Nghiên cứu Thu nhận và Tinh sạch Enzyme Cellobiose Dehydrogenase từ Nấm Coprinellus aureogranulatus

Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzyme cellobiose dehydrogenase từ nấm Coprinellus aureogranulatus. Đánh giá hoạt tính và ứng dụng tiềm năng của enzyme.

• Tác giả: Tạ Đức Lâm
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Hữu Nghị
• Trường học: Đại học Mở Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzyme Cellobiose dehydrogenase từ loài nấm Coprinellus aureogranulatus
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cảm ơn
• MỤC LỤC
• Mở đầu
• Lý do chọn đề tài
• Lịch sử nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sinh khối giàu lignocellulose từ nguồn phụ phẩm nông - lâm nghiệp tại Việt Nam
• 1.2. Giới thiệu về nấm
• 1.3. Nấm phân giải Lignocellulose
• 1.4. Giới thiệu về loài nấm Coprinellus aureogranulatus
• 1.5. Giới thiệu enzyme cellobiose dehydrogenase
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu, hóa chất thiết bị
• 2.2. Phương Pháp Nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: Kết quả và thảo luận
• 3.1. Kết quả lên men thu nhận enzyme
• 3.2. Kết quả tinh sạch protein
• 3.3. Xác định độ tinh sạch protein
• 3.4. Khảo sát điều kiện hoạt động tương thích
• Kết Luận và kiến nghị
• Tải liệu Tham Khảo
• Danh mục viết tắt
• Danh mục hình ảnh, đồ thị
• Danh mục bảng

Tóm tắt

I. Tổng Quan về Enzyme Cellobiose Dehydrogenase CDH

Cellobiose dehydrogenase (CDH), một enzyme CDH ngoại bào, được Westermark và Eriksson phát hiện lần đầu năm 1974 ở nấm mục trắng Trametes versicolor và Phanerochaete chrysosporium. Nghiên cứu ban đầu gặp nhiều khó khăn trong việc xác định đặc tính xúc tác và phân tử. CDH tham gia nhiều chức năng in vivo như phân giải cellulose, ngăn tái cấu trúc cellulose, giảm ức chế cellulase, lignin depolymer hóa, hỗ trợ mangan peroxidase, sinh tổng hợp gốc hydroxyl, khử quinone, kháng khuẩn và là thành phần chuỗi hô hấp. Giả thuyết gốc hydroxyl cho rằng CDH tổng hợp phức hợp hydro peroxide và ion sắt, sau đó sử dụng trong phản ứng Fenton để biến đổi cellulose, hemicellulose và lignin. Gần đây, CDH được phát hiện cung cấp điện tử cho lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) thông qua vùng cytochrome, kích hoạt trung tâm chứa đồng của LPMO để xúc tác. Sự linh động của vùng CYT cần thiết cho sự chuyền điện tử giữa hai enzyme. Hallberg và cộng sự đã phân tích thành công cấu trúc của miền CYT từ P. Cơ chế hoạt động của CDH xúc tác quá trình oxy hóa 2e-/2H+ của nguyên tử cacbon anomer (C1) của cellobiose disaccharide thành cellobiono-δ-lactone. CDH cũng được liệt kê trong cơ sở dữ liệu enzyme carbohydrate (CAZy), là một trong bốn phân nhóm đầu tiên của họ hoạt động phụ CAZy (AA3_1). CDH phân bố chủ yếu trong hai ngành Basidiomycota và Ascomycota và có hàm lượng đáng kể cùng với LPMO. Trong khoảng 60% trường hợp, hai gen cdh và lpmo xuất hiện cùng nhau, điều này nhấn mạnh vai trò enzyme phụ trợ quan trọng của CDH đối với LPMO. Các trình tự cdh được chia thành bốn loại (I, II, III, IV). Các loại CDH I, II, III, IV có ái lực mạnh với cellulose và liên kết thông qua vị trí gắn kết cellulose trên bề mặt của miền dehydrogenase của CDH (miền DH).

1.1. Lịch Sử Nghiên Cứu và Các Phát Hiện Quan Trọng về CDH

Cellobiose dehydrogenase (CDH) được nghiên cứu từ năm 1974. Các mốc quan trọng: Lần đầu phát hiện CDH trong nấm mục trắng (1974) và nấm mục nâu (1980). Năm 1991 quan sát được sự phân tách protein trong 2 miền của CDH. Năm 1992, sự tạo thành Fe2+ và H2O2 được quan sát. CDH ứng dụng trong cảm biến sinh học (1992) và điện cực than chì (1996). Cấu trúc miền CYT (2000) và DH (2002) được giải mã. Năm 2006, CDH được sử dụng làm nguyên tố sinh học cho biosensor lactose. Năm 2008, CDH được sử dụng làm anode trong pin nhiên liệu sinh học glucose/O2. Năm 2011, CDH được sử dụng làm nguyên tố sinh học trong biosensor glucose và phát hiện ra LPMO là chất nhận điện tử tự nhiên của CDH. Nghiên cứu về cơ chế tương tác giữa CDH và LPMO (2016). Sử dụng CDH làm anode trong biosupercapacitor (2018). Thêm nhóm IV vào trong các nhóm phân loại CDH (2019). Nghiên cứu trong nước còn hạn chế, chủ yếu tập trung vào nấm mục trắng. Nhóm tác giả Đỗ Hữu Nghị, Vũ Đình Giáp (Viện Hàn lâm KHCNVN) là một trong số ít các nhà nghiên cứu trong nước có công bố liên quan đến enzyme cellobiose dehydrogenase từ nấm.

1.2. Cấu Trúc Phân Tử và Cơ Chế Hoạt Động của Enzyme CDH

Tùy vào nguồn gốc và phân loại, CDH có khối lượng phổ biến trong khoảng từ 91kDa đến 102kDa, dải pI từ 3. Cấu trúc CDH bao gồm miền CYT đầu N liên kết miền DH khiến chúng có mối liên kết chặt chẽ với nhau và cho phép IET giữa chúng ngoài ra nó còn có một CBM1 đầu C. Miền DH gồm subdomain liên kết FAD và subdomain liên kết cơ chất. Miền DH là một thành viên trong họ glucose-methanol-choline (GMC) oxidoreductase. Miền CYT linh động của CDH là một tính năng độc đáo của GMC- oxidoreductase. Độ linh động của miền CYT được điều chỉnh bởi một liên kết peptide linh hoạt có độ dài và thành phần khác nhau. CDH xúc tác quá trình oxy hóa 2e-/2H+ của nguyên tử cacbon anomer (C1) của cellobiose disaccharide thành cellobiono-δ-lactone và thủy phân tiếp thành cellobionic acid trong nước. CDH chuyển electron từ miền DH qua miền CYT tới LPMO sau đó LPMO tấn công phân cắt cellulose trong lignocellulose. Một giả thuyết về cơ chế phản ứng được đặt ra là sự oxi hoá cơ chất diễn ra đồng thời với sự khử FAD, sau đó là sự khử chất nhận điện tử trực tiếp tại FAD hoặc chuyển điện tử nội phân tử sang haem cofactor.Phản ứng gồm 2 phần, phần khử và phần oxi hoá: Phần phản ứng khử (reductive half-reaction) FAD bao gồm quá trình oxy hóa cơ chất bằng cách tách proton O1 hydroxyl của cơ chất thông qua histidine xúc tác và đồng thời khử hoàn toàn FAD thành FADH2 bằng cách chuyển hydride C1 sang flavin N5. Phần phản ứng oxy hóa có thể bao gồm chất nhận 1 hoặc 2 electron, bị khử trực tiếp bởi FADH2, hoặc chuyển điện tử nội phân tử (intramolecular single electron transfer) liên tiếp từ FADH2 sang cofactor haem và tiếp tục đến một chất nhận điện tử đơn bên ngoài như LPMO, cytochrome c hoặc bề mặt điện cực.

II. Vấn Đề Thu Nhận Enzyme CDH Từ Nguồn Nấm Tự Nhiên

Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme CDH vẫn còn nhiều thách thức. Mặc dù CDH có nhiều ứng dụng tiềm năng trong các lĩnh vực khác nhau như năng lượng sinh học, y học và công nghiệp, việc thu nhận và tinh sạch enzyme này từ nguồn tự nhiên vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Một trong những thách thức lớn nhất là tìm kiếm các chủng nấm có khả năng sản xuất enzyme CDH với hiệu suất cao. Bên cạnh đó, quy trình thu nhận enzyme và tinh sạch enzyme CDH cũng đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp và tốn kém. Ngoài ra, việc duy trì hoạt tính enzyme CDH trong quá trình bảo quản và sử dụng cũng là một vấn đề cần được giải quyết. Cần có các phương pháp bảo quản enzyme hiệu quả để đảm bảo hoạt tính enzyme CDH không bị suy giảm trong thời gian dài.

2.1. Khó Khăn trong Tìm Kiếm Nguồn Enzyme CDH Hiệu Quả

Tìm kiếm các chủng nấm sản xuất enzyme CDH với hiệu suất cao là một thách thức lớn. Các loại nấm khác nhau có khả năng sinh ra các enzyme phân giải lignocellulose khác nhau. Việc sàng lọc và lựa chọn các chủng nấm có khả năng sản xuất enzyme CDH với hoạt tính enzyme CDH cao đòi hỏi nhiều thời gian và công sức. Đặc biệt, ở Việt Nam, các công trình khoa học nghiên cứu về đặc tính cellobiose dehydrogenase, đặc biệt là khả năng sinh enzyme cellobiose dehydrogenase từ nấm lớn còn rất ít. Điều này gây khó khăn cho việc tìm kiếm các nguồn enzyme CDH tiềm năng.

2.2. Thách Thức trong Quy Trình Thu Nhận và Tinh Sạch Enzyme

Quy trình thu nhận enzyme và tinh sạch enzyme thường đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp và tốn kém. Các bước như phá vỡ tế bào, lọc, ly tâm, kết tủa và sắc ký cần được thực hiện một cách cẩn thận để đảm bảo hiệu suất và độ tinh khiết của enzyme. Việc lựa chọn các phương pháp tinh sạch enzyme phù hợp cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của enzyme thu được. Các phương pháp sắc ký như sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực và sắc ký rây phân tử thường được sử dụng để phân lập enzyme CDH và tinh sạch enzyme CDH. Cần có các quy trình tinh sạch enzyme hiệu quả và kinh tế để có thể sản xuất enzyme CDH với số lượng lớn phục vụ cho các ứng dụng khác nhau.

III. Cách Thu Nhận Enzyme CDH Từ Nấm Coprinellus aureogranulatus

Nghiên cứu này tập trung vào việc thu nhận enzyme CDH từ loài nấm Coprinellus aureogranulatus. Quy trình bao gồm nuôi cấy nấm trên môi trường giàu lignocellulose (rơm rạ), sau đó chiết tách enzyme từ sinh khối nấm. Dịch chiết thô được lọc và ly tâm để loại bỏ cặn bã. Quá trình lên men thu nhận enzyme được thực hiện trong 20 ngày. Sau 20 ngày lên men, nấm phát triển thành hệ sợi màu trắng dày đặc trên bề mặt của rơm. Hệ sợi xốp, có thể quan sát thấy cả một số quả thể nấm lớn màu nâu ở giữa bó rơm. Rơm sau khi bị nấm tác động lên hệ lignocellulose, trở nên mềm hơn một chút so với ban đầu. Sau đó dùng nước cất rồi lắc qua đêm để thu dịch enzyme. Enzyme sau đó được lọc qua một lớp vải màn, qua thêm một lớp giấy lọc rồi được ly tâm để loại bỏ cặn. Dịch enzyme sau đó được chuyến bước tiếp theo là siêu lọc. Kết quả lên men khá tốt. Nấm có phát triển trên rơm mặc dù sinh trưởng khá chậm (20 ngày) do môi trường cơ chất là rơm rạ thu được dịch chết thô có hoạt độ enzyme CDH là 1817,1 U.

3.1. Quy Trình Nuôi Cấy và Lên Men Nấm Coprinellus aureogranulatus

Chủng nấm MPG 14 được thu thập từ Mường Phăng (Điện Biên) đã được phân lập, sàng lọc hoạt tính và định danh ITS xác định được chủng MPG14 là loài Coprinellus aureogranulatus. Sau đó chủng nấm được nuôi tại Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Rơm được thu hoạch ngoài cánh đồng, được phơi khô hoặc sấy. Sau đó rơm sẽ được tuyệt trùng bằng cồn 70º. Môi trường sinh enzyme: Môi trường rắn (rơm): rơm sau khi được sơ chế sẽ được cắt thành từng đoạn có độ dài là 10cm rửa sạch bụi bẩn rồi được phơi khô. Bỏ rơm sau khi phơi khô vào túi nilon thành từng túi vào khoảng 400g/túi rồi đem đi khử trùng tại nhiệt độ 121ºC trong thời gian 30 phút. Chờ rơm nguội rồi đánh tan đĩa petri có chứa hệ sợi nấm đổ vào túi rơm. Nấm sau khi được đổ vào túi sẽ dung rơm làm cơ chất để phát triển. Trong thời gian đó thường xuyên quan sát sự phát triền của nấm.

3.2. Chiết Tách Enzyme CDH Thô từ Sinh Khối Nấm Lên Men

Thu hoạch nấm sau 20 ngày khi nấm đã phát triển kín bề mặt túi nilon. Ngâm rơm đã có nấm mọc kín bề mặt vào nước cất rồi lắc qua đêm để dịch nấm tiết ra ngoài, đeo gang tay y tế rồi dung tay vò rồi vắt lấy nước để thu được tối đa dịch chiết. Sau khi thu được dịch chiết enzyme thô, đem đi lọc rồi ly tâm loại cặn ở tốc độ 4000rpm trong 5 phút. Bảo quản dịch chiết enzyme ở -5 độ C để enzyme không bị biến tín.

IV. Phương Pháp Tinh Sạch Enzyme CDH Bằng Sắc Ký FPLC

Dịch chiết enzyme thô sau khi thu nhận sẽ được tinh sạch enzyme bằng sắc ký lỏng protein nhanh (FPLC). Các bước bao gồm siêu lọc qua màng cut off, sắc ký trao đổi ion (DEAE-sepharose và Q-sepharose) và sắc ký desalting. Quá trình tinh sạch enzyme được thực hiện trên hệ thống sắc ký lỏng protein nhanh (FPLC – ÄKTA Pure, GE Healthcare, Thuỵ Điển). Các cột sắc ký được thực hiện trên hệ thống sắc ký lỏng protein nhanh (FPLC – ÄKTA Pure, GE Healthcare, Thuỵ Điển). Đây là hệ thống tinh sạch protein enzyme hiện đại của Thụy Điển mà phòng thí nghiệm Sinh Học Thực Nghiệm mới nhập về cách đây ít lâu. Hệ thống này giúp quá trình tinh sạch diễn ra nhanh hơn sạch hơn có thể nhìn thấy nồng độ protein từng phân đoạn.

4.1. Siêu Lọc và Sắc Ký Trao Đổi Ion DEAE Sepharose

Dựa vào kích thước enzyme CDH là khoảng 94 -102 kDa, màng lọc cut off 10 kDa đã được chọn. Sau khi lọc qua màng siêu lọc một lượng lớn protein đã được tách ra khỏi dịch enzyme thô. Những protein bị loại bỏ là những protein có kích thức nhỏ hơn 10 kDa. Kết thúc bước siêu lọc enzyme được nhồi vào cột DEAE- sepharose để tiếp tục quá trình tinh sạch. Nhựa cột tích điện dương, các protein tích điện âm liên kết với cột và được giữ lại trong cột. Các protein khác đi qua cột và thu được trong bước này. Các protein mong muốn được rửa giải bằng việc thay đổi dần dần từ đệm A sang đệm B, tức là tăng dần nồng độ muối theo một gradient. Thu các phân đoạn theo peak hiện lên trên màn hình, đem đi thử hoạt tính CDH bằng phương pháp được trình bày bên dưới. Các thông số chạy cột: Thể tích cột: 40 ml. Tốc độ dòng: 4 ml/phút. Đệm sử dụng: Sodium acetate 10 mM pH 4.5.Sodium acetate 10 mM pH 4.5M

4.2. Sắc Ký Desalting và Q Sepharose cho Độ Tinh Khiết Cao

Các bước thực hiện giống như ở cột DEAE. Các thông số chạy cột: Thể tích cột: 40 ml. Tốc độ dòng: 4 ml/phút o Nhựa nhồi cột: SuperdaxTM 75. Đệm sử dụng: Sodium acetate 50 mM pH 5; Sodium acetate 50 mM pH 5 + NaCl 0.15M. Các thông số chạy cột: o Thể tích cột: 5 ml. o Tốc độ dòng: 4 ml/phút o Nhựa nhồi cột: sepharose o Đệm sử dụng:PBS 0,05 M; pH = 7,4; PBS 0,05 M; pH = 7,4 + NaCl 0,5 M Sau khi chạy cột Q-sepharose, chúng ta quan sát được 2 peak rõ rệt có nồng độ protein khá cao, trong đó peak thấp hơn thể hiện hoạt tính CauCDH vượt trội (40U/mL), protein ở peak còn lại không biểu hiện hoạt tính CauCDH. Do vậy, cột Q-sepharose đã thể hiện hiệu quả tinh sạch đáng kể, loại được khá nhiều protein không mong muốn. Các phân đoạn có hoạt tính CDH cao được thu thập và đem đi bảo quản, một phần được trích ra để phục vụ xác định độ tinh sạch của enzyme sản phẩm.

V. Đánh Giá Độ Tinh Sạch và Khảo Sát Đặc Tính Enzyme CDH

Sau quá trình tinh sạch enzyme, độ tinh khiết và các đặc tính của enzyme CDH được đánh giá thông qua điện di SDS-PAGE và khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu (nhiệt độ và pH). Độ tinh khiết của C. aureogranulatus CDH (CauCDH) sau bước cuối cùng trên cột HiTrap Q được đánh giá bằng phân tích điện di gel polyacrylamide 12% SDS, cho thấy một dải band rõ ràng với khối lượng phân tử là 109 kDa (Hình 3. CauCDH tinh khiết thể hiện giá trị pI ở pH acid yếu là 5.4 xuất hiện dưới dạng một dải protein đồng nhất trong gel IEF sau khi nhuộm Colliodal blue. Kết quả tinh sạch CauCDH được tóm tắt trong bảng 4. Sau quy trình tinh chế 3 bước (sắc ký trao đổi ion và sắc ký rây phân tử), hàm lượng CauCDH còn lại chỉ đạt 22.7% nhưng đã được tinh sạch tới 41.9 lần từ dịch lọc nuôi cấy thô với hoạt độ riêng 28,9 U/mg (tổng 412 U).

5.1. Xác Định Độ Tinh Khiết bằng Điện Di SDS PAGE và Điện Di pI

Độ tinh khiết của C. aureogranulatus CDH (CauCDH) sau bước cuối cùng trên cột HiTrap Q được đánh giá bằng phân tích điện di gel polyacrylamide 12% SDS, cho thấy một dải band rõ ràng với khối lượng phân tử là 109 kDa. CauCDH tinh khiết thể hiện giá trị pI ở pH acid yếu là 5.4 xuất hiện dưới dạng một dải protein đồng nhất trong gel IEF sau khi nhuộm Colliodal blue.

5.2. Khảo Sát Điều Kiện Nhiệt Độ và pH Tối Ưu cho Hoạt Động Enzyme

Trong nhiệt độ khảo sát từ 30 đến 70ºC dựa vào kết quả ta có thể thấy rằng: Từ nhiệt độ 30 đến 50ºC ta có thể thấy rằng khi tăng nhiệt độ lên thì hoạt tính CauCDH cũng tăng theo nhưng khi qua mức 50ºC khi ta càng tăng nhiệt độ thì hoạt tính CauCDH ngày càng giảm. Nhìn vào biểu đồ ta có thể thấy hoạt tính CauCDH mạnh nhất ở nhiệt độ từ 45-55ºC. Trong pH khảo sát từ 4 đến 8 dựa vào kết quả ta có thể thấy: Ở pH từ 4 đến 5,5 hoạt tính CauCDH sẽ tăng khi ta tăng pH lên. Từ pH 5,5 đến 8 khi ta càng tăng pH thì hoạt tính CauCDH càng giảm, pH thích hợp để hoạt tính CDH mạnh nhất được thể hiện ở pH bằng 5,5. Kết quả tối ưu điều kiện hoạt động này tương đối phù hợp với các nghiên cứu về enzyme CDH khác đã được công bố.

VI. Ứng Dụng Tiềm Năng của Enzyme CDH trong Công Nghiệp

Với lịch sử nghiên cứu gần năm thập kỷ, enzyme CDH với những tính chất đặc điểm ngày càng được sáng tỏ. Các nghiên cứu càng cho thấy sự đa năng của emzyme này và tầm quang trọng của nó trong ngành y sinh. CDH đã được sử dụng làm yếu tố cảm biến sinh học để phát hiện một số chất phân tích khác nhau từ năm 1992. Cả CDH loại I và loại II đều được sử dụng làm chất xúc tác sinh học cho cảm biến sinh học. Trong số các CDH loại I, Phanerochaete chrysosporium CDH là enzyme được nghiên cứu toàn diện nhất được sử dụng để phát hiện các dẫn xuất phenol khác nhau, cellobiose và lactose. CDH được tách chiết từ Phanerochaete sordida và Trametes villosa đã được sử dụng để phát hiện lactose và CDH từ Sclerotium rolfsii để phát hiện dopamine. Năm 2017, công ty DirectSens GmbH đã cho ra mắt bộ cảm biến sinh học lactose đầu tiên dựa trên CDH cho nồng độ lactose rất thấp trong các sản phẩm sữa giải lactose.

6.1. Enzyme CDH trong Cảm Biến Sinh Học Biosensor

CDH đã được sử dụng làm yếu tố cảm biến sinh học để phát hiện một số chất phân tích khác nhau kể từ năm 1992, khi Elmgren và cộng sự báo cáo về một cảm biến sinh học mới nhạy cảm với cello-oligosaccharide. Cả CDH loại I và loại II đều được sử dụng làm chất xúc tác sinh học cho cảm biến sinh học. Vật liệu điện cực cho các cảm biến sinh học dựa trên CDH chủ yếu là các điện cực dựa trên than chì như que than chì, nhưng điện cực carbon bằng vàng và thủy tinh cũng đã được sử dụng.

6.2. Ứng Dụng trong Pin Nhiên Liệu và Kháng Khuẩn

Pin nhiên liệu hay các tế bào nguyên liệu biến đổi khả năng hóa học của nhiên liệu. Không giống như pin thông thường pin nhiên liệu không bị tiêu hao cũng như không nạp được điện. Loại pin này hầu như không ảnh hưởng đến môi trường và giá cả cũng rất cao. Năm 2008, Coman và cộng sự đã đưa ra pin nhiên liệu sinh học enzyme đầy đủ chức năng có anode CDH và cathode enzyme. CDH có khả năng khử oxy thành hydro peroxide nên có tiềm năng để phát triển hệ thống kháng khuẩn tại chỗ. Do CDH có ái lực thấp với oxy, nên nghiên cứu đang phát triển theo hướng tăng ái lực và khả năng tạo ra lượng H2O2 cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Sinh khối giàu lignocellulose từ nguồn phụ phẩm nông - lâm nghiệp tại Việt Nam 1.1 Nguồn Gốc Nước ta đang trong quá trình công nghiệp hóa – hiện đại hóa với một số ngành chủ lực kinh tế, trong đó có nông nghiệp mặc dù nhiều diện tích đất nông nghiệp được chuyển thành đất công nghiệp nhưng dản lượng về nông nghiệp ngày càng ra tăng đóng góp không nhỏ vào GDP của cả nước. Bên cạnh đó hằng năm lượng phế thải dư thừa trong quá trình chế biến các sản phẩm nông sản, thực phẩm rất lớn và đa dạng về chủng loại. Đó cũng là nỗi lo về các bãi chứa, đe dọa ô nhiễm môi trường với những địa phương có thế mạnh về sản xuất nông nghiệp. Trước kia người dân thường tái sử dụng những phụ phẩm này như ủ phân hữu cơ, làm thức ăn chăn nuôi nhưng bây giờ rất ít phụ phẩm được tái sử dụng còn lại thường được đốt trực tiếp gây ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe người dân và giao thông gần đó.

Còn đối với Lâm nghiệp hằng năm hệ sinh thái rừng cho ra cả triệu tấn phụ phẩm và còn cả các ngành khai thác gỗ hằng năm cũng cho ra một lượng lớn phụ phẩm gỗ. Các phú phẩm trên được gọi chung là vật liệu giàu lignocellulose thải. Xét về nguồn gốc thành phần, có thể phân biệt các loại lignocellulose như: từ cây gỗ cứng, gỗ mềm cũng như từ cây trồng hàng năm (đặc biệt là cây lúa, ngũ cốc, các loại cỏ, cây mía.) và thân cây thảo. 4 Bảng 2[44]: Sinh khối lignocellulose từ phế phẩm nông - lâm nghiệp tại Việt Nam.

Từ những thống kê các nguồn chính ở bảng trên cho thấy hằng năm tổng lượng lignocellulose được thải ra môi trường là rất lớn. Rơm rạ là nguồn sinh khối chính chiếm khoảng 54,4%. Các nguồn sinh khối khác tuy ít hơn nhưng rất đáng kể. Lignocellulose là một phức hợp polyme thành tế bào ở thực vật, chiếm 60% tổng sinh khối thực vật trên trái đất, bao gồm các thành phần chính là các polymer carbohydrate (cellulose, hemicellulose) và một polymer thơm (lignin), trong đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao.

Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 40% - 50%, còn hai hợp chất hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20 - 35% và 10 - 25% khối lượng khô của cơ thể thực vật (bảng 2).2 Thành phần Lignocellulose là thành phần chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô… gồm 3 hợp phần chính là cellulose, hemicellulose và lignin. Cả 3 hợp phần này cùng nhau tạo nên cấu trúc có độ bền cao của thực vật. 5 Lignocellulose là một cơ chất phức hợp bao gồm các polysaccharide, các polyme có gốc phenol và protein. Các thành phần của lignocellulose tạo thành một dạng cấu trúc gọi là vi sợi (microfibril).1 [7]: Cấu tạo của lignocelluloe.2 [8]: Mặt cắt vi sợi lignocellulose.

6 Cellulose Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n , là polysaccharide phổ biến nhất có mặt chủ yếu trong thành tế bào thực vật giúp cho các mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Cellulose bao gồm các đơn vị D-glucose liên kết ß-1,4 tạo thành chuỗi polyme tuyến tính gồm khoảng 8000 - 12 000 đơn vị glucose. Các mạch cellulose được liên kết với nhau bằng liên kết hydro và liên kết Van der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình. Trong vùng kết tinh, các phân tử cellulose liêt kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi các enzyme và hóa chất.

Ngược lại, trong vùng vô định hình các cellulose liên kết không chặt chẽ với nhau nên dễ bị tấn công. Cellulose không tan trong nước và dung môi hữu cơ nhưng tan trong dung dịch Schweitzer, tan trong dung dịch kẽm chlorid đậm đặc, Trong tự nhiên, cellulose có nhiều trong bông, đay, tre, nứa, gỗ,… Cellulose cũng là nguồn sinh khối cho nấm phân hủy để cung cấp carbon cho sự phát triển của chúng. Ngoài ra cellulose còn được ứng dụng rất nhiều vào ngành công nghiệp may mặc, giấy, dệt may, dược phẩm. Hemicellulose Hemicellulose là các polysaccharide không đồng nhất bao gồm các đơn vị đường khác nhau, là polysaccharide phổ biến thứ hai trong thành tế bào thực vật.

Hemicellulose thường được phân loại theo thành phần chính của đường có trong mạch polymer. Xylan, loại polymer hemicellulose dồi dào nhất trong ngũ cốc và gỗ cứng, được cấu tạo bởi các đơn vị D-xylose liên kết ß-1,4 trong mạch chính và có thể được thay thế bởi D-galactose, L-arabinose, glucuronic acid, acetyl, feruloyl và p-coumaroyl [3]. Hai hemicellulose chính khác trong thành tế bào thực vật là galacto(gluco)mannan, bao gồm một mạch chính của D-mannose có liên kết ß-1,4 (mannans) và D-glucose (glucomannans) với chuỗi bên D-galactose và xyloglucans 7 bao gồm một mạch chính D-glucose liên kết ß-1,4 được thay thế bằng D-xylose [3]. Hơn nữa, trong polyme xyloglucan, L-arabinose và D-galactose có thể được gắn vào xyloza và L-fucose có thể được gắn vào galactose.

Do có nhiều nhóm có khả năng gắn vào mạch chính như vậy, nên polymer này có độ phức tạp và biến đổi cấu trúc cao. Hemicellulose được ứng dụng làm màng gel trong bao bì, màng phủ thực phẩm. Lignin Lignin là một polymer phenolic tạo nên độ bền chắc của thành tế bào thực vật. Lignin là một polymer phân nhánh phức tạp rất khó tan gồm các đơn vị phenylpropane, được liên kết với nhau bằng liên kết ether và carbon-carbon, tạo thành một mạng lưới liên kết chéo rộng rãi trong thành tế bào.

Liên kết chéo giữa các polyme khác nhau tạo nên sự phức tạp và độ cứng của thành tế bào thực vật, chịu trách nhiệm bảo vệ toàn bộ tế bào thực vật. Ngoài việc bảo vệ chống lại lực cơ học và ly giải thẩm thấu, thành tế bào thực vật là một hàng rào hiệu quả chống lại mầm bệnh, bao gồm vi sinh vật. Trong tự nhiên lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose.2 Giới thiệu về nấm Giới nấm là nhóm sinh vật nhân thực dị dưỡng với thành tế bào cấu tao bởi kitin (chitin) là một giới riêng biệt rất lớn với khoảng 1,5 triệu loài, Nấm có nguồn gốc hoàn toàn khác biệt so với những sinh vật có hình thái tương tự như nấm nhầy (Myxomycetes) hay Mốc nước (Oomycetes). Chúng sinh sống và phát triển chủ yếu trong đất, chất mùm, xác sinh vật chết, cộng sinh và ký sinh trên cơ thể động, thực vật và nấm khác.

Phần lớn Nấm phát triển dưới dạng sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số loài lại phát triển theo dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm thường qua bào tử, được tạo nên 8 trên các cấu trúc đặc biệt hay quả thể. Một số loài lại mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng. Những đại diên tiêu biểu của nấm là nấm men, nấm mốc, nấm lớn (nấm quả thể).

Trên thực tế nấm có mối quan hệ gần với động vật hơn thực vật, cho dù thế nếu không tìm hiểu kỹ thì rất dễ lầm tưởng nấm là một nhánh của thực vật học. Nấm được sử dụng rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất nhiều loài được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, làm thức ăn. Một số loài nấm còn được sủ dụng trong việc sản xuất kháng sinh trong y học và còn sản xuất cả nhiều loại enzyme nhưng một số loài nấm lại có độc với con người và động vật hoặc mang mầm bệnh cho cây trồng. Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trường khác nhau.

Đa phần là ở trên cạn nhưng một số loài lại chỉ tìm thấy ở môi trường nước. Nấm và vi khuẩn là những sinh vật phân hủy chính có vai trò quan trọng trong các hệ sinh thái trên cạn (có thể dưới nước), bởi vậy chúng có vai trò quan trọng trong chu trình sinh địa hóa ở nhiều lưới thức ăn. Dựa theo tỷ lệ ước lượng giữa thực vật và nấm người ta ước tính nấm có khoảng 1,5 triệu loài, trong đó hơn 70000 loài nấm đã được các nhà khoa học phát hiện, miêu tả tuy nhiên trong giới nấm vẫn còn rất nhiều điều bí ẩn chưa được khám phá. Nấm không có diệp lục, sống hoại sinh và không có khả năng sử dụng trực tiếp các chất sinh dưỡng nhưng lại tiết ra các enzyme vào môi trường xung quanh để phân hủy các phân tử phức tạp thành các chất hòa tan để nấm có thể hấp thu được .Trong số đó các loài nấm sợi có khả năng tiết ra enzyme có khả năng phân hủy tốt.

Đó là phân giới Dikarya – nấm bậc cao, bao gồm hai ngành là Ascomycota – nấm túi và Basidiomycota – nấm đảm. Cả hai ngành này đều có nhân kép, chúng có thể có dạng sợi hoặc đơn bào nhưng không có lông roi. Khi sống hoại sinh hay cộng 9 sinh nấm sẽ phân hủy những chất hữu cơ thành các phân tử vô cơ rồi những chất này sẽ được đồng hóa ở thực vật hay các sinh vật khác.1 Nấm đảm Basidiomycota Basidiomycota, đa phần những loài nấm lớn đều thuộc ngành này. Nấm đảm sản xuất ra những bào tử hình dùi gọi là đảm.

Hệ sợi nấm của nấm đảm rất phát triển, sợi nấm có vách ngăn ngang chưa hoàn chỉnh có thể sinh sản hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng bào tử dính, sinh sản hữu tính bằng bảo tử đảm được hình thành ngoài đảm. Tùy theo cách hình thành đảm và vách ngăn mà phân chia các loại đảm: - Đảm đơn bào (hay đảm không vách) gặp ở phần lớn các nấm đảm. (hay đảm có vách ngăn ngang hoặc vách ngăn dọc) Phân loại: Dựa vào đặc điểm của đảm, một số tác giả chia lớp nấm thành 3 phân lớp - Phân lớp đảm đơn bào (Holobasidiomycetidae) - Phân lớp đảm đa bào.3: Nấm Coprinellus disseminatus một loài nấm thuộc chi Coprinellus và thuộc ngành Bacidiomycota.2 Nấm túi Ascomycota Là nhóm phân loại đông nhất trong Eumycota (nấm thật).

Chúng tạo ra những bào tử giảm phân gọi là bào tử nang, được chứa trong một cấu trúc đặc biệt có dạng giống túi gọi là (ascus). Ngành này bao gồm Nấm nhăn (moscela), một số loài Nấm lớn và nấm cục, nấm men đơn bào và nhiều nấm sợi sống hoại sinh và cộng sinh. Nhiều loài nấm nang chỉ trải qua qua trính sinh sản vô tính (ở nấm gọi là anamorph). Tuy nhiên, nhờ những dữ liệu phân tử đã giúp nhận dạng được những giai đoạn hữu tính (teleomorph) gần nhất của chúng ở nấm nang.

Bởi những sản phẩm của quá 11 trình giảm phân được chứa trong nang nấm, nên một số loài nấm nang (như Neurospora crassa) được sủ dụng trong ngành di truyền học.