Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực thiết yếu, cung cấp 50–80% lượng calo, protein, khoáng chất và vitamin hàng ngày cho hơn 65% dân số thế giới, đặc biệt là tại các quốc gia đang phát triển ở châu Á. Tuy nhiên, các vi chất dinh dưỡng quan trọng như sắt (Fe) và kẽm (Zn) tập trung chủ yếu ở lớp vỏ cám (aleurone) và phôi; trong quá trình xay xát để sản xuất gạo trắng thương phẩm, khoảng 25–30% lượng Zn và phần lớn lượng Fe bị mất đi. Gạo trắng sau xay xát chỉ chứa trung bình khoảng 2 mg Fe/kg và 12 mg Zn/kg, không đáp ứng đủ nhu cầu khuyến nghị hàng ngày của con người (10–15 mg Fe và 9–11 ppm Zn). Tình trạng "nạn đói tiềm ẩn" (thiếu hụt vi chất dinh dưỡng trong khẩu phần ăn) đang ảnh hưởng tới hơn 2 tỷ người trên toàn cầu, gây ra các hậu quả nghiêm trọng như thiếu máu, suy giảm miễn dịch, còi cọc và suy giảm nhận thức ở trẻ em.

Họ protein NRAMP (Natural resistance-associated macrophage protein) ở thực vật đảm nhận vai trò vận chuyển các ion kim loại hóa trị hai qua màng tế bào. Ở cây lúa, họ gen này gồm các thành viên như OsNRAMP1, OsNRAMP2, OsNRAMP3, OsNRAMP4, OsNRAMP5, OsNRAMP6, OsNRAMP7 và OsNRAMP8. Trong đó, các gen OsNRAMP1, OsNRAMP4, OsNRAMP5, OsNRAMP6 đã được chứng minh tham gia vận chuyển Fe, Mn, Cd và Al. Gen OsNRAMP7 có mối quan hệ di truyền gần gũi với gen AtNRAMP4 và AtNRAMP5 ở cây mô hình Arabidopsis thaliana (nhóm gen có chức năng hấp thu và tích lũy Zn). Mặc dù vậy, các nghiên cứu chuyên sâu về chức năng của OsNRAMP7 trên các giống lúa trồng phổ biến ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế.

Đề tài khóa luận tập trung giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu sau:

  1. Mục tiêu tổng quát: Thiết kế cấu trúc vector T-DNA biểu hiện quá mức (overexpression) gen OsNRAMP7 liên quan đến sự tích lũy kim loại ở giống lúa thuần chất lượng TBR225 của Việt Nam.
  2. Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:
    • Phân lập vùng mã hóa (ORF) của gen OsNRAMP7 từ thư viện cDNA của giống lúa TBR225 (OsNRAMP7-TBR).
    • Tạo dòng gen OsNRAMP7-TBR vào vector nhân dòng trung gian pJET1.2.
    • Thiết kế vector T-DNA biểu hiện thực vật mang gen OsNRAMP7-TBR dưới sự điều hòa của promoter cấu trúc Ubiquitin (pCAM-Ubi/OsNRAMP7-TBR).
    • Biến nạp vector biểu hiện tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 phục vụ cho công tác chuyển gen thực vật.
  3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
    • Đối tượng nghiên cứu: Trình tự vùng mã hóa của gen OsNRAMP7 phân lập từ giống lúa TBR225.
    • Không gian thực hiện: Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (AGI).
    • Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 08 năm 2022 đến tháng 12 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

  • Cơ chế phân tử của quá trình tích lũy vi chất ở lúa: Quá trình thu nhận, vận chuyển và tích lũy kim loại vi lượng (Fe, Zn, Mn) trong cây lúa chịu sự kiểm soát của nhiều họ gen chuyên biệt, bao gồm các họ gen tổng hợp hợp chất mang sắt thực vật (OsNAS, OsNAAT, OsDMAS, OsTOM1), họ protein vận chuyển màng tế bào ZIP (OsZIP1, OsZIP3), họ vận chuyển không bào (OsVIT1, OsVIT2, OsOZT1), họ protein vận chuyển qua mạch rây (OsYSL2, OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14), protein vận chuyển kim loại nặng (OsHMA2, OsHMA3), protein dự trữ sắt (OsFer2) và các yếu tố phiên mã điều hòa (OsIDEF1, OsIDEF2, OsIRO2, OsNAC5).
  • Đặc tính sinh học của protein họ NRAMP: Là các kênh vận chuyển ion kim loại xuyên màng có phổ cơ chất rộng đối với các ion kim loại chuyển tiếp ($Fe^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Mn^{2+}$, $Cd^{2+}$). Các nghiên cứu bổ cứu trên nấm men đột biến khuyết dưỡng (fet3fet4, smf1, zrt1zrt2) đã khẳng định khả năng vận chuyển đồng hóa trị giữa ion kim loại và proton ($H^+$) của protein NRAMP.
  • Cơ chế chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens: Kỹ thuật chuyển gen gián tiếp dựa trên plasmid gây khối u (Ti-plasmid) kích thước ~200 kb. Vùng T-DNA được giới hạn bởi hai trình tự lặp lại 25 bp là biên trái (Left Border - LB) và biên phải (Right Border - RB). Vùng độc lực (Virulence Region - VIR) dài ~40 kb chứa các cụm gen virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG, virH, virJ/AcvB chịu trách nhiệm nhận diện tín hiệu cảm ứng từ mô tổn thương (phenolic, acetosyringone, pH 5,0–5,5), cắt tạo chuỗi T-DNA đơn, bảo vệ phức hợp T-DNA-protein và vận chuyển qua màng tế bào vào nhân thực vật. Hệ thống vector nhị thể (binary vector system) phân tách vùng T-DNA và vùng VIR trên hai plasmid độc lập, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thao tác dòng hóa gen ngoại lai.
  • Đặc điểm giống lúa TBR225: Giống lúa thuần do tác giả Trần Mạnh Báo và cộng sự chọn tạo, được công nhận giống quốc gia năm 2015. Giống có thời gian sinh trưởng ngắn (120–125 ngày vụ Xuân; 105–110 ngày vụ Mùa), chiều cao cây 110–115 cm, chống chịu rét và đổ ngã, năng suất trung bình đạt 70–75 tạ/ha (thâm canh đạt 85–90 tạ/ha), tỷ lệ gạo xát đạt 72–74%, hàm lượng amylose thấp (13,7%), hạt gạo trong và cơm mềm có mùi thơm đặc trưng.

Phương pháp nghiên cứu và vật liệu sinh học

Nghiên cứu sử dụng hệ thống phương pháp sinh học phân tử thực nghiệm:

  • Tách chiết plasmid: Sử dụng bộ kít GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Fisher Scientific) từ tế bào vi khuẩn nuôi cấy qua đêm trong môi trường LB lỏng ở 37°C, 220 rpm.
  • Kỹ thuật PCR và khuếch đại gen: Thực hiện trên máy luân nhiệt tự động Perkin Elmer 9700. Chu trình nhiệt gồm: biến tính ban đầu ở 95°C trong 30 giây; 35 chu kỳ tiếp theo gồm biến tính ở 95°C (30 giây), gắn mồi ở 55°C (30 giây), kéo dài chuỗi ở 72°C (1 phút 30 giây); kết thúc phản ứng ở 72°C trong 10 phút.
  • Điện di gel agarose: Kiểm tra kích thước và độ tinh sạch của sản phẩm ADN trên gel agarose 1,0% pha trong đệm 1X TAE, nhuộm huỳnh quang bằng Ethidium bromide (EtBr), ghi nhận hình ảnh trên máy chụp UV Firereader (UVITEC).
  • Thu hồi và tinh sạch DNA từ gel: Sử dụng bộ kít GeneJET Gel Extraction (Thermo Fisher Scientific).
  • Phản ứng nối ghép DNA (Ligation): Sử dụng enzyme T4 DNA ligase ở 22°C trong 30 phút, sau đó giữ ở 4°C qua đêm.
  • Biến nạp di truyền: Biến nạp vector vào tế bào khả biến Escherichia coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt (42°C trong 50 giây); biến nạp vào chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 bằng phương pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bể ổn nhiệt 37°C (5 phút).
  • Cắt DNA bằng enzyme giới hạn: Sử dụng các enzyme cắt giới hạn chuyên biệt (BamHI, BglII, HindIII, EcoRI) ở điều kiện tối ưu 37°C trong 1 giờ.
  • Giải trình tự và xử lý tin sinh học: Giải trình tự Sanger tại Macrogen Corp. (Hàn Quốc); phân tích, căn chỉnh và so khớp chuỗi nucleotide bằng phần mềm BioEdit 4.0 và công cụ BLAST (NCBI).
Tên đoạn mồi Trình tự nucleotide (5’ $\rightarrow$ 3’) Mục tiêu / Vector đích
pJET-F CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC Vector pJET1.2
pJET-R AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG Vector pJET1.2
Ubi-F CCCTGCCTTCATACGCTATT Promoter Ubiquitin (pCAM-Ubi)
Nos-R AGACCGGCAACAGGATTCAA Terminator NOS (pCAM-Ubi)
Hpt-F TATCCACGCCCTCCTACATCG Gen chọn lọc Hpt (pCAM-Ubi)
Hpt-R AGAAGAAGATGTTGGCGACC Gen chọn lọc Hpt (pCAM-Ubi)
NRAMP7-F GGATCCATGGCTCCACTCCCAGCTGC Gen OsNRAMP7 (bổ sung vị trí BamHI)
NRAMP7-R GGATCCTCAGCTGAAGGACTTGCGGA Gen OsNRAMP7 (bổ sung vị trí BamHI)
NRAMP7-t-F CGATGTCCTGAACGAGTGGC Kiểm tra nội tại gen OsNRAMP7
NRAMP7-t-R GAAGGACTTGCGGATGGTGG Kiểm tra nội tại gen OsNRAMP7

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề, mục tiêu và ý nghĩa đề tài

Chương 1 thiết lập tính cấp thiết của nghiên cứu dựa trên bối cảnh thiếu hụt vi chất kẽm và sắt trong khẩu phần ăn lấy gạo làm lương thực chính. Tác giả phân tích các hạn chế của phương pháp lai tạo truyền thống và nhấn mạnh tiềm năng của công nghệ chuyển gen trong việc biểu hiện các protein vận chuyển kim loại vi lượng. Trọng tâm của chương là xác định mục tiêu phân lập gen OsNRAMP7 từ giống lúa thương mại năng suất cao TBR225 nhằm tạo nguyên liệu di truyền phục vụ nghiên cứu chức năng gen và cải thiện hàm lượng vi chất.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Overview of Literature)

Chương 2 tổng hợp toàn diện các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về:

  • Vai trò sinh lý của vi chất dinh dưỡng (Fe, Zn, Mn) trong quá trình quang hợp, hô hấp, tổng hợp diệp lục và phân chia tế bào thực vật; tác động của thiếu hụt Zn đến sự phát triển nhận thức và hệ miễn dịch ở người.
  • Hệ thống protein vận chuyển ion kim loại NRAMP ở thực vật: cấu trúc màng, phổ vận chuyển ion đa dạng ($Fe^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Mn^{2+}$, $Cd^{2+}$) và cơ chế điều hòa mức độ biểu hiện ở các cơ quan rễ, thân, lá khi cây chịu stress dinh dưỡng.
  • Các nhóm gen và QTLs liên quan đến tính trạng tích lũy kẽm trong hạt gạo (OsNAS, OsYSL, OsZIP, OsHMA, OsFER), cùng các thành tựu của chương trình Biofortification hợp tác giữa Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), CIAT và HarvestPlus trên các giống lúa BRRI dhan 62, BRRI dhan 64, IR64, Swarna.
  • Cơ chế phân tử chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens, cấu trúc vùng T-DNA, chức năng của các protein vùng VIR và các hệ thống vector nhị thể biểu hiện thực vật.
  • Đặc tính nông học và giá trị thương phẩm của giống lúa TBR225 tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Research Materials and Methods)

Chương 3 trình bày chi tiết các nguyên vật liệu, hóa chất, chủng vi sinh vật và quy trình thao tác kỹ thuật:

  • Sử dụng thư viện cDNA tổng số từ lá lúa TBR225 xử lý Zn do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp; hệ thống vector pJET1.2/blunt (2974 bp mang gen kháng ampicillin và gen chọn lọc gây chết eco47IR) và vector biểu hiện nhị thể pCAM-Ubi (phát triển từ khung pCAMBIA1300 mang promoter Ubiquitin cấu trúc mạnh); các chủng tế bào khả biến E. coli DH5α và A. tumefaciens EHA105.
  • Thiết kế hệ thống mồi PCR đặc hiệu mang vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn BamHI ở đầu 5’ (NRAMP7-F và NRAMP7-R).
  • Quy trình chuẩn về phản ứng PCR, tinh sạch sản phẩm DNA từ gel agarose, phản ứng gắn nối T4 ligase, biến nạp vi khuẩn bằng sốc nhiệt, phản ứng colony PCR trực tiếp trên khuẩn lạc, phân tách plasmid bằng enzyme giới hạn (BamHI, BglII, HindIII, EcoRI) và phương pháp giải trình tự gen Sanger.

Chương 4: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Chương 4 thể hiện toàn bộ các số liệu thực nghiệm thu được qua các giai đoạn kỹ thuật:

  • Phân lập gen OsNRAMP7-TBR: Sử dụng cDNA làm khuôn mẫu với cặp mồi NRAMP7-F/NRAMP7-R, điện di kiểm tra cho thấy một vạch sản phẩm PCR duy nhất có kích thước ~1600 bp (tương ứng kích thước lý thuyết của khung đọc mở ORF), trong khi đối chứng âm không xuất hiện vạch.
  • Dòng hóa vào vector pJET1.2: Sản phẩm PCR tinh sạch được gắn vào pJET1.2 và biến nạp vào E. coli DH5α. Sàng lọc colony PCR với cặp mồi pJET-F/NRAMP7-t-R thu được băng kích thước ~0,4 kb. Tách chiết plasmid tái tổ hợp và kiểm chứng bằng PCR cho vạch 1,6 kb; cắt bằng enzyme BglII cho 2 vạch gồm khung vector pJET1.2 (~3,0 kb) và đoạn chèn OsNRAMP7-TBR (~1,6 kb).
  • Phân tích trình tự nucleotide: Kết quả giải trình tự khẳng định đoạn gen phân lập có chiều dài chính xác 1625 bp. So sánh bằng phần mềm BioEdit và công cụ BLAST cho thấy trình tự gen OsNRAMP7 từ giống TBR225 đạt độ tương đồng 98,3% so với trình tự chuẩn của giống lúa Nipponbare công bố trên GenBank (mã truy cập: XM_015762723).
  • Thiết kế vector biểu hiện thực vật pCAM-Ubi/OsNRAMP7-TBR: Cắt mở vòng vector pCAM-Ubi (~10,0 kb) và giải phóng đoạn gen OsNRAMP7-TBR (1,7 kb) từ plasmid pJET tái tổ hợp bằng enzyme BamHI. Sau khi xử lý khử nhóm phosphate bằng Alkaline Phosphatase để tránh vector tự đóng vòng, phản ứng nối T4 ligase được thực hiện và biến nạp vào E. coli DH5α.
  • Kiểm chứng vector biểu hiện: Chọn lọc các khuẩn lạc kháng kanamycin (50 µg/ml), sàng lọc colony PCR bằng cặp mồi NRAMP7-t-F/Nos-R thu được sản phẩm 0,4 kb. Thẩm định plasmid tinh sạch bằng các phản ứng PCR với các cặp mồi Hpt-F/Hpt-R (marker chọn lọc hygromycin), Ubi-F/NRAMP7-R (khẳng định vị trí và chiều gắn sau promoter Ubiquitin), NRAMP7-F/NRAMP7-t-R, đồng thời cắt kiểm tra bằng BamHI và cắt đôi bằng HindIII/EcoRI cho kết quả các băng DNA hoàn toàn khớp với tính toán lý thuyết.
  • Biến nạp vào chủng A. tumefaciens EHA105: Chuyển vector pCAM-Ubi/OsNRAMP7-TBR vào A. tumefaciens EHA105, sàng lọc trên môi trường chứa kháng sinh rifampicin (20 µg/ml) và khẳng định khuẩn lạc dương tính bằng colony PCR với cặp mồi Ubi-F/NRAMP7-R.

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

  • Phân lập thành công đoạn mã hóa ORF của gen OsNRAMP7 từ cDNA giống lúa TBR225 với kích thước 1625 bp.
  • Xác định trình tự nucleotide của gen OsNRAMP7-TBR, chứng minh độ tương đồng 98,3% so với trình tự gen OsNRAMP7 công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế (GenBank mã số XM_015762723).
  • Tạo dòng thành công cấu trúc trung gian pJET/OsNRAMP7-TBR trong tế bào chủ E. coli DH5α, được kiểm chứng chính xác qua hệ thống PCR và enzyme cắt giới hạn BglII.
  • Thiết kế hoàn chỉnh vector biểu hiện thực vật pCAM-Ubi/OsNRAMP7-TBR mang cấu trúc promoter cấu trúc mạnh Ubiquitin, gắn đoạn chèn tại vị trí BamHI, mang marker chọn lọc hygromycin (Hpt), được thẩm định đồng thời bằng PCR đặc hiệu, cắt enzyme giới hạn (BamHI, HindIII/EcoRI) và giải trình tự DNA.
  • Biến nạp và lưu trữ thành công cấu trúc vector biểu hiện thực vật trong chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 ở điều kiện -80°C trong dung dịch glycerol 50%.

Đóng góp học thuật và ứng dụng thực tiễn

  • Cung cấp dữ liệu trình tự gen OsNRAMP7 đặc thù của giống lúa thuần chất lượng cao TBR225 trồng phổ biến tại Việt Nam.
  • Tạo lập nguồn vật liệu sinh học phân tử chuẩn xác (vector chuyển gen nhị thể và chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang cấu trúc biểu hiện quá mức), tạo tiền đề trực tiếp cho các nghiên cứu chuyển gen vào mô sẹo lúa TBR225 nhằm đánh giá chức năng gen OsNRAMP7 trong việc tăng cường tích lũy vi chất kẽm và sắt trong hạt gạo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của đề tài: Khóa luận được thực hiện trong thời gian từ tháng 08/2022 đến tháng 12/2022 nên mới chỉ dừng lại ở phạm vi thiết kế, kiểm chứng cấu trúc vector biểu hiện tái tổ hợp và biến nạp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105; chưa tiến hành chuyển gen vào mô sẹo (callus), tái sinh cây lúa chuyển gen và phân tích biểu hiện gen trên cây hoàn chỉnh.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    1. Sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang vector pCAM-Ubi/OsNRAMP7-TBR để chuyển gen gián tiếp vào mô sẹo phôi của giống lúa TBR225.
    2. Chọn lọc mô sẹo trên môi trường bổ sung hygromycin, tái sinh cây lúa chuyển gen thế hệ $T_0$ và phân tích sự hiện diện của gen chuyển bằng kỹ thuật Southern blot và RT-qPCR.
    3. Đánh giá mức độ biểu hiện phiên mã của OsNRAMP7 và phân tích định lượng hàm lượng các ion vi lượng (Zn, Fe, Mn) tích lũy trong thân, lá và hạt gạo của các dòng lúa chuyển gen so với đối chứng không chuyển gen.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử, Di truyền học thực vật và Khoa học cây trồng.
  • Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu:
    • Quy trình thiết kế mồi PCR có bổ sung trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn phục vụ gắn định hướng vào vector biểu hiện.
    • Chiến lược sử dụng vector tạo dòng trung gian pJET1.2 (cơ chế chọn lọc dựa trên gen gây chết eco47IR) để tối ưu hóa hiệu suất dòng hóa trước khi chuyển vào vector nhị thể thực vật.
    • Quy trình xử lý khử phosphate mút 5’ của vector tiếp nhận bằng Alkaline Phosphatase nhằm loại bỏ hiện tượng tự đóng vòng trong phản ứng nối T4 ligase.
    • Phương pháp kiểm tra đa tầng đối với vector tái tổ hợp (colony PCR, PCR đa cặp mồi, cắt enzyme giới hạn đơn và đôi, giải trình tự nucleotide).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại lựa chọn gen OsNRAMP7 và giống lúa TBR225 làm đối tượng thực nghiệm?
Gen OsNRAMP7 thuộc họ protein vận chuyển kim loại NRAMP và có quan hệ di truyền gần gũi với gen vận chuyển kẽm AtNRAMP4/AtNRAMP5 ở Arabidopsis, nhưng chức năng của nó trên cây lúa chưa được làm sáng tỏ đầy đủ. Giống lúa TBR225 là giống lúa thuần chất lượng cao, năng suất tốt (70–90 tạ/ha), phạm vi thích ứng rộng tại miền Bắc Việt Nam nhưng hàm lượng vi chất trong hạt sau xay xát còn thấp, do đó việc nghiên cứu cải thiện hàm lượng vi chất trên nền di truyền của giống này mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.

2. Đoạn gen OsNRAMP7 phân lập từ giống lúa TBR225 có kích thước bao nhiêu và mức độ tương đồng như thế nào so với dữ liệu quốc tế?
Đoạn gen OsNRAMP7 phân lập từ cDNA giống lúa TBR225 có chiều dài khung đọc mở (ORF) là 1625 bp (kích thước khuếch đại điện di khoảng 1,6 kb). Kết quả giải trình tự và so khớp qua BLAST cho thấy trình tự này đạt độ tương đồng 98,3% so với trình tự chuẩn của gen OsNRAMP7 thuộc giống lúa Nipponbare được công bố trên GenBank với mã số truy cập XM_015762723.

3. Vector biểu hiện thực vật pCAM-Ubi/OsNRAMP7-TBR được cấu tạo bởi những thành phần điều hòa nào?
Vector pCAM-Ubi được phát triển trên khung vector nhị thể pCAMBIA1300. Cấu trúc biểu hiện gen đích được điều hòa phiên mã bởi promoter cấu trúc mạnh Ubiquitin (Ubi-promoter) và kết thúc phiên mã bởi trình tự Nos-terminator. Gen OsNRAMP7-TBR được chèn tại vị trí cắt của enzyme BamHI nằm giữa promoter và terminator. Vector mang gen kháng kanamycin phục vụ chọn lọc trên vi khuẩn và gen Hpt (kháng hygromycin) phục vụ chọn lọc tế bào thực vật chuyển gen.

4. Những phương pháp nào đã được tác giả sử dụng để kiểm chứng độ chính xác của vector tái tổ hợp?
Tác giả đã áp dụng 3 phương pháp kiểm chứng độc lập:

  • Kỹ thuật PCR: Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu (Hpt-F/Hpt-R, Ubi-F/NRAMP7-R, NRAMP7-F/NRAMP7-t-R) để kiểm tra marker chọn lọc, xác định sự có mặt và định hướng đúng của gen đích sau promoter Ubiquitin.
  • Cắt bằng enzyme giới hạn: Xử lý cắt đơn bằng BamHI (thu lại đoạn chèn 1,7 kb và khung vector 10,0 kb) và cắt đôi bằng HindIII/EcoRI cho các băng DNA đúng kích thước tính toán.
  • Giải trình tự nucleotide: Phân tích chuỗi mồi tiếp giáp để khẳng định gen được gắn đúng khung đọc mở và không phát sinh đột biến sai nghĩa.

5. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 được xác nhận như thế nào?
Vector pCAM-Ubi/OsNRAMP7-TBR sau khi biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens EHA105 được trải trên môi trường chọn lọc chứa kháng sinh rifampicin (20 µg/ml). Các khuẩn lạc mọc sau 2–3 ngày được kiểm tra trực tiếp bằng kỹ thuật colony PCR với cặp mồi Ubi-F/NRAMP7-R. Kết quả điện di xuất hiện băng DNA đặc hiệu xác nhận chủng vi khuẩn đã tiếp nhận chính xác vector tái tổ hợp, sau đó được bảo quản trong glycerol 50% ở -80°C.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Hoàng Minh đã phân lập thành công vùng mã hóa ORF dài 1625 bp của gen OsNRAMP7 từ giống lúa thuần chất lượng TBR225, đạt độ tương đồng 98,3% so với trình tự chuẩn trên GenBank. Tác giả đã thiết kế và thẩm định chính xác cấu trúc vector nhị thể T-DNA biểu hiện thực vật pCAM-Ubi/OsNRAMP7-TBR dưới sự điều khiển của promoter Ubiquitin thông qua hệ thống phân tích PCR, enzyme cắt giới hạn và giải trình tự DNA. Công trình đã biến nạp thành công vector biểu hiện vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105, hoàn thiện việc chuẩn bị hệ thống vật liệu sinh học phân tử phục vụ trực tiếp cho các nghiên cứu chuyển gen cải thiện hàm lượng vi chất kẽm trên giống lúa TBR225 trong giai đoạn tiếp theo.