Nhân dòng thiết kế vector biểu hiện xylanase d tái tổ hợp trong pichia pastoris gs115

Nội dung bài viết khám phá thiết kế vector biểu hiện xylanase d tái tổ hợp trong Pichia pastoris GS115, ứng dụng trong sinh học phân tử.

• Tác giả: Nguyễn Xuân Chiến
• Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Mai Anh
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Thiết Kế Vector Biểu Hiện Xylanase Trong Pichia Pastoris
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: Nguồn gốc và đặc tính
• 1.1. Xylanase từ Aspergillus
• 1.2. Gen mã hóa xylanase từ chủng Aspergillus niger
• 1.3. Vector biểu hiện và chủng biểu hiện P.
• 1.3.1. Chủng biểu hiện P.
• 1.3.2. Vector biểu hiện
• 1.4. Tình hình nghiên cứu biểu hiện xylanase
• 1.4.1. Trên thế giới
• 1.5. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
• 1.5.2. Các dung dịch và đệm
• 1.5.3. Môi trường
• 1.5.4. Máy móc và thiết bị thí nghiệm
• 1.5.5. Nội dung nghiên cứu
• 1.5.6. Phương pháp nghiên cứu
• 1.5.6.1. Phương pháp nuôi cấy
• 1.5.6.2. Phương pháp khuếch đại gen từ khuôn ADN tổng số
• 1.5.6.3. Phương pháp nối ghép gen ngoại lai
• 1.5.6.4. Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.
• 1.5.6.5. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ tế bào E.
• 1.5.6.6. Điện di ADN trên gel agarose
• 1.5.6.7. Xử lý ADN plasmid bằng enzym cắt giới hạn
• 1.5.6.8. Tinh sạch ADN từ gel agarose
• 1.5.6.9. Biến nạp ADN plasmid vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện
• 1.5.6.10. Tách chiết ADN tổng số nấm men
• 1.5.6.11. Xác định hoạt tính xylanase
• 1.5.6.12. Định tính xylanase
• 1.5.6.13. Định lượng xylanase
• 1.5.6.14. Điện di protein trên gel polyacrylamid (SDS-PAGE)
• 1.5.6.15. Xử lý số liệu
• 2. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 2.1. Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase D từ A.
• 2.2. Nhân dòng gen mã hóa xylanase D
• 2.3. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA/xlnD (pPXlnD)
• 2.4. pastoris GS115 mang gen xln D
• 2.5. Biểu hiện rXlnD tái tổ hợp trong P.
• 2.6. Nghiên cứu thời gian biểu hiện
• 2.7. Nghiên cứu nồng độ methanol cảm ứng
• 2.8. Kết quả nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase D từ A.
• 2.9. Kết quả biểu hiện rXlnD tái tổ hợp
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về thiết kế vector biểu hiện xylanase trong Pichia pastoris

Thiết kế vector biểu hiện xylanase trong Pichia pastoris là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong công nghệ sinh học. Xylanase là enzym có khả năng phân giải xylan, một polysaccharid phong phú trong thành tế bào thực vật. Việc sử dụng Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện mang lại nhiều lợi ích, bao gồm khả năng sản xuất protein tái tổ hợp với hiệu suất cao và chi phí thấp. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của xylanase mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm và công nghiệp sinh học.

1.1. Định nghĩa và vai trò của xylanase trong công nghiệp

Xylanase là enzym xúc tác quá trình thủy phân liên kết β-1,4 của xylan, giúp chuyển đổi polysaccharid thành xylooligosaccharid và xylose. Các sản phẩm này có ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, và sản xuất nhiên liệu sinh học. Theo báo cáo của Grand View Research, thị trường enzym toàn cầu dự kiến sẽ mở rộng với tốc độ tăng trưởng hàng năm 6,5% từ năm 2021 đến 2028.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng Pichia pastoris trong biểu hiện xylanase

Pichia pastoris là một trong những hệ thống biểu hiện phổ biến nhất cho protein tái tổ hợp. Hệ thống này cho phép sản xuất protein với hiệu suất cao, khả năng glycosyl hóa tương tự như tế bào động vật, và dễ dàng điều chỉnh điều kiện nuôi cấy. Việc sử dụng Pichia pastoris giúp tối ưu hóa quá trình sản xuất xylanase, từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất enzym.

II. Thách thức trong việc thiết kế vector biểu hiện xylanase

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc thiết kế vector biểu hiện xylanase trong Pichia pastoris cũng gặp phải một số thách thức. Đầu tiên, việc lựa chọn gen mã hóa xylanase phù hợp là rất quan trọng. Gen này cần phải có khả năng biểu hiện tốt trong môi trường nuôi cấy của Pichia pastoris. Thứ hai, điều kiện nuôi cấy như nồng độ methanol và thời gian biểu hiện cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất sản xuất enzym. Cuối cùng, việc tách chiết và tinh sạch xylanase sau khi biểu hiện cũng là một bước quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

2.1. Vấn đề lựa chọn gen mã hóa xylanase

Việc lựa chọn gen mã hóa xylanase từ các chủng nấm như Aspergillus niger là rất quan trọng. Gen này cần phải được tối ưu hóa để đảm bảo khả năng biểu hiện cao trong Pichia pastoris. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen xylanase D từ A. niger có tiềm năng lớn trong việc sản xuất enzym với hoạt tính cao.

2.2. Điều kiện nuôi cấy và ảnh hưởng đến biểu hiện enzym

Điều kiện nuôi cấy như nồng độ methanol và thời gian biểu hiện có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của xylanase. Nghiên cứu cho thấy nồng độ methanol tối ưu có thể tăng cường đáng kể mức độ biểu hiện của enzym, từ đó nâng cao hiệu suất sản xuất.

III. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện xylanase

Phương pháp thiết kế vector biểu hiện xylanase trong Pichia pastoris bao gồm nhiều bước quan trọng. Đầu tiên, gen mã hóa xylanase được nhân dòng và tối ưu hóa. Sau đó, vector biểu hiện được thiết kế để chứa gen này cùng với các yếu tố điều khiển cần thiết. Cuối cùng, vector được chuyển vào tế bào Pichia pastoris để tiến hành biểu hiện enzym. Các bước này cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo hiệu quả cao nhất.

3.1. Nhân dòng và tối ưu hóa gen xylanase

Quá trình nhân dòng gen xylanase từ A. niger bao gồm việc sử dụng các kỹ thuật PCR để khuếch đại gen. Sau đó, gen này được tối ưu hóa để phù hợp với hệ thống biểu hiện của Pichia pastoris, đảm bảo rằng nó có thể được biểu hiện hiệu quả trong môi trường nuôi cấy.

3.2. Thiết kế vector biểu hiện và chuyển nạp vào tế bào

Vector biểu hiện được thiết kế để chứa gen xylanase cùng với các yếu tố điều khiển như promoter và terminator. Sau khi thiết kế, vector này được chuyển nạp vào tế bào Pichia pastoris bằng phương pháp điện hóa, giúp tăng cường khả năng tiếp nhận ADN.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc thiết kế vector biểu hiện xylanase trong Pichia pastoris đã thành công. Enzym xylanase D tái tổ hợp được biểu hiện với hoạt tính cao, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Các sản phẩm thủy phân từ xylanase có thể được sử dụng trong ngành thực phẩm, dược phẩm và công nghiệp sinh học. Nghiên cứu này không chỉ mở ra cơ hội mới cho việc sản xuất enzym mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp enzym.

4.1. Kết quả biểu hiện xylanase D trong Pichia pastoris

Kết quả cho thấy xylanase D được biểu hiện thành công trong Pichia pastoris với hoạt tính enzym cao. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng enzym này có khả năng thủy phân xylan hiệu quả, mở ra cơ hội ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp.

4.2. Ứng dụng của xylanase trong ngành công nghiệp

Xylanase có nhiều ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và sản xuất nhiên liệu sinh học. Việc sử dụng enzym này giúp cải thiện hiệu suất sản xuất và giảm chi phí, đồng thời tạo ra các sản phẩm có giá trị cao.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về thiết kế vector biểu hiện xylanase trong Pichia pastoris đã mở ra nhiều cơ hội mới cho việc sản xuất enzym tái tổ hợp. Kết quả đạt được cho thấy tiềm năng ứng dụng lớn trong nhiều lĩnh vực công nghiệp. Trong tương lai, việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp mới để tối ưu hóa quá trình biểu hiện xylanase sẽ là cần thiết để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong công nghệ sinh học

Nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc phát triển công nghệ sinh học mà còn mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất enzym trong công nghiệp. Việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến sản xuất enzym sẽ giúp nâng cao hiệu quả và giảm chi phí.

5.2. Triển vọng phát triển xylanase trong tương lai

Triển vọng phát triển xylanase trong tương lai rất hứa hẹn. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải thiện tính ổn định và hoạt tính của enzym, từ đó mở rộng ứng dụng của xylanase trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Xylanase là nhóm enzym xúc tác quá trình thủy phân liên kết $\beta$-1,4-glycosid của xylan – polysaccharid phong phú thứ hai trong tự nhiên và là thành phần cấu tạo chủ yếu của hemicellulose, chiếm khoảng 20% đến 30% sinh khối thành tế bào thực vật bên cạnh cellulose (35-50%) và lignin (20-30%). Quá trình phân giải sinh học xylan dưới tác dụng của xylanase chuyển đổi các hợp chất cao phân tử thành xylo-oligosaccharid (XOS) và xylose. Các sản phẩm này đóng vai trò là nguyên liệu thiết yếu trong nhiều ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, sản xuất giấy và bột giấy, nhiên liệu sinh học, xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp và đặc biệt là công nghiệp dược phẩm. Thị trường enzym toàn cầu ghi nhận sự gia tăng nhu cầu đối với nhóm carbohydrase, đồng thời nhận thức của người tiêu dùng về chăm sóc sức khỏe đã thúc đẩy mạnh mẽ việc sản xuất thực phẩm chức năng và chế phẩm bổ sung prebiotic chứa XOS.

Tuy nhiên, hầu hết các quy trình sản xuất công nghiệp đòi hỏi enzym phải hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao hoặc khoảng pH khắc nghiệt, trong khi các enzym tự nhiên thường nhạy cảm với nhiệt độ và pH. Việc khai thác xylanase tự nhiên từ vi sinh vật bản địa gặp trở ngại lớn do sản lượng sinh tổng hợp rất thấp, thiếu điều kiện nuôi cấy tối ưu ở quy mô lớn và khó duy trì nhiệt độ cao liên tục trong các thiết bị lên men công nghiệp. Để khắc phục hạn chế này, kỹ thuật công nghệ ADN tái tổ hợp được ứng dụng nhằm tạo ra các chủng vi sinh vật mang gen mục tiêu có khả năng biểu hiện xylanase tái tổ hợp với hiệu suất cao, tính chất ổn định và dễ chuẩn hóa quy trình thu hồi.

Từ bối cảnh thực tiễn trên, đề tài khóa luận "Nhân dòng, thiết kế vector, biểu hiện xylanase tái tổ hợp trong Pichia pastoris GS115" được thực hiện với 02 mục tiêu cụ thể:

1. Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện xylanase D từ chủng Aspergillus niger DSM1957.
2. Biểu hiện được xylanase D trong nấm men Pichia pastoris GS115.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Đoạn gen xlnD mã hóa enzym xylanase D tách chiết từ chủng nấm sợi Aspergillus niger DSM1957 (nguồn giống từ Trung tâm sưu tầm vi sinh vật Đức - DSMZ); tế bào khả biến vi khuẩn Escherichia coli DH10B; chủng nấm men chỉ thị và biểu hiện Pichia pastoris GS115; vector tách dòng pJET1.2/blunt và vector biểu hiện pPICZ$\alpha$A.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Hóa Sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội và Phòng Công nghệ sinh học Enzym thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; hoàn thành vào tháng 5 năm 2022. Đề tài nằm trong khuôn khổ nghiên cứu cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam mang mã số 106 do TS. Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình sinh học

• Hệ thống phân loại enzym xylanase: Xylanase (O-glycosid hydrolase, EC 3.2.1.8) gồm các endo-1,4-$\beta$-xylanase chịu trách nhiệm cắt ngẫu nhiên các liên kết nội mạch $\beta$-1,4-xylosidic. Cơ sở dữ liệu CAZy (Carbohydrate-Active enzymes Database) phân chia xylanase thành nhiều họ glycosid hydrolase (GH), phổ biến nhất là GH10 và GH11. Nghiên cứu này hướng vào xylanase D thuộc họ GH43 (có độ tương đồng trình tự đạt 90% so với các thành viên họ GH43 đã công bố) – nhóm enzym sở hữu cấu trúc cuộn gập chân vịt $\beta$ năm cánh (5-bladed $\beta$-propeller) có tiềm năng thủy phân các cơ chất hemicellulose phân nhánh phức tạp.
• Hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris GS115: Là sinh vật nhân thực đơn bào có khả năng chuyển hóa methanol (methylotrophic yeast). P. pastoris kết hợp ưu điểm sinh trưởng nhanh trên môi trường đơn giản như vi khuẩn với khả năng xử lý sau dịch mã hoàn chỉnh của sinh vật nhân thực (hình thành cầu nối disulfid, cuộn gập cấu trúc chính xác, glycosyl hóa). Quá trình biểu hiện ngoại bào được dẫn dắt bởi promoter AOX1 (alcohol oxidase 1) cảm ứng mạnh bằng methanol và tín hiệu tiết $\alpha$-factor giúp enzym tiết thẳng vào môi trường dịch nuôi cấy, giảm thiểu tạp nhiễm protein nội bào.
• Hệ vector plasmid: Vector nhân dòng pJET1.2/blunt (2974 bp) chứa gen gây chết tế bào nhằm chọn lọc dương tính dòng mang đoạn chèn; vector biểu hiện pPICZ$\alpha$A (3593 bp) mang promoter AOX1, peptit tín hiệu tiết dịch $\alpha$-factor của Saccharomyces cerevisiae, đoạn đa điểm cắt dòng hóa (MCS), trình tự đánh dấu C-terminal gồm epitop c-myc và đuôi 6xHis, cùng gen kháng zeocin chọn lọc kép trên cả E. coli và nấm men.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Kỹ thuật sinh học phân tử:
  • Tách chiết ADN tổng số từ hệ sợi A. niger DSM1957.
  • Khuếch đại gen xlnD bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi thiết kế đặc hiệu gắn vị trí nhận biết enzym giới hạn EcoRI và NotI.
  • Ghép nối ADN vào vector pJET1.2/blunt và vector pPICZ$\alpha$A nhờ enzym T4 DNA ligase.
  • Biến nạp plasmid vào tế bào khả biến E. coli DH10B bằng phương pháp sốc nhiệt (xử lý dung dịch $\text{CaCl}_2$ 0,1 M, ủ đá 30 phút, sốc nhiệt 42°C trong 45 giây).
  • Tách chiết ADN plasmid bằng phương pháp biến tính kiềm (dung dịch SDS/NaOH kết hợp tủa muối kali acetat và dung môi chloroform : isoamyl alcohol 24:1).
  • Cắt kiểm tra plasmid bằng enzym cắt giới hạn (EcoRI, NotI, SacI).
  • Điện di ADN trên gel agarose 0,8%, nhuộm ethidium bromid (0,1 $\mu\text{g/ml}$) và soi dưới tia tử ngoại bước sóng 254 nm.
  • Tinh sạch phân đoạn ADN từ thạch gel bằng hệ kit hạt silica/sepharose.
  • Tuyến tính hóa vector pPICZ$\alpha$A/xlnD bằng enzym SacI tại vùng promoter AOX1 để kích hoạt tái tổ hợp đồng đoạn vào hệ gen nấm men.
  • Biến nạp vector mở vòng vào nấm men P. pastoris GS115 bằng phương pháp xung điện (electroporation) trên máy xung điện Eppendorf ở điều kiện điện thế 1,5 kV, điện dung 25 $\mu\text{F}$, trở kháng 200 $\Omega$.
  • Tách chiết ADN bộ gen nấm men bằng sốc nhiệt đông-tan (-84°C và 95°C) kết hợp dung dịch biến tính Triton X-100/SDS, kiểm tra thể biến nạp bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu và cặp mồi 5'AOX1/3'AOX1.
• Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện: Hoạt hóa chủng trên môi trường YPD, nuôi cấy nhân sinh khối ban đầu trong môi trường YPG (chứa 1% glycerol) ở 28°C lắc 200 vòng/phút trong 16-18 giờ. Tiếp sau đó, chuyển sinh khối sang môi trường biểu hiện YP bổ sung methanol định kỳ sau mỗi 24 giờ để cảm ứng promoter AOX1.
• Phương pháp xác định hoạt tính và định danh protein:
  • Định tính: Khuếch tán enzym ngoại bào trên đĩa thạch xylan 0,5%, ủ khuếch tán 12 giờ ở 4°C, phản ứng thủy phân 6 giờ ở 37°C, hiện vòng phân giải bằng dung dịch Lugol 0,2%. Bán kính vòng phân giải $R_{\text{halo}} = R - r$ thể hiện hoạt tính tương đối.
  • Định lượng: Phương pháp Miller (1959) đo quang phổ hấp thụ đường khử tạo thành sau phản ứng giữa xylan 0,5% và dịch enzym trong đệm kali phosphat 20 mM (pH 6,5) ở 50°C trong 5 phút; phản ứng màu với thuốc thử dinitrosalicylic acid (DNS), đun cách thủy 5 phút và đo mật độ quang $\text{OD}_{540\text{ nm}}$, đối chiếu đường chuẩn xylose ($10 - 200\ \mu\text{g/ml}$).
  • Phân tích protein: Điện di biến tính protein ngoại bào trên gel polyacrylamid 12,5% (SDS-PAGE) theo phương pháp Laemmli (1970), hiện băng bằng kỹ thuật nhuộm bạc $\text{AgNO}_3$ 0,1% theo quy trình Bassam.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về enzym xylanase, nguồn gốc vi sinh vật, đặc tính sinh hóa, hệ thống phân loại CAZy và tiềm năng ứng dụng công nghiệp. Văn bản làm rõ sự đa dạng cấu trúc giữa các họ xylanase, chỉ ra ưu điểm vượt trội của xylanase từ nấm sợi chi Aspergillus về sản lượng tiết ngoại bào so với vi khuẩn hay nấm men. Tài liệu tập hợp dữ liệu chức năng của các loại oligosaccharid chính trong y dược và dinh dưỡng:

Nhóm Oligosaccharid	Nguồn cung cấp nguyên liệu	Vai trò và chức năng sinh học chính
Xylo-oligosaccharid (XOS)	Vỏ trấu, cám lúa mì, rơm rạ, gỗ cây dương, vỏ lúa mạch	Chống oxy hóa, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, prebiotic chọn lọc vi khuẩn đường ruột, hỗ trợ điều trị đái tháo đường
Fructo-oligosaccharid (FOS)	Tỏi, cà chua, hành tây, mật ong, chuối, diếp xoăn	Giá trị calo thấp, phòng ngừa sâu răng
Arabino-oligosaccharid (AOS)	Củ cải đường	Kích thích vi khuẩn có lợi ruột kết, tăng hiệu quả hấp thu dinh dưỡng
Chitosan-oligosaccharid (COS)	Khử phân tử chitosan vỏ giáp xác	Chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống tăng huyết áp, bảo vệ tế bào khỏi apoptosis
Galacto-oligosaccharid (GOS)	Đường lactose, sữa người, hạt đậu nành	Cải thiện hệ vi sinh đường ruột, giảm nguy cơ ung thư ruột kết, viêm ruột

Chương này cũng tổng hợp đặc điểm 08 gen mã hóa xylanase từ A. niger đã công bố trên Uniprot: xynA (211 bp, GH11, 22,642 kDa), xlnB (225 bp, GH11, 24,057 kDa), xlnC (327 bp, GH10, 35,476 kDa), xlnD (804 bp, GH3, 87,211 kDa), xlnR (945 bp, yếu tố phiên mã, 102,073 kDa), XYN4 (211 bp, GH11), XYN5 (211 bp, GH11) và XYN6 (211 bp, GH11). Đồng thời, tác giả tổng thuật các nghiên cứu biểu hiện tái tổ hợp xylanase trên thế giới và tại Việt Nam qua các công trình của Ping (2006), Fang (2014), Elgharbi (2015), Long (2020), Aiewviriyasakul (2021), Trần Liên Hà (2013), Đặng Thị Kim Anh (2016) và các nghiên cứu của Phòng Công nghệ sinh học Enzym (VAST).

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu, chủng sinh học (A. niger DSM1957, P. pastoris GS115, E. coli DH10B), hóa chất tinh khiết phân tích và hệ thống trang thiết bị chuyên dụng. Danh mục mồi oligonucleotide tổng hợp phục vụ khuếch đại gen và kiểm tra dòng tái tổ hợp được chuẩn hóa:

Tên mồi	Trình tự nucleotide chiều 5' $\rightarrow$ 3'	Mục đích sử dụng
XylD_F	GCGAATTCTCGCACCCCCAACAGAATC	Gắn vị trí cắt EcoRI, khuếch đại gen xlnD từ ADN tổng số
XylD_R	GCGCGGCCGCGCGATAAAGTCCTCCCCTCA	Gắn vị trí cắt NotI, khuếch đại gen xlnD từ ADN tổng số
5'AOX1	GACTGGTTCCAATTGACAAGC	Kiểm tra sự tích hợp đoạn gen xlnD vào locus AOX1 nấm men
3'AOX1	GCAAATGGCATTCTGACATCC	Kiểm tra sự tích hợp đoạn gen xlnD vào locus AOX1 nấm men

Toàn bộ quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa thành các bước mạch lạc: tách chiết ADN; phản ứng PCR chu nhiệt (95°C/4 phút; 30 chu kỳ: 95°C/45 giây, 52°C/45 giây, 72°C/45 giây; hoàn thiện 72°C/10 phút); kỹ thuật gắn nối với enzym T4 ligase; biến nạp sốc nhiệt vào E. coli; tách plasmid bằng bộ đệm I, II, III; cắt giải phóng đoạn chèn; tinh sạch ADN; cắt mở vòng vector biểu hiện pPXlnD bằng SacI; biến nạp xung điện vào nấm men; phân tích biểu hiện protein ngoại bào bằng SDS-PAGE 12,5% nhuộm bạc; định tính trên đĩa thạch xylan; định lượng hoạt tính theo Miller qua phản ứng DNS đo quang học. Đơn vị hoạt tính enzym (IU) được quy chuẩn là lượng enzym xúc tác tạo ra 1 $\mu\text{mol}$ đường khử (tương đương xylose) trong thời gian 1 phút ở điều kiện phản ứng tiêu chuẩn.

Chương 3. Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ quy trình nhân dòng gen đến khảo sát điều kiện sinh tổng hợp xylanase tái tổ hợp:

• Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen xlnD:

  • Sản phẩm PCR khuếch đại từ ADN khuôn của A. niger DSM1957 cho một băng điện di duy nhất trên gel agarose 0,8% có kích thước khoảng 1000 bp, đúng với tính toán lý thuyết kích thước đoạn gen mã hóa xylanase D (957 bp).
  • Nối ghép thành công vào vector pJET1.2/blunt, biến nạp vào E. coli DH10B tạo plasmid tái tổ hợp pJXlnD. Thử nghiệm cắt plasmid pJXlnD bằng hai enzym giới hạn EcoRI và NotI giải phóng hai phân đoạn đặc trưng: 3000 bp (vector pJET1.2/blunt) và 1000 bp (đoạn gen xlnD).
  • Phân đoạn gen xlnD tinh sạch được ghép nối định hướng vào vector pPICZ$\alpha$A mở vòng tạo plasmid biểu hiện pPICZ$\alpha$A/xlnD (ký hiệu pPXlnD). Thử nghiệm cắt kiểm tra pPXlnD bằng EcoRI và NotI xác nhận hai băng kích thước ~3600 bp (vector pPICZ$\alpha$A) và ~1000 bp (đoạn gen chèn).
  • Kết quả giải trình tự và phân tích tin sinh học bằng phần mềm EditSeq DNAStar và BioEdit xác nhận: đoạn gen xlnD có độ dài chính xác 957 bp, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 318 acid amin, tương ứng với khối lượng phân tử lý thuyết 35,476 kDa, trình tự tương đồng hoàn toàn với mã số GenBank EU861039. Khung đọc mở (ORF) bảo tồn nguyên vẹn vị trí nhận biết enzym giới hạn, mồi và trình tự mã hóa thẻ 6xHis.

• Biến nạp và tạo chủng tái tổ hợp mang gen xlnD:

  • Plasmid pPXlnD được mở vòng bằng enzym SacI (cho băng kích thước ~4500 bp) và đưa vào tế bào P. pastoris GS115 qua xung điện. Sàng lọc trên môi trường chọn lọc YPDS agar bổ sung zeocin 100 $\mu\text{g/ml}$ thu được các khuẩn lạc kháng thuốc có hình thái tròn, màu trắng.
  • Phân tích PCR kiểm tra bộ gen các dòng biến nạp (XpPXlnD): Sử dụng cặp mồi đặc hiệu thu được sản phẩm 1000 bp; sử dụng cặp mồi 5'AOX1/3'AOX1 khuếch đại được 2 băng: băng 2200 bp (gen AOX1 nội sinh của nấm men) và băng 1400 bp (đoạn chèn xlnD nằm giữa hai mồi trên khung đọc pPICZ$\alpha$A). Kết quả này khẳng định cấu trúc biểu hiện đã tích hợp thành công vào locus AOX1 của tế bào chủ.

• Biểu hiện và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy:

  • Định tính và SDS-PAGE: Nuôi cảm ứng bằng 0,5% methanol sau mỗi 24 giờ. Dịch ngoại bào sau 120 giờ thu nhận cho thấy vòng phân giải rõ rệt trên đĩa thạch xylan 0,5% nhuộm Lugol với hoạt tính đạt $1,276 \pm 0,057\ \text{IU/ml}$ (mẫu đối chứng nấm men mang vector rỗng không tạo vòng thủy phân). Bản gel SDS-PAGE 12,5% nhuộm bạc xuất hiện băng protein tái tổ hợp ngoại bào rõ nét ở vị trí khối lượng phân tử $> 35\ \text{kDa}$, tương thích với tính toán lý thuyết (~35,5 kDa).
  • Khảo sát thời gian biểu hiện: Theo dõi hoạt tính và mật độ quang $\text{OD}_{600}$ ở các mốc 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 và 192 giờ. Sinh khối và hoạt tính tăng dần theo thời gian nuôi cấy, đạt cực đại tại thời điểm 120 giờ ($1,233 \pm 0,037\ \text{IU/ml}$). Sau 120 giờ, hoạt tính enzym bắt đầu suy giảm do cạn kiệt dinh dưỡng và hiện tượng phân hủy protein bởi protease nội sinh.
  • Khảo sát nồng độ chất cảm ứng methanol: Khảo sát các nồng độ 0,1%, 0,2%, 0,5%, 0,8%, 1,0%, 1,5% và 2,0% bổ sung định kỳ 24 giờ một lần. Hoạt tính tăng dần từ 0,1% đến 1,0% và đạt đỉnh cao nhất ở 1,0% methanol ($1,153 \pm 0,050\ \text{IU/ml}$, sinh khối tế bào $\text{OD}{600}$ đạt 7,66). Khi tăng nồng độ lên 1,5% và 2,0%, sinh khối tế bào sụt giảm nghiêm trọng xuống $\text{OD}{600} = 1,12$ và hoạt tính enzym giảm xuống $0,919 \pm 0,009\ \text{IU/ml}$ do độc tính của methanol và sự tích lũy hydrogen peroxid trong tế bào nấm men.

---

Kết quả và đóng góp

Các kết quả thực nghiệm định lượng chính

• Nhân dòng thành công đoạn gen xlnD từ Aspergillus niger DSM1957 có kích thước 957 bp, mã hóa cho chuỗi polypeptide 318 acid amin với khối lượng phân tử lý thuyết 35,476 kDa, trùng khớp với dữ liệu đăng ký mã số GenBank EU861039.
• Thiết kế hoàn chỉnh vector biểu hiện pPICZ$\alpha$A/xlnD (pPXlnD) mang promoter AOX1, peptit tín hiệu tiết dịch $\alpha$-factor, gen kháng chọn lọc zeocin và trình tự đuôi 6xHis.
• Chuyển gen thành công vào nấm men Pichia pastoris GS115 bằng phương pháp xung điện; xác nhận đoạn ADN ngoại lai tái tổ hợp đồng đoạn tại locus AOX1 trên hệ gen nấm men bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt.
• Biểu hiện thành công protein xylanase tái tổ hợp (rXlnD) dạng tiết ngoại bào có khối lượng phân tử thực tế $> 35\ \text{kDa}$ trên SDS-PAGE.
• Xác định hoạt tính thủy phân xylan của dịch nuôi ngoại bào đạt $1,276 \pm 0,057\ \text{IU/ml}$ sau 120 giờ cảm ứng ban đầu.
• Xác lập điều kiện nuôi cấy tối ưu sơ bộ: thời gian cảm ứng 120 giờ cho hoạt tính đạt $1,233 \pm 0,037\ \text{IU/ml}$; nồng độ methanol cảm ứng tối ưu là 1,0% (v/v) bổ sung định kỳ mỗi 24 giờ cho hoạt tính đạt $1,153 \pm 0,050\ \text{IU/ml}$ và mật độ tế bào $\text{OD}_{600}$ đạt 7,66.

Giải pháp và kiến nghị kỹ thuật của tác giả

• Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán kép (sử dụng đồng thời cặp mồi gen đặc hiệu và cặp mồi 5'AOX1/3'AOX1) để sàng lọc chính xác các thể biến nạp nấm men mang cấu trúc biểu hiện tích hợp ổn định.
• Tách rời pha sinh trưởng sinh khối (trên môi trường chứa glycerol) và pha cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp (chuyển sang môi trường chứa methanol) nhằm bảo vệ tế bào khỏi stress biến dưỡng và ức chế độc tính.
• Khống chế nghiêm ngặt nồng độ methanol bổ sung không vượt quá 1,0% để duy trì khả năng sống của tế bào nấm men và ngăn chặn sự tích lũy các sản phẩm phụ độc hại như hydrogen peroxid và formaldehyd.

Đóng góp học thuật so với các công bố trước

Phần lớn các công trình công bố trước đây trong và ngoài nước tập trung vào các xylanase thuộc họ GH10 và GH11 (như xynA, xynB, xlnC từ A. niger). Công trình này là một trong những nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam phân lập, nhân dòng và biểu hiện thành công enzym xylanase D từ chủng A. niger DSM1957 – một enzym có đặc tính trình tự tương đồng họ GH43. Đây là họ enzym sở hữu cấu trúc cuộn gập chân vịt $\beta$ năm cánh đặc thù, mở ra hướng khai thác nhóm xylanase mới có khả năng tác động trên các cấu trúc cơ chất hemicellulose phức tạp nhằm định hướng sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ y dược.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế ghi nhận trong văn bản

• Nghiên cứu mới dừng lại ở việc khảo sát đơn yếu tố cho hai thông số ban đầu là thời gian nuôi cấy và nồng độ chất cảm ứng methanol; chưa khảo sát tối ưu hóa đa yếu tố các thành phần dinh dưỡng của môi trường lên men (nguồn nitơ, tỷ lệ khoáng, nồng độ đệm pH).
• Hoạt tính xylanase thu nhận được trong dịch nuôi cấy bình tam giác còn ở mức khiêm tốn ($1,153 - 1,276\ \text{IU/ml}$) do chưa được nuôi cấy trong hệ thống thiết bị lên men sinh học (fermentor) kiểm soát tự động pH, oxy hòa tan và cấp cơ chất liên tục.
• Protein tái tổ hợp mới được nhận diện sơ bộ qua kích thước điện di SDS-PAGE; chưa tiến hành tinh sạch triệt để bằng sắc ký ái lực kim loại (IMAC qua đuôi 6xHis) và chưa xác định chính xác cấu trúc khối lượng phân tử qua khối phổ MALDI-TOF.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tiếp tục tối ưu hóa các thành phần cơ chất môi trường nuôi cấy dinh dưỡng và các thông số công nghệ lên men (pH môi trường, nhiệt độ, tốc độ khuấy đảo và thông khí) để nâng cao sản lượng sinh tổng hợp xylanase D tái tổ hợp trong chủng P. pastoris GS115/pPXlnD.
• Thực hiện tinh sạch enzym rXlnD tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực niken $\text{Ni}^{2+}\text{-NTA}$ nhằm đánh giá độ tinh sạch, hiệu suất thu hồi và xác thực bản chất chuỗi polypeptide bằng khối phổ khối MALDI-TOF.
• Đánh giá toàn diện các đặc tính lý hóa và động học enzym của xylanase D tái tổ hợp: xác định nhiệt độ và pH tối ưu, độ ổn định nhiệt độ, độ bền trong môi trường acid/kiềm, khả năng kháng protease dịch vị (pepsin, trypsin) và ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính xúc tác.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng sử dụng tài liệu: Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học Dược, Hóa sinh học, Vi sinh vật học, Sinh học phân tử và Công nghệ enzym.
• Nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng cao:
  • Thiết kế mồi và dòng hóa gen: Phương pháp thiết kế primer mang vị trí cắt enzym giới hạn tương thích khung đọc mở (EcoRI và NotI) phục vụ biểu hiện định hướng trên vector nấm men.
  • Quy trình biến nạp xung điện nấm men: Thông số kỹ thuật chuẩn hóa cho quy trình biến nạp xung điện trên chủng P. pastoris GS115 (điện thế 1,5 kV, điện dung 25 $\mu\text{F}$, trở kháng 200 $\Omega$) và quy trình kiểm tra tích hợp gen ngoại lai bằng kỹ thuật PCR hai cặp mồi.
  • Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học: Hướng dẫn thực hành chi tiết phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch xylan 0,5% và phương pháp định lượng đường khử theo Miller sử dụng thuốc thử acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS) chuẩn hóa theo đường chuẩn xylose.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Gen mã hóa xylanase D từ chủng Aspergillus niger DSM1957 trong nghiên cứu này có những đặc tính phân tử nào?

Đoạn gen xlnD được khuếch đại thành công từ hệ gen của A. niger DSM1957 có kích thước chính xác là 957 cặp base (bp). Khi giải mã khung đọc mở, đoạn gen này mã hóa một chuỗi polypeptide gồm 318 acid amin với khối lượng phân tử lý thuyết tính toán bằng phần mềm DNAStar là 35,476 kDa, mang trình tự tương đồng hoàn toàn với dữ liệu đăng ký mã số GenBank EU861039.

2. Tại sao vector tái tổ hợp pPXlnD phải được xử lý cắt bằng enzym SacI trước khi biến nạp vào nấm men Pichia pastoris GS115?

Plasmid pPICZ$\alpha$A/xlnD (pPXlnD) được cắt mở vòng tuyến tính hóa bằng enzym SacI tại vị trí nhận biết duy nhất nằm trên vùng promoter AOX1. Việc mở vòng này tạo ra hai đầu phân tử ADN tương đồng với locus AOX1 trên nhiễm sắc thể của tế bào chủ P. pastoris GS115, thúc đẩy quá trình tái tổ hợp trao đổi chéo đồng đoạn diễn ra với tần số cao, giúp cấu trúc biểu hiện tích hợp ổn định và bền vững vào bộ gen nấm men.

3. Phương pháp nào được sử dụng để kiểm chứng đoạn gen ngoại lai đã gắn thành công vào hệ gen của P. pastoris GS115?

Tác giả sử dụng kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuôn ADN bộ gen nấm men với hai hệ mồi độc lập: (1) Cặp mồi đặc hiệu XylD_F và XylD_R cho một băng duy nhất kích thước khoảng 1000 bp tương ứng với gen xlnD; (2) Cặp mồi 5'AOX1 và 3'AOX1 cho hai băng điện di rõ rệt gồm một băng 2200 bp (tương ứng vùng locus AOX1 nguyên vẹn của nấm men chủ) và một băng 1400 bp (tương ứng đoạn gen xlnD chèn giữa vùng đa điểm cắt trên thân vector pPICZ$\alpha$A).

4. Kết quả khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng tái tổ hợp XpPXlnD đạt được những thông số nào?

Quá trình khảo sát đơn yếu tố ghi nhận thời gian biểu hiện tối ưu là 120 giờ sau cảm ứng, cho hoạt tính enzym đạt $1,233 \pm 0,037\ \text{IU/ml}$. Về nồng độ cơ chất cảm ứng, việc bổ sung 1,0% (v/v) methanol định kỳ mỗi 24 giờ cho hoạt tính xylanase ngoại bào cao nhất đạt $1,153 \pm 0,050\ \text{IU/ml}$ cùng mật độ sinh khối tế bào đạt $\text{OD}_{600} = 7,66$.

5. Vì sao khi nồng độ methanol cảm ứng tăng lên mức 1,5% - 2,0% thì mật độ tế bào và hoạt tính xylanase lại suy giảm mạnh?

Ở nồng độ methanol cao (1,5% - 2,0%), tốc độ oxy hóa methanol của enzym alcohol oxidase tăng nhanh dẫn đến sự giải phóng và tích lũy một lượng lớn formaldehyd và hydrogen peroxid ($\text{H}_2\text{O}2$) vượt quá khả năng giải độc của peroxisome. Điều này gây độc tế bào nấm men, dẫn tới ức chế sinh trưởng mạnh (mật độ quang $\text{OD}{600}$ sụt giảm xuống còn 1,12 ở nồng độ 2,0%) và làm suy giảm hoạt tính sinh tổng hợp protein ngoại bào xuống $0,919 \pm 0,009\ \text{IU/ml}$.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Nguyễn Xuân Chiến đã hoàn thành đầy đủ hai mục tiêu nghiên cứu thông qua việc nhân dòng chính xác đoạn gen xlnD (957 bp) từ nấm sợi Aspergillus niger DSM1957 và thiết kế thành công vector biểu hiện pPICZ$\alpha$A/xlnD. Nghiên cứu đã tạo thành công chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris GS115 mang gen xlnD tích hợp bền vững trên hệ gen, có khả năng tiết xylanase D ngoại bào với khối lượng phân tử $> 35\ \text{kDa}$ và có hoạt tính xúc tác thủy phân xylan rõ rệt. Với các điều kiện cảm ứng bước đầu được xác lập (thời gian nuôi cấy 120 giờ, nồng độ methanol 1,0%), công trình cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc phục vụ các định hướng tối ưu hóa lên men, tinh sạch và ứng dụng enzym xylanase tái tổ hợp trong sản xuất các chế phẩm prebiotic và thực phẩm chức năng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Định nghĩa Xylanase là glycosidase (O-glycosid hydrolase, EC 3.x) xúc tác quá trình thủy phân các liên kết 1,4-β-D-xylosidic trong xylan. Các enzym này giúp phân giải polysaccharid xylan mạch thẳng thành xylose, một nguồn carbon chính cho quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật. Xylanase được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1955 [38], ban đầu chúng được gọi là pentosanase, và được Liên minh Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế (IUBMB) công nhận vào năm 1961 khi được gán mã enzym EC 3.

Tên chính thức của chúng là endo-1,4-β-xylanase, nhưng các thuật ngữ đồng nghĩa thường được sử dụng bao gồm xylanase, endoxylanase, 1,4-β-D-xylan-xylanohydrolase, endo-1,4-β-D-xylanase, β- 1,4-xylanase và β-xylanase. Phân loại Hệ thống phân loại các xylanase được giới thiệu năm 1989 [34] phân loại dựa trên sự so sánh cấu trúc sơ cấp của các vùng xúc tác và các nhóm enzym trong các họ có trình tự liên quan. Phân loại ban đầu đã nhóm các cellulase và xylanase thành 6 họ (A-F) [34], và được cập nhật thành 77 họ vào năm 1999 (1-77) [35] và tiếp tục phát triển khi các trình tự glycosidase mới được xác định. Hiện tại, có 172 họ glycosid hydrolase tồn tại được chú thích trong cơ sở dữ liệu CAZy [45].

Về cơ bản, xylanase được chia vào hai họ GH10 và GH11 dựa trên trình tự gen, xylanase cũng được tìm thấy trong các họ glycosid hydrolase khác, chẳng hạn như GH 5, 7, 8 và 43 [43]. Nguồn gốc và đặc tính Xylanase được tạo ra bởi nấm, vi khuẩn, nấm men, tảo biển, động vật nguyên sinh, ốc sên, động vật giáp xác, côn trùng,… [59]. Những xylanase này có đặc tính hóa lý, cấu trúc, khả năng hoạt động, sản lượng và tính đặc hiệu không giống nhau, do đó làm tăng hiệu quả và mức độ thủy phân xylan, cũng như sự đa dạng và phức tạp của các xylanase. Sự đa dạng này có thể là kết quả của sự dư thừa di truyền, một số trường hợp do sự khác biệt xử lý sau dịch mã.

Xylanase được tạo ra bởi vi khuẩn và xạ khuẩn (Bacillus sp.) hoạt động hiệu quả trong phạm vi pH rộng hơn từ 5-9, với nhiệt độ tối ưu cho hoạt động xylanase từ 35ºC đến 60ºC [52]. Các nghiên cứu về Bacillus spp. cho thấy hoạt tính xylanase cao hơn ở pH kiềm và nhiệt độ cao [48]. Nấm (Aspergillus spp.) là những nhà sản xuất xylanase quan trọng do giải phóng xylanase ngoại bào với sản lượng enzym cao.

Ngoài ra, xylanase của nấm có hoạt tính cao hơn so với vi khuẩn hoặc nấm men. Tuy nhiên, xylanase có nguồn gốc từ nấm có một số đặc điểm khiến chúng không khả dụng cho 3 một số ứng dụng công nghiệp [48]. Hầu hết các xylanase này hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ 40-60ºC và phạm vi pH từ 4-7 [13] [28]. Xylanase có thể được sản xuất công nhiệp bằng quá trình lên men rắn (SSF) hoặc lên men chìm (SmF), năng suất sinh enzym trong SSF cao hơn nhiều so với trong SmF [78].

Tuy nhiên, SSF hiện chỉ được sử dụng ở một mức độ nhỏ để sản xuất enzym và chất chuyển hóa thứ cấp do một số vấn đề về kỹ thuật quy trình. Ứng dụng Xylanase có nhiều ứng dụng công nghiệp từ công nghiệp giấy và bột giấy đến công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Ứng dụng chính của xylanase là biến đổi sinh học sinh khối lignocellulose hoặc chất thải nông nghiệp thành các sản phẩm lên men [59]. Xylanase đã được ứng dụng hiệu quả trong tẩy trắng sinh học và quá trình phân hủy sinh học của ngành công nghiệp giấy và bột giấy.

Xylanase giúp giảm hàm lượng lignin và tăng độ sáng của bột giấy [40]. Xylanase ổn nhiệt hỗ trợ quá trình đường hóa sinh khối lignocellulose thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao trước khi sản xuất cồn sinh học. Do đó, xylanase cũng đóng góp một vai trò quan trọng trong ngành nhiên liệu sinh học [60]. Các loại thức ăn chăn nuôi phổ biến như ngũ cốc, lúa mạch, và thức ăn có đậu nành rất giàu sinh khối lignocellulose.

Xử lý bằng xylanase đối với thức ăn chăn nuôi sẽ tạo điều kiện giải phóng các chất dinh dưỡng trong các đại phân tử, do đó các enzym tiêu hóa có thể tiếp cận tốt hơn với cơ chất của chúng, giúp cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn chăn nuôi [65]. Ứng dụng xylanase trong lĩnh vực y dược trong những năm gần đây đang ngày càng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trong nước và trên thế giới. Các phương pháp enzym được ưu tiên để sản xuất các oligosaccharid thực phẩm và thuốc. Sản phẩm thủy phân được xúc tác bởi enzym còn tạo ra các sản phẩm có tác dụng sinh học cao.

Việc sử dụng phương pháp enzym hiện nay còn được coi là kinh tế, nhanh chóng và thân thiện với môi trường hơn so với các phương pháp xử lý hóa lý để tạo các sản phẩm thủy phân, quá trình xử lý bằng enzym không tạo ra các hợp chất có hại cũng như không yêu cầu các thiết bị đặc biệt [10] [41]. Quá trình thủy phân xylan được xúc tác bởi xylanase tạo ra xylo-oligosaccharid (XOS). Các oligosaccharid (xylo-oligomers, cello-oligomers) cho thấy một số ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và dinh dưỡng. XOS có đặc tính prebiotics và có thể được sản xuất bằng cách thủy phân xylan từ các nguồn khác nhau như lõi ngô, vỏ lúa mạch, vỏ trấu, rơm, lúa mì [53].

XOS ổn định ở nhiệt độ cao và pH có tính acid là nguồn carbon thích hợp giúp tăng cường hệ vi khuẩn có lợi ở đường ruột như Bifidobacteria, giúp tăng cường sức khỏe, cải thiện hệ tiêu hóa [21]. XOS cũng 4 được sử dụng trong một số sản phẩm đồ uống như sữa đậu nành, trà, cà phê và các sản phẩm từ sữa khác [39]. Cấu trúc và tính chất của XOS có thể thay đổi do sự thay đổi về mức độ trùng hợp, các phương pháp được sử dụng để chiết xuất và loại liên kết hiện có. XOS có tiềm năng đáng chú ý là prebiotics mới và cho thấy nhiều lợi ích khác nhau như tăng khả năng hấp thụ calci để tăng hoạt tính sinh học [54], hoạt tính gây độc tế bào trên bệnh bạch cầu [5], cải thiện chức năng ruột [70], giảm thiểu nguy cơ ung thư ruột kết [70], tác dụng cụ thể trên vị trí đối với bệnh đái tháo đường týp II [66], và các đặc tính chống oxy hóa [69].

XOS cũng đã chứng minh khả năng trong việc tổng hợp các hợp chất hoạt động chống lại các hợp chất gây ung thư và virus. Sự thay đổi cấu trúc của oligosaccharid đã cho thấy các đặc tính khác như kháng virus, kháng u, chống đông máu và các đặc tính tái tạo mô/sụn [55]. Nguồn gốc và vai trò của các oligosaccharid khác nhau [10] Oligosaccharids Nguồn cung cấp Chức năng Vỏ trấu Bengal, cám Chất chống oxy hóa, mỹ phẩm, Xylo-oligosaccharid lúa mì và rơm rạ, gỗ chất điều chỉnh, chất kích thích (XOS) cây dương, vỏ lúa tăng trưởng thực vật, prebiotic, mạch,. điều trị đái tháo đường,… Tỏi, cà chua, hành tây, mật ong, lúa mạch đen, lúa mạch, Các đặc tính cariogenic, giá trị Fructo-oligosaccharid chuối diếp xoăn, calo thấp.

thanh long, măng tây,… Phản ứng kích thích sinh trưởng Arabino-oligosaccharid của vi khuẩn trong ruột kết, tạo Củ cải đường (AOS) điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng dinh dưỡng của động vật. Các hoạt động chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, bảo vệ các Chitosan-oligosaccharid Sản phẩm khử phân tế bào bình thường khỏi quá trình (COS) tử chitosan apoptosis, chống tăng huyết áp, chống vi khuẩn và chống lại các tế bào ung thư, ung thư vú. Sữa bò và sữa người, Có tác dụng trên sức khỏe đường Galacto-oligosaccharid đường Lactose, hạt ruột, ung thư ruột kết, bệnh viêm đậu nành ruột. 5 Đậu cô ve, cẩm quỳ, đậu Hà Lan, hạt các Phòng trừ dịch bệnh cho động thực Raffinose-oligosaccharid loại đậu, đậu lăng, vật và con người.

đậu, composite và mù tạt Tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển ưu tiên của vi khuẩn Human milk Sữa mẹ bifidobacteria và lactobacilli oligosaccharid (HMO) trong ruột kết của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ. Beta-Glucan Chế độ ăn kiêng dựa Tạo hiệu ứng “lactobacillogenic” oligosaccharid trên yến mạch tốt hơn. Thực vật bậc cao, Được sử dụng trong sữa công thức Pectin-derived acidic bao gồm trái cây và cho trẻ sơ sinh, làm giảm tiêu oligosaccharid (pAOS) rau quả, trái cây chảy. Mannan-oligosaccharid Các mảnh thành tế Điều chỉnh hệ vi sinh vật đường (MOS) bào của nấm men ruột của cá tráp biển vàng.

Algae derived marin Kích thích miễn dịch, chất chống oligosaccharid (ADMO) ung thư. Bảo vệ hiệu quả HDO chống lại sự Oligo-diaminogalactose phân cắt RNase A mà không làm (ODAGal) giảm hoạt tính RNase H của gapmer. Cello-oligosaccharid Dược phẩm, công thức thức ăn chăn nuôi và ứng dụng thực phẩm Bản chất không tiêu hóa của Rơm rạ, rơm lúa mì, Manno-oligosaccharid prebiotic, phản ứng kích thích sự lõi ngô, kẹo cao su phát triển của vi khuẩn trong ruột guar kết. Pectic-oligosaccharid Đặc tính chống kết dính.

Xylanase từ Aspergillus 1. Chi Aspergillus Chi Aspergillus bao gồm hơn 340 loài nấm sợi được chính thức chấp nhận là một trong những loài nấm phổ biến và phân bố khắp nơi trên trái đất [58]. Trong tự nhiên, nấm Aspergillus là tác nhân chính phân hủy các chất hữu cơ khác nhau. Nấm Aspergillus cũng gây ra một số bệnh và tạo ra các độc tố khác nhau gây hại cho thực vật.

Một số loài Aspergillus, chẳng hạn như A. flavus, có thể ảnh hưởng nghiêm 6 trọng đến sức khỏe cộng đồng bằng cách gây ra bệnh aspergillosis xâm lấn hoặc aspergillosis phế quản phổi dị ứng [19], [33]. Một số loài bao gồm A. parasiticus có thể làm ô nhiễm thực phẩm và thức ăn có nguồn gốc thực vật với độc tố aflatoxin nấm mốc, là chất gây ung thư mạnh nhất được tìm thấy trong tự nhiên.

Sử dụng thực phẩm hoặc thức ăn nhiễm aflatoxin có thể dẫn đến các tình trạng nghiêm trọng như nhiễm độc aflatoxin, hoại tử gan hoặc ung thư gan [33]. Mặc dù vậy, nhiều loài Aspergillus được sử dụng để sản xuất enzym, lên men thực phẩm, công nghệ sinh học và sản xuất dược phẩm. oryzae được sử dụng rộng rãi để lên men thực phẩm truyền thống ở Đông Á [37], A. niger được sử dụng để sản xuất các enzym khác nhau như amylase [6] và pectinase [44] và acid hữu cơ như acid citric [58].

Kể từ khi xylanase sinh ra từ A. niger lần đầu tiên được tinh sạch và biểu hiện vào năm 1977, A. niger được coi như một nhà sản xuất xylanase xuất sắc. Hiện nay, nhiều gen xylanase mới từ A.

niger mới đã được phân lập, nhân dòng và biểu hiện. Gen mã hóa xylanase từ chủng Aspergillus niger Tính đến nay, đã có 551 gen mã hóa cho protein khác nhau từ A. niger được giải trình tự hoàn toàn và lưu trữ trên kho lưu trữ Uniprot [73].