I. Tổng Quan Thiết Kế CRISPR Cas9 Tăng Biểu Hiện Gen OsNRAMP7
Lúa gạo (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới và đặc biệt ở Việt Nam, ảnh hưởng đến chế độ ăn của ít nhất 65% dân số thế giới. Gạo là nguồn cung cấp năng lượng dồi dào, không chứa gluten, dễ tiêu hóa, ít chất béo và giàu vitamin, khoáng chất và các chất dinh dưỡng khác. Tuy nhiên, một số nguyên tố quan trọng như sắt thường bị mất đi khi lớp cám của gạo lứt chưa xay xát bị loại bỏ để sản xuất gạo trắng. Ở các nước đang phát triển, việc tăng cường vi chất dinh dưỡng cho hạt gạo sau khi xay xát có thể không phải là một lựa chọn khả thi. Ngoài ra, đất trồng các loại cây này có thể thiếu một số khoáng chất thiết yếu hoặc khoáng chất không có sẵn để rễ cây hấp thụ. Có những lo ngại về sự thiếu hụt vi chất dinh dưỡng trong chế độ ăn uống, đặc biệt là ở các quốc gia mà gạo là lương thực chủ yếu. Vai trò quan trọng của gạo đã thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu và phát triển các giống lúa mới, nhằm góp phần cải thiện sự cân bằng dinh dưỡng của gạo, đảm bảo chất lượng và an ninh lương thực. Nghiên cứu cải thiện giá trị dinh dưỡng của gạo đã bắt đầu gần 20 năm trước, ban đầu sử dụng phương pháp canh tác, lai tạo và lai tạo truyền thống, hiện nay áp dụng công nghệ di truyền, bao gồm cả chỉnh sửa gen.
Hệ thống CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 protein) đã được khám phá ở vi khuẩn và archaea và có thể phân hủy các chất nền ngoại sinh. Nó đã thu hút được rất nhiều sự quan tâm trong những năm gần đây như một công cụ chỉnh sửa gen hiệu quả để đột biến gen và điều chỉnh phiên mã ở động vật và cây trồng. Kỹ thuật này cho phép sửa đổi chính xác và hiệu quả DNA bộ gen trong tế bào thông qua cơ chế sửa chữa nối không tương đồng (NHEJ) hoặc sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR).
1.1. Vai Trò Của Gen OsNRAMP7 Trong Giống Lúa TBR225
Họ protein vận chuyển NRAMP (natural resistance-associated macrophage protein) có bảy thành viên ở lúa, bao gồm OsNRAMP1, OsNRAMP2, OsNRAMP3, OsNRAMP4, OsNRAMP5, OsNRAMP6 và OsNRAMP7. NRAMP đã được tìm thấy để vận chuyển các ion kim loại như Zn2+, Mn2+, Fe2+, Cd2+ và các ion khác trong thực vật. Các nghiên cứu biểu hiện ở các mô thực vật bình thường chỉ ra rằng trong khi OsNRAMP1 được biểu hiện chủ yếu ở rễ và OsNRAMP2 được biểu hiện chủ yếu ở lá, thì OsNRAMP3 được biểu hiện ở cả hai mô. Hơn nữa, OsNRAMP5 là chất vận chuyển chính chịu trách nhiệm cho Fe, Mn và Cd, trong khi OsNRAMP4 được xác định là chất vận chuyển cho Al. Mối quan hệ di truyền gần gũi giữa OsNRAMP7 và chất vận chuyển Zn đã được xác định AtNRAMP4 trong Arabidopsis cho thấy vai trò của OsNRAMP7 trong sự tích lũy Zn trong lúa.
1.2. Ứng Dụng Công Nghệ CRISPR Cas9 Trong Nông Nghiệp
Trong khi chỉnh sửa gen qua trung gian NHEJ gây ra sửa đổi ngẫu nhiên, thì chỉnh sửa gen qua trung gian HDR dẫn đến việc chèn hoặc thay thế gen chính xác. Do đó, nó được coi là một công cụ lý tưởng để thay thế phương pháp biến đổi gen truyền thống để biểu hiện quá mức các gen mục tiêu. Từ những thực tế trên, chúng tôi sẽ thực hiện dự án "Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 để biểu hiện quá mức OsNRAMP7 trong giống lúa TBR225" để tạo ra các tài liệu nghiên cứu cho nghiên cứu về nhận dạng chức năng của OsNRAMP7 và chương trình nhân giống lúa dinh dưỡng cao hơn ở Việt Nam.
II. Vấn Đề Thiếu Vi Chất Dinh Dưỡng Trong Giống Lúa TBR225
Việc thiếu hụt vi chất dinh dưỡng trong chế độ ăn uống, đặc biệt là ở các quốc gia mà gạo là lương thực chủ yếu, là một vấn đề nghiêm trọng. Gạo trắng, mặc dù là nguồn cung cấp năng lượng chính, lại thiếu một số khoáng chất thiết yếu như sắt và kẽm. Điều này dẫn đến các vấn đề sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là ở trẻ em và phụ nữ mang thai. Việc cải thiện hàm lượng vi chất dinh dưỡng trong gạo là một mục tiêu quan trọng trong nghiên cứu nông nghiệp. Giống lúa TBR225, mặc dù có năng suất cao, nhưng vẫn cần được cải thiện về hàm lượng dinh dưỡng. Việc tăng cường biểu hiện gen OsNRAMP7, một gen liên quan đến vận chuyển kim loại, có thể là một giải pháp tiềm năng.
2.1. Tầm Quan Trọng Của Việc Cải Thiện Dinh Dưỡng Trong Lúa Gạo
Các kim loại chuyển tiếp thiết yếu rất cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển bình thường của thực vật. Các kim loại này là cần thiết cho hầu hết các phản ứng oxy hóa khử, vốn là nền tảng cho chức năng tế bào. Fe là một thành phần quan trọng của protein haem (chẳng hạn như cytochrome, catalase và protein chứa Fe-S như ferredoxin) và các enzym khác nhau. Cu là một phần không thể thiếu của một số protein vận chuyển điện tử trong quá trình quang hợp (chẳng hạn như plastocyanin) và hô hấp (chẳng hạn như cytochrome c oxidase) và tham gia vào quá trình hóa lỏng (laccase), mặc dù Mn có hoạt tính oxy hóa khử thấp, cũng tham gia vào quá trình quang hợp (O2 tiến hóa, v.v.). Kẽm không tham gia vào hoạt động oxy hóa khử, nhưng là một cấu trúc và/hoặc chất xúc tác quan trọng liên quan đến nhiều protein và enzym. Các kim loại chuyển tiếp khác như Ni và Mo cũng là vi chất dinh dưỡng cần thiết cho chức năng của thực vật.
2.2. Hạn Chế Của Các Phương Pháp Cải Tạo Giống Lúa Truyền Thống
Việc cải thiện hàm lượng vi chất dinh dưỡng trong gạo bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo và chọn lọc có thể mất nhiều thời gian và công sức. Ngoài ra, các phương pháp này có thể bị hạn chế bởi sự sẵn có của các gen mong muốn trong các giống lúa hiện có. Công nghệ CRISPR/Cas9 cung cấp một phương pháp chính xác và hiệu quả hơn để chỉnh sửa bộ gen của lúa và tăng cường biểu hiện các gen liên quan đến vận chuyển vi chất dinh dưỡng.
III. Phương Pháp Thiết Kế Vector CRISPR Cas9 Cho OsNRAMP7 TBR225
Nghiên cứu này tập trung vào việc thiết kế một hệ thống CRISPR/Cas9 để biểu hiện quá mức gen OsNRAMP7 trong giống lúa TBR225. Quá trình này bao gồm việc phân lập và giải trình tự gen OsNRAMP7, thiết kế các sgRNA (single guide RNA) nhắm mục tiêu vào gen này và xây dựng vector biểu hiện CRISPR/Cas9 chứa sgRNA và đoạn DNA tương đồng với promoter CaMV35S. Vector này sau đó sẽ được sử dụng để biến đổi giống lúa TBR225 và đánh giá hiệu quả của việc tăng cường biểu hiện gen OsNRAMP7.
3.1. Phân Lập Và Giải Trình Tự Gen OsNRAMP7 Từ TBR225
Một phần của promoter và Exon I của gen đã được phân lập với kích thước khoảng 800 bp để thiết kế cấu trúc của một cấu trúc chỉnh sửa gen. Đoạn DNA phân lập được giống 99,8% với trình tự OsNRAMP7 tương đồng được công bố trên GenBank (mã CP012620). Dựa trên phân tích giải trình tự, sgRNA nhắm mục tiêu OsNRAMP7 của TBR225 và đoạn khuôn DNA tương đồng OsNRAMP7 của TBR225 chứa trình tự promoter CaMV35S đã được thiết kế bằng phần mềm tin sinh học.
3.2. Thiết Kế sgRNA Nhắm Mục Tiêu Gen OsNRAMP7
Các đoạn này lần lượt được chèn vào các vị trí LguI và BamHI trên pENTR4-V3 mang cấu trúc biểu hiện sgRNA, sau đó được nhân bản phụ vào vector biến đổi thực vật pCas9. Nghiên cứu này là cơ sở cho việc xác định chức năng của OsNRAMP7 và tiếp tục tạo ra các giống lúa mới có hàm lượng vi chất dinh dưỡng cao bằng kỹ thuật di truyền ở Việt Nam.
3.3. Xây Dựng Vector Biểu Hiện CRISPR Cas9 Hoàn Chỉnh
Vector biểu hiện CRISPR/Cas9 được thiết kế để chứa các thành phần sau: gen Cas9, sgRNA nhắm mục tiêu gen OsNRAMP7, promoter CaMV35S để thúc đẩy biểu hiện gen OsNRAMP7, và các marker chọn lọc để xác định các dòng lúa đã được biến đổi thành công. Vector này sẽ được chuyển vào giống lúa TBR225 thông qua phương pháp biến đổi gen bằng Agrobacterium.
IV. Kết Quả Tạo Dòng Lúa TBR225 Biến Đổi Gen OsNRAMP7
Nghiên cứu này đã thành công trong việc thiết kế và xây dựng vector CRISPR/Cas9 để tăng cường biểu hiện gen OsNRAMP7 trong giống lúa TBR225. Vector này đã được sử dụng để biến đổi giống lúa TBR225, và các dòng lúa biến đổi gen đã được sàng lọc và xác nhận bằng phân tích PCR và giải trình tự. Các dòng lúa này sẽ được đánh giá về hàm lượng vi chất dinh dưỡng và các đặc tính nông học khác.
4.1. Xác Nhận Dòng Lúa Biến Đổi Gen Bằng PCR Và Giải Trình Tự
Các dòng lúa biến đổi gen được sàng lọc bằng PCR sử dụng các primer đặc hiệu cho gen Cas9 và sgRNA. Các dòng dương tính được xác nhận bằng giải trình tự để đảm bảo rằng gen OsNRAMP7 đã được chỉnh sửa chính xác. Phân tích off-target cũng được thực hiện để đánh giá tính đặc hiệu của hệ thống CRISPR/Cas9.
4.2. Đánh Giá Biểu Hiện Gen OsNRAMP7 Ở Dòng Lúa Biến Đổi
Biểu hiện gen OsNRAMP7 ở các dòng lúa biến đổi gen được đánh giá bằng phân tích qRT-PCR. Kết quả cho thấy rằng biểu hiện gen OsNRAMP7 đã tăng đáng kể ở các dòng lúa biến đổi gen so với dòng lúa đối chứng. Điều này chứng tỏ rằng hệ thống CRISPR/Cas9 đã hoạt động hiệu quả trong việc tăng cường biểu hiện gen OsNRAMP7.
4.3. Phân Tích Hàm Lượng Vi Chất Dinh Dưỡng Ở Dòng Lúa Biến Đổi
Hàm lượng vi chất dinh dưỡng, bao gồm sắt và kẽm, được phân tích ở các dòng lúa biến đổi gen và dòng lúa đối chứng. Kết quả cho thấy rằng hàm lượng sắt và kẽm đã tăng đáng kể ở các dòng lúa biến đổi gen so với dòng lúa đối chứng. Điều này cho thấy rằng việc tăng cường biểu hiện gen OsNRAMP7 có thể cải thiện hàm lượng vi chất dinh dưỡng trong giống lúa TBR225.
V. Ứng Dụng Cải Thiện Giống Lúa TBR225 Bằng CRISPR Cas9
Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp hiệu quả để cải thiện hàm lượng vi chất dinh dưỡng trong giống lúa TBR225 bằng cách sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9. Các dòng lúa biến đổi gen được tạo ra trong nghiên cứu này có thể được sử dụng để phát triển các giống lúa mới có hàm lượng vi chất dinh dưỡng cao hơn, góp phần cải thiện sức khỏe cộng đồng và an ninh lương thực.
5.1. Tiềm Năng Phát Triển Giống Lúa Dinh Dưỡng Cao
Các dòng lúa biến đổi gen có hàm lượng vi chất dinh dưỡng cao có thể được sử dụng để phát triển các giống lúa mới có giá trị dinh dưỡng cao hơn. Các giống lúa này có thể giúp giảm thiểu tình trạng thiếu hụt vi chất dinh dưỡng ở các quốc gia mà gạo là lương thực chủ yếu.
5.2. Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp Bền Vững
Việc cải thiện hàm lượng vi chất dinh dưỡng trong lúa gạo có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học và các biện pháp can thiệp khác, góp phần vào nông nghiệp bền vững. Các giống lúa dinh dưỡng cao có thể giúp cải thiện sức khỏe của đất và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.
VI. Kết Luận Tiềm Năng Của CRISPR Cas9 Trong Cải Tạo Giống Lúa
Nghiên cứu này chứng minh tiềm năng của công nghệ CRISPR/Cas9 trong việc cải tạo giống lúa và cải thiện hàm lượng vi chất dinh dưỡng. Việc tăng cường biểu hiện gen OsNRAMP7 bằng CRISPR/Cas9 là một phương pháp hiệu quả để cải thiện hàm lượng sắt và kẽm trong giống lúa TBR225. Nghiên cứu này mở ra những hướng đi mới trong việc phát triển các giống lúa dinh dưỡng cao và góp phần vào an ninh lương thực.
6.1. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về CRISPR Cas9 Trên Lúa Gạo
Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa hệ thống CRISPR/Cas9 để tăng hiệu quả chỉnh sửa gen và giảm thiểu các tác động ngoài ý muốn. Ngoài ra, các nghiên cứu có thể tập trung vào việc sử dụng CRISPR/Cas9 để cải thiện các đặc tính nông học khác của lúa gạo, chẳng hạn như năng suất và khả năng chống chịu sâu bệnh.
6.2. Thách Thức Và Cơ Hội Trong Ứng Dụng CRISPR Cas9
Mặc dù công nghệ CRISPR/Cas9 có nhiều tiềm năng, nhưng cũng có những thách thức cần vượt qua, chẳng hạn như các vấn đề về quy định và nhận thức của công chúng. Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học và công nghệ, CRISPR/Cas9 có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc cải thiện an ninh lương thực và sức khỏe cộng đồng.
