B.
Hình thái khuẩn lạc chủng B.subtilis AS trên môi trƣờng PDA Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đƣờng ruột, chúng đƣợc phân bố hầu hết trong tự nhiên nhƣ: cỏ khô, bụi đất, nƣớc … phần lớn chúng tồn tại trong đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu CFU/g. subtilis là trực khuẩn hình que, hai đầu tròn, Gram dƣơng, kích thƣớc từ 0,5- 0,8 µm x 1,8-3µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động 8-12 lông. Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm ở giữa tế bào.
Kích thƣớc từ download by : skknchat@gmail. Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ấm, tia tử ngoại, phóng xạ. Điều kiện phát triển nuôi cấy là môi trƣờng hiếu khí , nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu là 37oC. Mặc dù là vi khuẩn hiếu khi nhƣng B.
subtilis có khả năng phát triển trong môi trƣờng thiếu oxi. pH thích hợp nhất khi nuôi cấy với pH=7,0- 7,4. Trên môi trƣờng thạch đĩa, khuẩn lạc chủng có dạng hình tròn, rìa răng cƣa không đều, có tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đƣờng kính 3-5mm. Sau 1-4 ngày thì bề mặt nhẵn và chuyển sang màu hơi sẫm.
Trên môi trƣờng thạch nghiêng chủng dễ mọc tạo thành màu xám rìa gợn sóng. Trên môi trƣờng lỏng chủng phát triển làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng cặn lại nhƣ vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm Chủng Bacillus Vi khuẩn Bacillus theo nhiều tài liệu đã công bố đƣợc biết đến với vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh tồng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau nhƣ các chất kháng sinh, lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin [29], [46], [47], [50].
Một số chủng B.