Biểu hiện tinh sạch và xác định tính chất của enzym cytochrom p450 từ vi khuẩn streptomyces cavourensis ybq59 tái tổ hợp trong escherichia coli

Chuyên khảo phân tích Biểu hiện tinh sạch và xác định tính chất của enzym cytochrom p450 từ vi khuẩn streptomyces, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu tiếp

• Tác giả: Đinh Thùy Dương
• Người hướng dẫn: TS. Lý Thị Bích Thủy
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Tinh Sạch Enzym Cytochrom P450 Từ Streptomyces
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Định nghĩa và danh pháp
• 1.2. Vai trò và phân bố trong tự nhiên
• 1.3. Phân loại
• 1.4. Cấu trúc bậc I
• 1.5. Cấu trúc bậc II
• 1.6. Cấu trúc bậc III
• 1.7. Đặc điểm xúc tác
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
• 2.2. Thiết bị thí nghiệm. Môi trường
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp điện di SDS - PAGE
• 2.4.2. Tinh sạch cytochrom P450
• 2.4.3. Phương pháp Bradford
• 2.4.4. Xác định hàm lượng cytochrom P450
• 2.4.5. Xác định khả năng tương tác enzym – cơ chất
• 2.4.6. Xác định hằng số phân ly enzym – cơ chất
• 2.4.7. Xác định độ bền pH
• 2.4.8. Xác định độ bền nhiệt độ
• 2.4.9. Xác định độ bền theo thời gian bảo quản
• 2.4.10. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Biểu hiện và tinh sạch enzym cytochrom P450
• 3.2. Xác định khả năng tương tác của enzym với cơ chất dự đoán
• 3.3. Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng hoạt động của enzym
• 3.4. Về kết quả biểu hiện và tinh sạch cytochrom P450 tái tổ hợp từ Streptomyces cavourensis YBQ59 trong E.
• 3.5. Về kết quả nghiên cứu tương tác enzym – cơ chất
• 3.6. Về kết quả xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến nồng độ ở dạng hoạt động của cytochrom P450 tái tổ hợp
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về enzym cytochrom P450 từ Streptomyces

Enzym cytochrom P450 (CYP) là một nhóm enzym quan trọng trong quá trình chuyển hóa sinh học. Chúng có khả năng xúc tác cho nhiều phản ứng hóa học, đặc biệt là oxy hóa. Streptomyces là một nguồn phong phú của các enzym này, với nhiều chủng có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học. Việc nghiên cứu và tinh sạch enzym từ Streptomyces không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của chúng mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong y dược và công nghệ sinh học.

1.1. Định nghĩa và vai trò của enzym cytochrom P450

Enzym cytochrom P450 là một nhóm enzym monooxygenase, có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa các chất nội sinh và ngoại sinh. Chúng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học, đặc biệt là oxy hóa, giúp chuyển đổi các hợp chất thành dạng dễ hấp thu hơn. Sự đa dạng của CYP cho phép chúng xúc tác cho nhiều loại cơ chất khác nhau, từ thuốc đến các chất độc hại.

1.2. Tình hình nghiên cứu cytochrom P450 từ Streptomyces

Nghiên cứu về cytochrom P450 từ Streptomyces đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Các nghiên cứu cho thấy rằng có hơn 8500 gen mã hóa cho CYP trong bộ gen của Streptomyces, nhưng chỉ một phần nhỏ trong số đó được xác định chức năng. Việc khai thác các enzym này có thể mang lại nhiều lợi ích trong việc phát triển thuốc và các ứng dụng sinh học khác.

II. Thách thức trong việc tinh sạch enzym cytochrom P450

Mặc dù enzym cytochrom P450 có nhiều tiềm năng, nhưng việc tinh sạch chúng từ Streptomyces gặp phải nhiều thách thức. Các enzym này thường tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào và có thể bị phân hủy hoặc mất hoạt tính trong quá trình tách chiết. Hơn nữa, sự tương tác giữa enzym và cơ chất cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất tinh sạch.

2.1. Khó khăn trong quá trình tách chiết enzym

Quá trình tách chiết enzym cytochrom P450 từ Streptomyces thường gặp khó khăn do sự hiện diện của nhiều protein khác trong môi trường nuôi cấy. Việc sử dụng các phương pháp tách chiết không phù hợp có thể dẫn đến việc mất hoạt tính enzym hoặc thu được sản phẩm không tinh khiết.

2.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến enzym

Điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ và thời gian bảo quản có thể ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzym cytochrom P450. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là cần thiết để đảm bảo enzym được tinh sạch và giữ được hoạt tính cao nhất.

III. Phương pháp tinh sạch enzym cytochrom P450 hiệu quả

Để tinh sạch enzym cytochrom P450, nhiều phương pháp đã được áp dụng, bao gồm điện di SDS-PAGE, phương pháp Bradford và các kỹ thuật sắc ký. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để đạt được hiệu quả tối ưu.

3.1. Phương pháp điện di SDS PAGE

Phương pháp điện di SDS-PAGE là một kỹ thuật phổ biến để phân tách protein dựa trên kích thước. Kỹ thuật này cho phép xác định độ tinh khiết của enzym cytochrom P450 và giúp theo dõi quá trình tinh sạch. Kết quả từ SDS-PAGE có thể cung cấp thông tin quan trọng về sự hiện diện của enzym và các protein khác trong mẫu.

3.2. Phương pháp Bradford để xác định hàm lượng protein

Phương pháp Bradford là một kỹ thuật đơn giản và nhanh chóng để xác định hàm lượng protein trong mẫu. Kỹ thuật này dựa trên sự thay đổi màu sắc của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi liên kết với protein. Việc sử dụng phương pháp này giúp đánh giá hiệu quả của quá trình tinh sạch enzym cytochrom P450.

IV. Ứng dụng thực tiễn của enzym cytochrom P450

Enzym cytochrom P450 từ Streptomyces có nhiều ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực y dược và công nghệ sinh học. Chúng có thể được sử dụng để sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học, phát triển thuốc mới và cải thiện quy trình sản xuất dược phẩm. Việc nghiên cứu và ứng dụng enzym này có thể mang lại nhiều lợi ích cho ngành công nghiệp dược phẩm.

4.1. Ứng dụng trong sản xuất thuốc

Enzym cytochrom P450 có khả năng xúc tác cho nhiều phản ứng hóa học, giúp sản xuất các hợp chất dược phẩm mới. Việc sử dụng enzym này trong quy trình sản xuất thuốc có thể giảm thiểu các bước hóa học truyền thống, tiết kiệm thời gian và chi phí.

4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu sinh học

Nghiên cứu về enzym cytochrom P450 từ Streptomyces không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của chúng mà còn mở ra cơ hội cho các nghiên cứu sinh học khác. Các enzym này có thể được sử dụng như công cụ để nghiên cứu các quá trình sinh học phức tạp.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu enzym cytochrom P450

Nghiên cứu về enzym cytochrom P450 từ Streptomyces đang mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y dược và công nghệ sinh học. Việc tinh sạch và xác định tính chất của enzym này là bước quan trọng để khai thác tiềm năng của chúng. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn và giá trị cho ngành công nghiệp.

5.1. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, nghiên cứu về enzym cytochrom P450 từ Streptomyces sẽ tiếp tục được mở rộng. Các phương pháp mới sẽ giúp tối ưu hóa quá trình tinh sạch và xác định tính chất của enzym, từ đó khai thác hiệu quả hơn tiềm năng của chúng.

5.2. Tác động đến ngành công nghiệp dược phẩm

Nghiên cứu và ứng dụng enzym cytochrom P450 có thể tạo ra những bước đột phá trong ngành công nghiệp dược phẩm. Việc phát triển các sản phẩm mới từ enzym này không chỉ giúp cải thiện hiệu quả điều trị mà còn giảm thiểu tác dụng phụ của thuốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Định nghĩa và danh pháp Cytochrom P450 (thường viết tắt là CYP hay P450) thuộc họ enzym monooxygenase, xúc tác cho phản ứng gắn một nguyên tử oxy từ phân tử oxy vào cơ chất, và nguyên tử oxy còn lại bị khử thành nước (Hình 1. Tên gọi “cytochrom P450” xuất phát từ cấu trúc của enzym, “cyto” là tế bào, “chrom” là màu sắc, “cytochrom” là chất có màu sắc của tế bào; chữ “P” là viết tắt của từ “Pigment” có nghĩa là sắc tố, do enzym có màu hồng đỏ; và 450 nm là bước sóng mà tại đó khi ở trạng thái khử và gắn với CO thì enzym này đạt độ hấp thụ cực đại [5], [23]. Mô hình hệ thống cytochrom P450 ở ty thể [5] Một hệ thống danh pháp thống nhất theo quy ước của Ủy ban danh pháp quốc tế, dựa trên trình tự nhận dạng acid amin, tiêu chí phát sinh loài và tổ chức gen, đã được sử dụng để phân loại và gọi tên các CYP , [64].

Theo đó, những enzym này được gọi tên bởi cụm “CYP” và một chữ cái Ả Rập chỉ họ gen (với hơn 40% độ tương đồng về trình tự acid amin) (VD: CYP1, CYP2, CYP3), một chữ cái viết hoa biểu thị phân họ (với hơn 55% độ tương đồng về trình tự acid amin) (VD: CYP1A) và một chữ số Ả Rập biểu thị gen/isoenzym/isozym/isoform đơn lẻ (VD: CYP1A1). Ví dụ CYP1A1 có nghĩa là enzyme này thuộc họ 1, phân họ A và protein 1 [39]. Vai trò và phân bố trong tự nhiên CYP gồm hơn 13000 gen đại diện cho hơn 400 họ. Trong tự nhiên, chúng được tìm thấy phổ biến ở động vật, thực vật, nấm và vi khuẩn [39].

Số lượng CYP cao nhất ở thực vật, hệ gen của người có 57 gen mã hóa cho CYP và 58 pseudogen [23], Escherichia coli và Salmonella typhimurium không có enzym CYP nào [53]. CYP được tìm thấy lần đầu tiên ở các microsom của gan động vật vào năm 1962, và được phát hiện có mặt ở màng trong ty thể của các tế bào vỏ thượng thận vào năm 1964. Những nghiên cứu diễn ra sau đó khẳng định rằng CYP có sự phân bố khác nhau giữa microsom và ty thể ở nhiều mô động vật. Ở động vật có vú, CYP có mặt ở tất cả 2 các mô, với nồng độ cao tập trung ở gan và ruột non.

Đó là các protein liên kết màng có trong các microsom của gan, và trong ty thể của các tế bào ở các mô sản sinh steroid như là vỏ thượng thận, tinh hoàn, buồng trứng, vú, nhau thai [23]. Thực vật và nấm có chứa rất nhiều CYP ở trong các microsom, một số còn được tìm thấy ở trong lục lạp, tuy nhiên chưa có bất kỳ CYP nào được phát hiện có mặt trong ty thể của chúng [64]. Ở người có 50 CYP được tìm thấy ở microsom và 7 CYP được tìm thấy ở ty thể [47]. Đối với vi khuẩn, CYP tồn tại ở dạng enzym hòa tan và có mặt trong chất nền của ty thể.

Nói chung, CYP có vai trò trong chuyển hóa các chất nội sinh và ngoại sinh, khử các độc tố gây hại cho các cơ quan. Trong cơ thể, các enzyme cytochrom P450 tham gia vào các quá trình chuyển hóa acid béo, steroid, prostaglandins, terpen, các hợp chất đa nguyên tử và dị nguyên tử. CYP cũng tham gia xúc tác cho các phản ứng biến đổi các chất ngoại sinh như thuốc, chất gây ung thư, độc tố, dung môi hữu cơ [24]. Phân loại Có nhiều cách phân loại các CYP khác nhau như: theo cơ chất mà CYP tham gia chuyển hóa [50]; theo dạng tồn tại của CYP trong tế bào [50]; theo sự phân bố trong tế bào [41].

Trong đó, cách phân loại phổ biến nhất là theo các kiểu protein vận chuyển điện tử (redox partner) tham gia vào chuỗi truyền điện tử. Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme CYP sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua các thành viên của chuỗi truyền điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử. Do CYP rất đa dạng trong tự nhiên nên các protein vận chuyển điện tử của chúng cũng rất phong phú. Dựa trên các kiểu protein vận chuyển điện tử tham gia vào chuỗi truyền điện tử, Hannemann và cộng sự đã phân loại CYP thành 10 nhóm khác nhau (Bảng 1.

Cấu trúc CYP là các hemoproteins có cấu trúc gồm một nhân hem ở dạng Fe protoporfirin IX (Hình 1.2) và một chuỗi polypeptid có chứa 400 – 500 gốc acid amin. Nhân hem ở dạng Fe protoporfirin IX của cytochrom P450 3 Bảng 1. Phân loại cytochrom P450 dựa trên các protein thành phần tham gia vào chuỗi truyền điện tử [23] Nhóm Nguồn gốc Chuỗi truyền điện tử Vị trí, dạng tồn tại NAD(P)H–>[FdR]–> Tế bào chất, hòa tan Vi khuẩn [Fdx]a–> [P450] P450: màng trong ty thể 1 NADPH–>[FdR]–> FdR: liên kết màng Ty thể [Fdx]–> [P450] Fdx: chất nền ty thể, hòa tan NADH–>[CPR]–> Tế bào chất, hòa tan; Vi khuẩn [P450] Streptomyces carbophilus NADPH–>[CPR]–> Microsomal A Gắn màng, ER [P450] 2 NADPH–>[CPR]–> Microsomal B Gắn màng, ER [cytb5]–> [P450] NADH–> [cytb5Red] Microsomal C Gắn màng, ER –> [cytb5]–> [P450] NAD(P)H–>[FdR]–> Tế bào chất, hòa tan, Citrobacter 3 Vi khuẩn [Fldx]–> [P450] braakii Pyruvat,CoA–> Tế bào chất, hòa tan, Sulfolobus 4 Vi khuẩn [OFOR]–>[Fdx]–> tokadaii [P450] NADH–> [FdR] Tế bào chất, hòa tan, 5 Vi khuẩn –>[Fdx – P450] Methylococcus capsulatus NAD(P)H–>[FdR] Tế bào chất, hòa tan, 6 Vi khuẩn –>[Fldx – P450] Rhodococcus rhodochrous 11Y NADH–> Tế bào chất, hòa tan, Rhdococcus 7 Vi khuẩn sp NCIMB 9784, Burkholderia [PFOR – P450] sp., Ralstonia metallidurans NADPH–> Tế bào chất, hòa tan, Bacillus 8 Vi khuẩn, nấm [CPR – P450] megaterium, Fusarium oxysporum Chỉ sinh vật Tế bào chất, hòa tan, Fusarium 9 phụ thuộc NADH–> [P450] oxysporum NADH, nấm Sinh vật có hệ 10 vận chuyển [P450] Gắn màng, ER độc lập Chú thích: Fdx, Ferredoxin; FdR, Ferredoxin reductase (FAD); CPR, cytochrom P450 reductase (FAD, FMN); Fldx, Flavodoxin (FMN); OFOR, 2- oxoacid ferredoxin oxidoreductase (thiamin pyrophosphate, [4Fe-4S] cluster); PFOR, phthatate-family oxygenase reductase (FMN, [2Fe-2S] cluster). a Fdx có chứa nhóm Fe – S như là [2Fe-2S], [3Fe-4S], [4Fe-4S], [3Fe-4S]/[4Fe-4S].

4 Cấu trúc bậc I: Cấu trúc bậc I của protein là trình tự tất cả các acid amin trong phân tử, được sắp xếp thành chuỗi trong không gian hai chiều. Mặc dù trình tự acid amin giữa các CYP từ các họ khác nhau có sự tương đồng không quá 20%, nhưng tới năm 2006, có 3 vùng cấu trúc đã được xác định là bảo tồn chặt chẽ trong trình tự của tất cả các CYP có trong cơ sở dữ liệu chung. Phần cố định đầu tiên là phối tử Cys liên kết trục với Fe của nhân hem. Phối tử Cys này nằm trên một trình tự được coi là “chữ ký” nhận biết của CYP, gồm 10 acid amin FxxGxxxCxG, trong đó x là gốc acid amin bất kỳ, F là phenylalanin, G là glycine và C là cystein.

Về nguyên tắc thì các vị trí x có thể là bất kỳ acid amin nào, nhưng thực tế nhiều nghiên cứu chứng minh các vị trí đó chỉ là một số acid amin xác định. Trình tự bảo tồn khác là Glu và Arg cùng nhau tạo nên mô – típ EXXR được tìm thấy ở chuỗi xoắn K- helix. Ngoài ra, còn có hai vùng cấu trúc được bảo tồn cao ở CYP mặc dù không thực sự quan trọng là phân tử Thr ở chuỗi I – helix và phân tử Gly nằm cách phân tử Cys cố định 4 phân tử theo chiều ngược dòng [53]. Cấu trúc bậc II: Cấu trúc bậc 2 của CYP gồm cả xoắn α (α-helix) và gấp nếp β (β-strand).

Hiện nay đã có một số lượng lớn cấu trúc CYP từ sinh vật nhân thực, vi khuẩn, vi khuẩn cổ, đủ để khẳng định rằng tất cả CYP có cấu trúc bậc II và bậc III tương tự nhau, thậm chí cả ở những isozym mà trình tự nhận dạng giống nhau rất ít. Tức là sự sắp xếp và cuộn gấp của chuỗi polypeptid là tương đối giống nhau ở CYP của tất cả các họ. Những vùng cấu trúc bảo tồn trong cấu trúc bậc ba của CYP [14] ( SRS – Substrate recognition sequence là vùng trình tự nhận diện cơ chất, có màu đen; các vùng xoắn α – helix được ký hiệu bằng chữ cái in hoa) Cấu trúc bậc III: Cấu trúc bậc III của cytochrom P450 đặc trưng bởi cấu trúc, sự sắp xếp của nhân hem và chuỗi polypeptid trong không gian ba chiều. 5 Cấu trúc lõi được bảo tồn của CYP được tạo nên bởi một bó gồm 4 chuỗi xoắn α, bao gồm: 3 chuỗi xoắn song song D, L và I – helix và một chuỗi xoắn ngược E – helix (Hình 1.

Nhân hem nằm giữa chuỗi xoắn I – helix xa và L – helix gần, và được gắn với vòng xoắn có chứa phối tử Cys, mang trình tự acid amin đặc trưng của CYP. Phân tử cystein là phối tử thứ 5 của nguyên tử sắt hem, được bảo tồn hoàn toàn [14]. Trung tâm hoạt động của CYP chứa Fe protoporphyrin IX. Nguyên tử Fe3+ của nhân hem có thể tồn tại ở hai trạng thái spin, spin thấp (LS) khi mà 5 electron ở phân lớp 3d được ghép đôi tối đa, và trạng thái spin cao (HS) khi 5 electron ở phân lớp 3d đều ở trạng thái tự do.

Dữ liệu quang phổ, NMR, hình ảnh tinh thể học cho thấy phân tử nước là phối tử thứ 6 tạo liên kết trục với Fe3+ của nhân hem khi enzym ở trạng thái tự do không gắn với cơ chất, có vai trò giữ nguyên tử Fe này bền vững ở trạng thái spin thấp. Khi cơ chất gắn với enzym, liên kết giữa phân tử nước và nguyên tử Fe3+ bị phá vỡ, Fe3+ từ trạng thái liên kết với 6 phối tử chuyển thành dạng liên kết với 5 phối tử, do đó Fe3+ không còn giữ được vị trí ở trên mặt phẳng của nhân hem, và vì vậy cấu trúc của enzym bị thay đổi [39]. Mặc dù có những vùng được bảo tồn cao và giống nhau ở tất cả các CYP, nhưng sự đa dạng về cấu trúc vẫn đủ để đảm bảo khả năng gắn của các CYP khác nhau với các cơ chất đặc trưng khác nhau. Đặc điểm xúc tác Cytochrom P450 xúc tác cho phản ứng oxy hóa cơ chất bằng cách hoạt hóa một phân tử O2, sau đó chuyển một nguyên tử oxy đã được hoạt hóa vào cơ chất, nguyên tử oxy còn lại bị khử thành nước.

Cơ chế của phản ứng này đã được Coon và cộng sự tìm ra và mô tả chi tiết vào năm 1980 [65]. Một phản ứng điển hình được xúc tác bởi CYP là: RH + O2 +2e- + 2H+ ------> ROH +H2O CYP thực hiện hoạt động xúc tác của mình thông qua một chuỗi các phản ứng riêng lẻ, gồm (Hình 1.